翁麗萍，趙 蕓，張 樂，王宏海

UPLC和Q-Exactive高分辨質(zhì)譜儀聯(lián)用鑒定大黃魚中的甘油三酯分子組成

翁麗萍1，趙 蕓1，張 樂1，王宏海2,*

（1.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024；2.浙江工商大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 杭州 310018）

應(yīng)用超高效液相色譜和電噴霧/四極桿 -靜電場(chǎng)軌道阱的質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，分析大黃魚脂肪中甘油三酯的組成。采用Hypersil Gold C18柱（150 mm×4.6 mm，2.1 μm），流動(dòng)相為82%甲醇（含0.1%甲酸）溶液和18%異丙醇溶液，混合后添加0.05%乙酸銨溶液，以等度洗脫方式分離大黃魚脂肪中的甘油三酯組分，柱后流出液采用電噴霧離子源，以正離子模式采集一級(jí)質(zhì)譜分子離子和二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子信息，然后與Lipidblast數(shù)據(jù)庫(kù)中甘油三酯信息進(jìn)行比對(duì)。研究結(jié)果顯示，超高效液相色譜和Q-Exactive高分辨質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)快速、準(zhǔn)確鑒定出大黃魚脂質(zhì)中含有28 種甘油三酯。PoOL、PoSO、PPO、PPoO、PSO、MPO、POL、PoSA 8 種甘油三酯占總量的87.87%以上，其中PoOL（C16:1、C18:1、C18:2）相對(duì)含量最豐富，占35.261%。

大黃魚；脂質(zhì)；脂肪酸；甘油三酯；電噴霧離子源

大黃魚（Pseudosciaena crocea）屬鱸形目，石首魚科，俗稱黃花魚，是我國(guó)養(yǎng)殖規(guī)模最大的海水魚類，因肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美、金鱗朱唇、體形優(yōu)美而深受消費(fèi)者的青睞[1]。水產(chǎn)品肌肉的脂肪組織主要是中性脂質(zhì)，其中90%以上是甘油三酯（triacylglycerols，TAGs）[2]?，F(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)醫(yī)學(xué)研究表明，脂質(zhì)對(duì)心血管疾病的形成具有重要影響，并且TAGs酰化位置的不同，脂質(zhì)的吸收代謝會(huì)有很大差異，會(huì)影響脂質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)和應(yīng)用價(jià)值，比如高含量二十碳五烯酸/二十二碳六烯酸（eicosapentaenoic acid/ docosahexenoic acid，EPA/DHA）具有改善脂質(zhì)代謝和胰島素抵抗的作用[3]。吳芮等[4]的研究還表明甘油三酯和中華絨螯蟹中關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成有關(guān)。但是目前關(guān)于甘油三酯結(jié)構(gòu)的研究主要集中在植物油脂[5-7]，對(duì)大黃魚脂質(zhì)的研究主要集中在甘油三酯含量變化和脂肪酸組成的影響[8-9]，甚至海洋生物也僅有少數(shù)關(guān)于南極磷蝦油和海洋微藻中甘油三酯結(jié)構(gòu)的研究[10-11]。

電噴霧離子源串聯(lián)質(zhì)譜在脂質(zhì)組學(xué)應(yīng)用中具有樣品前處理簡(jiǎn)單，所需樣品量少、速度快、靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)的高通量分析的優(yōu)點(diǎn)[12]。Han Xianlin等[13]提出了電噴霧離子化分析脂質(zhì)的方法，隨后，Cheng Changfu[14]和Kalo[15]等對(duì)TAGs在電噴霧離子源串聯(lián)質(zhì)譜中的碎裂機(jī)理進(jìn)行了詳細(xì)的研究，發(fā)現(xiàn)存在[M+NH4－Rn－COONH4]+、[RnCO+128]+、[RnCO+74]+、[RnCO]+四種碎片離子。此后，Yang Kui[12]、Hsu[16]、李雙[17]等利用該技術(shù)進(jìn)行不同樣品中TAGs分子結(jié)構(gòu)的鑒定。為了解大黃魚肌肉中脂質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)和營(yíng)養(yǎng)，本實(shí)驗(yàn)采用Q-Exactive四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀中的一級(jí)掃描（MS1）和數(shù)據(jù)依賴性二級(jí)質(zhì)譜掃描（dd-MS2）模式對(duì)大黃魚肌肉脂肪中中性脂質(zhì)分子組成進(jìn)行分析，建立大黃魚中甘油三酯分子組成的快速分析方法。同時(shí)，采用氣相色譜-質(zhì)譜來(lái)分析大黃魚中脂肪酸的組成，進(jìn)一步驗(yàn)證了電噴霧離子源和軌道阱串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析甘油三酯的準(zhǔn)確性，完善了大黃魚中脂質(zhì)組成的數(shù)據(jù)，同時(shí)為水產(chǎn)品中脂質(zhì)組成的研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

冰凍深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚，購(gòu)于溫州市水產(chǎn)供銷公司水產(chǎn)精品商場(chǎng)，平均體長(zhǎng)25～30 cm，平均體質(zhì)量250～300 g，體態(tài)完好，魚體新鮮。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-QQQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫公司；Q-Exactive四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo公司；Eppendorf 5810R高速臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)艾本德公司；Hei-VAP Precision真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)Heidolph公司；N-EVAP 112氮吹儀 美國(guó)Organomation公司。

1.3 方法

1.3.1 脂質(zhì)提取

將大黃魚魚肉絞碎，精確稱取一定量處理好的樣品，按Folch等[18]的方法，用氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液溶液提取。在真空條件下，提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行干燥，含量以g/100 g樣品表示。

1.3.2 中性脂質(zhì)分離

參照Kaluzny等[19]的方法，稱取100 mg提取脂質(zhì)，用1 mL氯仿復(fù)溶，然后經(jīng)SPE硅膠小柱分離。首先用3 mL的正己烷活化SPE硅膠小柱，在1 mL/min流速條件下，用3 mL氯仿-異丙醇（2∶1，V/V）溶液洗脫中性脂質(zhì)，在氮?dú)獯蹈桑胖茫?0 ℃冰箱中保存。

1.3.3 脂肪酸樣品的甲酯化

取1.3.2節(jié)處理所得甘油酯樣品100 mg于10 mL的玻璃試管中，加入1 mL 0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液，用渦旋混勻器混勻后在60 ℃水浴中加熱20 min直至油珠完全溶解，取出冷卻至室溫后，加入1 mL 15%三氟化硼-甲醇溶液在60 ℃水浴中酯化20 min，取出冷卻后，加入3 mL正己烷溶液，充分混勻，靜置片刻后取上層正己烷溶液，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，氮?dú)獯蹈扇軇?，用正己烷定容，?0 ℃冰箱中保存，待氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析測(cè)定。

1.3.4 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀條件

氣相色譜條件：TR-5MS色譜柱（30 m×0.2 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣量1.0 μL；分流比100∶1；進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：40 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至150 ℃保持2 min，以10 ℃/min升至220 ℃，之后以5 ℃/min升至280 ℃，保持3 min；氦氣作為載氣，流速1.0 mL/min。

質(zhì)譜條件：離子源溫度230 ℃；電子電離源；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍是35～450 u；脂肪酸組成以峰面積歸一法計(jì)算相對(duì)含量。

1.3.5 甘油酯超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的測(cè)定

1.3.5.1 樣品的制備

取1.3.2節(jié)處理所得甘油酯樣品50 mg于干凈的玻璃試管中，加入2 mL丙酮溶液，然后再加入2 mL流動(dòng)相（82%甲醇（含0.1%甲酸）溶液和18%異丙醇溶液，混合后添加0.05%乙酸銨溶液），待測(cè)。

1.3.5.2 液相色譜參數(shù)

色譜柱：Hypersil Gold C18（150 mm×4.6 mm，2.1 μm）；采用等度洗脫方式，流動(dòng)相：82%甲醇（含0.1%甲酸）溶液和18%異丙醇溶液，混合后添加0.05%乙酸銨溶液，分離時(shí)間18 min；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；柱溫30 ℃。

1.3.5.3 質(zhì)譜參數(shù)

四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜條件：鞘氣流速35 arb，輔助氣流速10 arb，噴霧電壓3.0 kV，毛細(xì)管溫度320 ℃，加熱器溫度250 ℃，全掃描條件（MS1）：分辨率70 000，質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1 000；二級(jí)掃描條件（dd-MS2）：分辨率17 500，碎裂離子選擇Top 5，歸一化碰撞能量12 eV；電離源為電噴霧離子源，采用正離子模式采集數(shù)據(jù)，采集時(shí)間為18 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

Lipidblast是一個(gè)通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬和實(shí)際實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)合的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，包含約200 000 個(gè)二級(jí)質(zhì)譜[20]。先將通過(guò)Q-Exactive獲得的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)Raw格式轉(zhuǎn)換成mgf格式，然后用NIST-MS-GUI進(jìn)行搜索匹配。母離子參數(shù)設(shè)置為0.4 D，子離子參數(shù)設(shè)置為0.8 D。Lipidblast搜索結(jié)果中Reverse dot product代表著實(shí)驗(yàn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)和Lipidblast數(shù)據(jù)庫(kù)的匹配程度，得分在400以上的定性結(jié)果，被認(rèn)為是可信的。

2 結(jié)果與分析

2.1 大黃魚的總脂含量和脂肪酸組成

表 1 大黃魚甘油三酯的脂肪酸組成Table 1 Fatty acid composition of TAGs in Pseudosciaena crocea lipids

采用1.3.1節(jié)脂肪的提取方法，測(cè)得大黃魚中脂肪含量平均值為（8.41±0.02）g/100 g。取1.3.3節(jié)方法的甲酯化樣品，采用1.3.4節(jié)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法對(duì)脂質(zhì)樣品的脂肪酸組成進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)采用C4～C24不同碳鏈長(zhǎng)度的37 種脂肪酸甲酯作對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步驗(yàn)證鑒定準(zhǔn)確性，對(duì)樣品中的脂肪酸進(jìn)行定性，以峰面積歸一化法計(jì)算每種脂肪酸的相對(duì)含量，結(jié)果見表1。大黃魚脂肪中最主要的脂肪酸為C16:0、C16:1、C18:1、C18:0、C18:2、C18:3和C22:6，其中棕櫚油酸C16:1大量存在于海產(chǎn)油脂中，大黃魚中性脂質(zhì)中還含有C20:5（EPA）和C22:6（DHA）等多不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸總量達(dá)到53.98%，脂肪酸種類、含量與文獻(xiàn)[21-22]測(cè)定結(jié)果一致。

2.2 大黃魚中甘油三酯的組成

通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜掃描的方法，得到了大量的二級(jí)質(zhì)譜信息，如圖1所示。一般的定性方法是通過(guò)這些二級(jí)質(zhì)譜信息來(lái)搜索儀器自帶的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，例如LMSD、LipidBank、LIPIDAT等，但是這些數(shù)據(jù)庫(kù)所含有的二級(jí)質(zhì)譜信息不是很全面，通過(guò)搜索這些數(shù)據(jù)庫(kù)無(wú)法得到全面的定性結(jié)果。本研究中首先采用Lipidblast數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行甘油三酯的定性分析，然后逐一評(píng)估Lipidblast數(shù)據(jù)庫(kù)定性的結(jié)果，提高鑒定的準(zhǔn)確性。采用Alarm等[23]方法，即流動(dòng)相為82%甲醇（含0.1%甲酸）溶液和18%異丙醇溶液，混合后添加0.05%乙酸銨溶液，采用等度洗脫使得大黃魚肉中中性脂質(zhì)在C18柱中得到了很好的預(yù)分離，見圖1A。在Q-Exactive系統(tǒng)中，本實(shí)驗(yàn)中全掃描模式下獲得質(zhì)譜圖是混合物中[M+NH4]的加合物離子，范圍在760～1 030 D，如圖1B所示。部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和Lipidblast數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)果，如圖2所示。

圖 1 大黃魚甘油三酯在正離子全掃描模式下總離子流圖（A）和質(zhì)譜圖（B）Fig. 1 TIC chromatogram (A) and full scan mass spectrum (B) under the positive mode of TAGs Pseudosciaena crocea in lipids

一般情況下，甘油三酯的質(zhì)譜圖中同時(shí)存在信號(hào)強(qiáng)度較大的分子離子峰[M+1]或[M+NH4]和分子失去1 個(gè)脂肪酸的碎片離子峰[M+1－SN-1脂肪酸]。當(dāng)甘油三酯含2 種或3 種脂肪酸時(shí)，可失去2 種或3 種脂肪酸，因此可同時(shí)存在2 種或3 種[M+1－脂肪酸]的碎片離子峰。如保留時(shí)間為11.71 min的色譜峰的質(zhì)譜圖顯示分別存在4 種碎片離子866.82 [M+NH4]、593.56 [M+1－SN-1]、565.52 [M+1－SN-2]和579.54 [M+1－SN-3]，可以確定為PMaS（C16:0、C17:0、C18:0）。又如POL即棕櫚酸亞油酸油酸甘油酯，因棕櫚酸、亞油酸或油酸均可能失去，所以可能有[M+NH4]為874.79，[M+1－棕櫚酸]為601.5，[M+1－油酸]為575.5，[M+1－亞油酸]為577.5等碎片信號(hào)。其中保留時(shí)間為7.94 min的化合物的質(zhì)譜圖中，存在質(zhì)量數(shù)為874.79、601.52、575.51和577.52四個(gè)強(qiáng)峰，子離子來(lái)源于分別失去P、O、L，即得601為L(zhǎng)O，575為PL。Mottram等[24]研究了在化學(xué)電離條件下[M+H]的前級(jí)離子分離所產(chǎn)生的甘油二酯離子及脂肪酸的位置。根據(jù)SN-1（3）位的脂肪酸比SN-2位的容易丟失，所以研究表明在含有A、B離子的情況下，AAB比ABA更有可能，而AC在ABC中是最不可能出現(xiàn)的。大量實(shí)驗(yàn)表明：根據(jù)碎片離子強(qiáng)度和離子比率可以用作確定碎片位置[25-27]。因此根據(jù)不同SN位脂肪酸丟失的難易，保留時(shí)間為7.94 min的化合物可確定為PLO，棕櫚酸亞油酸油酸甘油酯。因此由上述質(zhì)譜碎片信號(hào)可對(duì)甘油三酯進(jìn)行鑒定，測(cè)定結(jié)果見表2。

圖 2 2 種大黃魚甘油三酯在正離子模式下的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)與Lipidblast數(shù)據(jù)庫(kù)的匹配Fig. 2 Annotation of two TAGs in Pseudosciaena crocea lipids by matching experimental dd-MS2data acquired under positive modes with the Lipidblast library

表 2 Lipidblast定性分析大黃魚甘油三酯Table 2 Identified TAGs in Pseudosciaena crocea lipids by Lipidblast

甘油三酯中脂肪酸鏈的長(zhǎng)度、不飽和度、甘油?；奈恢貌煌瑢?dǎo)致甘油三酯具有不同的生理功能。如棕櫚酸（C16:0）在SN-2位能促進(jìn)人體對(duì)脂肪酸的吸收[28]；高含量的DHA/EPA甘油三酯型魚油能顯著抑制肝臟脂肪合成和促進(jìn)β-氧化兩方面來(lái)改善脂肪肝[3]。最新研究表明通過(guò)干預(yù)人體攝入不同結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)可以改變血清中脂質(zhì)組學(xué)輪廓，從而影響心血管病的發(fā)展[29-30]。因此研究水產(chǎn)品脂質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)，了解其功能，在營(yíng)養(yǎng)研究和脂質(zhì)代謝相關(guān)疾病的治療中具有積極的作用。

3 結(jié) 論

本研究基于電噴霧離子源全自動(dòng)噴霧進(jìn)樣聯(lián)用超高效液相色譜和Q-Exactive四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀快速分析大黃魚中性脂質(zhì)分子組成，利用Lipidblast數(shù)據(jù)庫(kù)快速準(zhǔn)確定性出甘油三酯分子組成。共有28 種甘油三酯得到鑒定，其中相對(duì)含量大于3%的有PoOL、PoSO、PPO、PPoO、PSO、MPO、POL、PoSA，8 種甘油三酯占總量的87.87%以上，其中PoOL（C16:1、C18:1、C18:2）相對(duì)含量最豐富，占35.261%。采用此方法能快速、有效地解決水產(chǎn)品中甘油三酯的鑒定分析，為水產(chǎn)品脂肪的指紋圖譜提供了定性依據(jù)。

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Identification of Triacylglycerols in the Lipids of Pseudosciaena crocea by UPLC and Q-Exactive High-Resolution Mass Spectrometer

WENG Liping1, ZHAO Yun1, ZHANG Le1, WANG Honghai2,*
(1. Hangzhou Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310024, China; 2. School of Environmental Science and Engineering, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310018, Ch ina)

The triglyceride composition of Pseudosciaena crocea lipids was analyzed by ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization/quadrupole/electrostatic field orbit trap high resolution mass spectrometry (UPLCESI/Orbitrap-MS). The chromatographic separation was performed on a Hy persil Gold C18column (150 mm × 4.6 mm, 2.1 μm) using a mobile phase consisting of methanol (including 0.1% formic acid)-isopropyl alcohol (82:18, V/V) and 0.05% ammonium acetate. The analytes were detected by ESI/Orbitrap-MS in the positive ion mode to obtain mass and tandem mass spectra together and then the results obtained were compared with those from the Lipidblast database. A total of 28 triacylglycerols were identified by UPLC-ESI/Orbitrap-MS). Among these, PoOL was the most abundant (35.261%), and PoOL, PoSO, PPO, PPoO, PSO, MPO, POL and PoSA together accounted for 87.87% of the total triacylglycerols.

Pseudosciaena crocea; lipid; fatty acid; triacylglycerols; electrospray ionization

10.7506/spkx1002-6630-201710030

S912

A

1002-6630（2017）10-0178-05

翁麗萍, 趙蕓, 張樂, 等. UPLC和Q-Exactive高分辨質(zhì)譜儀聯(lián)用鑒定大黃魚中的甘油三酯分子組成[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(10): 178-182. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710030. http://www.spkx.net.cn

WENG Liping, ZHAO Yun, ZHANG Le, et al. Identification of triacylglycerols in the lipids of Pseudosciaena crocea by UPLC and Q-exactive high-resolution mass spectrometer[J]. Food Science, 2017, 38(10): 178-182. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201710030.http://www.spkx.net.cn

2016-08-17

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31301463）

翁麗萍（1981—），女，高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：lipingweng@163.com

*通信作者：王宏海（1976—），男，高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：wanghh1@163.com