謝 巖，任志文，趙 冬

1)新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院老干部科 新疆石河子 832008 2)新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 新疆石河子 832008

miR-125b在頸動(dòng)脈粥樣硬化患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的影響*

謝 巖1)，任志文2)#，趙 冬2)

1)新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院老干部科 新疆石河子 832008 2)新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 新疆石河子 832008

#通信作者，男，1978年8月生，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)外科疾病，E-mail：9594986@qq.com

動(dòng)脈粥樣硬化；miR-125b；平滑肌細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移

目的：探討miR-125b在頸動(dòng)脈粥樣硬化(AS)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的影響。方法：選取85例頸AS患者(不穩(wěn)定性斑塊39例，穩(wěn)定性斑塊46例)和45例健康者(對(duì)照組)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-125b的表達(dá)。培養(yǎng)人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染miR-125b 模擬物、miR-125b抑制物、miR-125b陰性對(duì)照，以不作任何處理的細(xì)胞為空白對(duì)照組，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-125b的表達(dá)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。結(jié)果：與對(duì)照組相比，AS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-125b相對(duì)表達(dá)量降低，且不穩(wěn)定性斑塊患者低于穩(wěn)定性斑塊患者(P<0.05)。miR-125b模擬物組細(xì)胞中miR-125b相對(duì)表達(dá)量顯著高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，且miR-125b抑制物組低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)；miR-125b模擬物組細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞遷移數(shù)顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，而miR-125b抑制物組則高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論：miR-125b可能通過抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移而發(fā)揮保護(hù)動(dòng)脈的作用。

近年來，隨著人們生活方式的改變，動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，由此而導(dǎo)致的心腦血管疾病已成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問題[1]。AS發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，是血液成分、局部血流、血管細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、環(huán)境和遺傳等眾多因素相互作用的結(jié)果[2]，其中，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、平滑肌細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)是AS形成中的重要因素[3]。微小RNA(miRNA)作為一種內(nèi)源性高度保守的短小RNA，已被證實(shí)參與了多種生理及病理過程[4]。有研究[5]指出，miRNA參與了AS的發(fā)生及進(jìn)展，在調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞增殖、內(nèi)皮細(xì)胞功能及血細(xì)胞聚集中發(fā)揮重要作用。miR-125b作為miRNA的重要類型，主要表達(dá)于動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中，可能參與了血管功能的調(diào)控[6]。該研究對(duì)miR-125b在頸AS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行了分析，并且探討其對(duì)體外培養(yǎng)的主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移能力的影響，以期為AS機(jī)制研究提供基礎(chǔ)資料。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年3月至2015年3月在新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院住院的頸AS患者85例，男性56例，女性29例，年齡55～81(68.3±9.1)歲，患者血脂均升高，彩色多普勒超聲檢查顯示AS斑塊形成。排除重要臟器嚴(yán)重功能障礙者、腫瘤患者。同期，從體檢中心選取健康者45例作為對(duì)照，男性31例，女性14例，年齡55～79(67.9±8.8)歲，排除糖尿病、高血壓等慢性病患者、腫瘤患者、重要臟器嚴(yán)重功能障礙者，均行彩色多普勒超聲檢查排除AS。該研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均知情同意。收集所有研究對(duì)象的年齡，性別，血壓，體重指數(shù)，空腹血糖(FBG)，血脂(TC、TG、HDL-C、LDL-C)，尿酸等一般資料。根據(jù)頸動(dòng)脈彩色多普勒超聲檢測(cè)[7]結(jié)果，將AS患者分為穩(wěn)定性斑塊組和不穩(wěn)定性斑塊組。其中，穩(wěn)定性斑塊組46例，男性34例，女性12例，年齡55～78(68.1±8.9)歲；不穩(wěn)定性斑塊組39例，男性22例，女性17例，年齡55～79(68.7±9.3)歲。

1.2 主要試劑及儀器 人淋巴細(xì)胞分離液購自美國Sigma公司，Trizol總RNA提取試劑盒、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒均購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司，miR-125b及內(nèi)參U6引物序列、miR-125b模擬物、miR-125b抑制物和陰性對(duì)照均由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞購自ATCC細(xì)胞庫，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及胰酶均購自美國Gibco公司，MTT、DMSO均購自武漢博士德生物公司，Transwell小室購自美國BD公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-125b的表達(dá) 所有研究對(duì)象均晨起抽取空腹靜脈血10 mL，抗凝后加入人淋巴細(xì)胞分離液，利用密度梯度離心法對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行分離，洗滌、提純，計(jì)數(shù)細(xì)胞，加入臺(tái)盼藍(lán)對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行測(cè)定，以細(xì)胞活力>95%為合格，將細(xì)胞保存于-80 ℃冰箱。取單個(gè)核細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液裂解，用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR。miR-125b引物序列上游：5’-GGGTCCCTGAGACCCTAACTTGT-3’，下游：5’-GCT GTCAACATACGCTAGGTA-3’；內(nèi)參U6引物序列上游：5’-TCAGTTTGCTGTTCTGGGTG-3’，下游：5’-CG GTTGGCTGGAAAGGAG-3’。反應(yīng)體系：10×擴(kuò)增緩沖液10 μL，dNTP混合物各200 μmol/L，引物各20 pmol，模板DNA 0.5 μg，Taq DNA聚合酶2.5 μL，Mg2+1.5 mmol/L，加雙蒸水至100 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 60 s，92 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，76 ℃ 30 s，連續(xù)進(jìn)行42個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔。用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-125b的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)及處理 用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到75%以上時(shí)，胰酶消化，傳代培養(yǎng)。調(diào)整細(xì)胞密度，接種于6孔板中(3×105/孔)，培養(yǎng)24 h，利用Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，根據(jù)轉(zhuǎn)染物不同分為：空白對(duì)照組(不作任何處理)，miR-125b 模擬物組(轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物5’-UCCCU GAGACCCUAACUUGUGA-3’)，miR-125b抑制物組(轉(zhuǎn)染miR-125b抑制物5’-TCACAAGTTAGGGTCT CAGGGA-3’)，陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染miR-125b陰性對(duì)照序列5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-125b的表達(dá) 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h，加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，其余步驟同1.3。

1.6 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性 轉(zhuǎn)染48 h后，取各組細(xì)胞，胰酶消化，用完全培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清)稀釋成細(xì)胞懸液，接種于96孔板中(5×103/孔)，每孔終體積200 μL，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)液，洗滌3次，加入MTT液20 μL，避光培養(yǎng)4 h，加入DMSO 150 μL，在搖床上搖動(dòng)10 min，上酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)定吸光度(A)值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。細(xì)胞增殖抑制率=(A實(shí)驗(yàn)-A空白)/(A對(duì)照-A空白)×100%。

1.7 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力 轉(zhuǎn)染48 h后，取各組細(xì)胞，胰酶消化。取Transwell小室置于無菌24孔板中，將細(xì)胞加入上室(1×103/室)，將含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液加入下室，置于恒溫箱中培養(yǎng)24 h，用多聚甲醛對(duì)小室膜上細(xì)胞進(jìn)行固定，用結(jié)晶紫染色2 min，于高倍鏡(×400)下觀察，隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)比較對(duì)照組、AS穩(wěn)定性斑塊組和不穩(wěn)定性斑塊組一般資料及外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-125b表達(dá)的差異。采用單因素方差分析比較各組細(xì)胞miR-125b表達(dá)、增殖抑制率和穿膜細(xì)胞數(shù)的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組、穩(wěn)定性斑塊組和不穩(wěn)定性斑塊組一般資料及外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-125b表達(dá)的比較 結(jié)果見表1。

表1 對(duì)照組、穩(wěn)定性斑塊組和不穩(wěn)定性斑塊組一般資料及外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-125b表達(dá)比較

1 mmHg=0.133 kPa；*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與穩(wěn)定性斑塊組比較，P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞中miR-125b表達(dá)的比較 miR-125b模擬物組細(xì)胞中miR-125b相對(duì)表達(dá)量高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，miR-125b抑制物組低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，見表2。

2.3 各組細(xì)胞增殖抑制率的比較 miR-125b模擬物組細(xì)胞增殖抑制率低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，miR-125b抑制物組高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，見表2。

2.4 各組細(xì)胞遷移能力比較 結(jié)果見表2和圖1。

表2 各組細(xì)胞中miR-125b相對(duì)表達(dá)量、細(xì)胞增殖抑制率及穿膜細(xì)胞數(shù)比較(n=3)

*：與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，P<0.05；#：與miR-125b抑制物組相比，P<0.05。

A：miR-125b模擬物組；B：miR-125b抑制物組；C：陰性對(duì)照組；D：空白對(duì)照組。圖1 各組細(xì)胞遷移情況

3 討論

AS作為多種心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ)，病因多樣，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎癥激活、平滑肌細(xì)胞增殖及遷移等多個(gè)病理過程[7]。有研究[8]指出，血管平滑肌細(xì)胞異常增殖、遷移在促進(jìn)AS發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。miRNA作為廣泛存在生物體內(nèi)的保守的短小RNA，可調(diào)控多種細(xì)胞增殖、分化及凋亡過程[9]。研究[10]表明，在損傷后的血管平滑肌中miR-125b表達(dá)顯著下調(diào)。劉現(xiàn)梅等[11]指出，同型半胱氨酸通過促進(jìn)miR-125b甲基化而促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖。外周血單個(gè)核細(xì)胞廣泛存在于人體，在炎癥反應(yīng)、免疫功能方面發(fā)揮重要作用，可真實(shí)地反映機(jī)體的免疫狀況。考慮到炎癥反應(yīng)參與了AS的發(fā)生及進(jìn)展過程[12]，該研究對(duì)頸AS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-125b表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，miR-125b在頸AS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，且不穩(wěn)定性斑塊組低于穩(wěn)定性斑塊組，說明頸AS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-125b表達(dá)下調(diào)，且與斑塊性質(zhì)有關(guān)，提示miR-125b可能參與了頸AS的進(jìn)展過程。

為進(jìn)一步探討miR-125b參與AS發(fā)生的可能機(jī)制，作者分別對(duì)人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-125b模擬物、miR-125b抑制物和陰性對(duì)照，結(jié)果顯示，miR-125b模擬物組細(xì)胞中miR-125b相對(duì)表達(dá)量高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，且miR-125b抑制物組低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組；miR-125b模擬物組細(xì)胞增殖抑制率顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，而miR-125b抑制物組高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，說明特異性上調(diào)miR-125b可顯著抑制人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖，而下調(diào)miR-125b則可促進(jìn)細(xì)胞增殖，提示miR-125b可能參與了人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖過程。有研究[13]指出，血管平滑肌細(xì)胞增殖在血管新生內(nèi)膜形成中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，提示miR-125b可能通過調(diào)控血管平滑肌增殖而參與血管相關(guān)生理病理過程。作者在該研究中還發(fā)現(xiàn)，miR-125b模擬物組細(xì)胞遷移能力顯著降低而miR-125b抑制物組則升高，說明上調(diào)miR-125b可抑制血管平滑肌細(xì)胞遷移，而下調(diào)其表達(dá)則可促進(jìn)細(xì)胞遷移，提示上調(diào)miR-125b可能通過抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移而發(fā)揮抗AS的作用。

綜上所述，miR-125b在頸AS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中呈低表達(dá)，且與斑塊穩(wěn)定性有關(guān)，miR-125b可能通過抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移而發(fā)揮保護(hù)動(dòng)脈的作用，從而減少AS的發(fā)生。miR-125b有望成為AS診斷和臨床治療的新靶位。

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(2016-08-30收稿 責(zé)任編輯李沛寰)

Expression of miR-125b in peripheral blood mononuclear cells of patients with atherosclerosis and its effects on proliferation and migration of smooth muscle cells

XIEYan1),RENZhiwen2),ZHAODong2)

1)DepartmentofVeteranCadres,theFirstAffiliatedHospital,MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832008 2)DepartmentofNeurosurgery,theFirstAffiliatedHospital,MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832008

atherosclerosis;miR-125b;smooth muscle cell;cell proliferation;cell migration

Aim: To investigate the expressions of miR-125b in peripheral blood mononuclear cells in patients with atherosclerosis(AS) and its effect on smooth muscle cells. Methods: A total of 85 patients with carotid AS and 45 healthy individuals(control group) were selected. The expression of miR-125b in peripheral blood mononuclear cells were detected by real-time quantitative PCR. The human vascular smooth muscle cells were cultured and were transfected with miR-125b mimics, miR-125b inhibitor, miR-125b negative control, respectively, and cells without any treatment were the blank control group. The expression of miR-125b in the above 4 groups was detected by real-time quantitative PCR, the cell proliferation activity was detected by MTT assay, and the cell migration was detected by transwell cell migration assay. Results: Compared with the control group, the relative expression level of miR-125b in peripheral blood mononuclear cells of AS group was decreased, and which was lower in the unstable plaques patients than that in the stable plaque patients(P<0.05). The relative expression level of miR-125b in miR-125b mimics group was significantly higher than those in the miR-125b inhibitor group, negative control group and blank control group, and that in the miR-125b inhibitor group was lower than those in the negative control group and the blank control group(P<0.05). The cell proliferation inhibition rate and the number of migration cells in miR-125b mimics group were significantly lower than those in the other 3 groups, while those in miR-125b inhibitor group were higher than those in the negative blank control group and the blank control group(P<0.05). Conclusion: The expressions of miR-125b in peripheral blood mononuclear cells in carotid AS patients is low, and is related with the plaque stability. miR-125b has protective effects against AS through inhibit the proliferation and migration of vascular smooth muscle cells.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.013

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 81360185

R543.4