蔣雪薇，岳希潔，陳代文，周志明，羅曉明,*，葉 菁，李曉文

產(chǎn)朊假絲酵母核酸高產(chǎn)株的選育及其發(fā)酵性能研究

蔣雪薇1，岳希潔1，陳代文2，周志明2，羅曉明1,*，葉 菁1，李曉文1

（1.長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410004；2.連南瑤族自治縣奇鄉(xiāng)生物科技有限公司，廣東 清遠 513300）

為了獲得一株發(fā)酵性能優(yōu)良的高核酸酵母，以產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）CL1501為出發(fā)菌株，采用紫外-亞硝基胍復(fù)合誘變，篩選獲得一株高核酸含量的突變株CL15013，經(jīng)測定其核酸含量占菌體干質(zhì)量的16.8%，高于出發(fā)菌47.8%。對比研究其流加及分批培養(yǎng)工藝，流加培養(yǎng)細胞收獲量為16.9 g/L，比分批培養(yǎng)提高94.3%；正交試驗設(shè)計優(yōu)化流加培養(yǎng)條件后，CL15013的收獲量達21.3 g/L，比分批培養(yǎng)提高144.8%，具有良好的生產(chǎn)應(yīng)用潛力。

產(chǎn)朊假絲酵母；復(fù)合誘變；核酸；流加培養(yǎng)

高核酸酵母是指一類核糖核酸、蛋白質(zhì)含量相對較高的食用酵母，常用于生產(chǎn)高品質(zhì)的酵母抽提物，特別是高核酸酵母抽提物[1-2]。高核酸酵母抽提物是采用生物技術(shù)，將高核酸酵母細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等進行降解后精制而成的天然調(diào)味料。酵母抽提物的主要成分為多肽、氨基酸、呈味核苷酸、B族維生素及微量元素等，具有純天然、營養(yǎng)豐富、味道鮮美醇厚等優(yōu)點，已在食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用[3-6]。

我國是酵母生產(chǎn)大國之一，酵母工業(yè)也成為我國食品發(fā)酵工程領(lǐng)域的核心支柱產(chǎn)業(yè)之一[7]。近10年，我國酵母平均年增長率一直保持在10%～20%。隨著食品加工業(yè)的發(fā)展，基于酵母產(chǎn)業(yè)發(fā)展的酵母抽提物產(chǎn)業(yè)平均年增長率20%以上。我國酵母產(chǎn)業(yè)規(guī)模雖然較大，但主要存在著兩個問題，一是高核酸酵母培養(yǎng)的細胞收獲量不高，目前國內(nèi)的細胞收獲量水平為15～18 g/L[8]，而國外利用高密度培養(yǎng)技術(shù)可獲得50.4 g/L的細胞收獲量[9]；二是高核酸酵母抽提物的I+G含量不高，除少數(shù)大企業(yè)能達到18%的世界先進水平外，多數(shù)企業(yè)僅為12%～16%[10-11]。其主要原因是由于國內(nèi)生產(chǎn)菌種性能及抽提工藝與發(fā)達國家還有較大差距[12-14]。范云峰[15]在研究高核酸酵母生產(chǎn)技術(shù)時發(fā)現(xiàn)制備高質(zhì)量的核酸酵母搖瓶菌種是提高產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的前提。王媛媛等[8]發(fā)現(xiàn)延長高核酸酵母生長的對數(shù)期，有利于提高其細胞收獲量，菌體干質(zhì)量可達15.4 g/L?？梢钥闯?，提高核酸酵母細胞收獲量及核酸含量是非常重要的，而菌種選育及發(fā)酵條件優(yōu)化是提高上述指標的有效途徑。本研究以產(chǎn)朊假絲酵母CL1501為出發(fā)菌株，采用理化結(jié)合的復(fù)合誘變方法，選育出高核酸含量的突變株，研究并優(yōu)化其培養(yǎng)方法，獲得較高細胞收獲量的高核酸酵母，為生產(chǎn)應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

產(chǎn)朊假絲酵母Candida utilis CL1501，長沙理工大學(xué)食品與發(fā)酵研究所分離并保藏。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

亞硝基胍（nitrosoguanidine，NTG） 中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司；葡萄糖、酵母膏、Na2S2O3、K2HPO4、MgSO4、FeSO4、ZnSO4、NaCl 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；玉米漿 上海方畦儀器有限公司。

分離純化培養(yǎng)基：麥芽汁培養(yǎng)基；初篩培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L、玉米漿15 g/L、K2HPO43 g/L、MgSO41.2 g/L、pH 6.5；復(fù)篩及發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L、酵母膏10 g/L、玉米漿10 g/L、K2HPO43 g/L、MgSO41.2 g/L、FeSO41.2 g/L、ZnSO41.0 g/L、pH 6.5；流加碳源為200 g/L葡萄糖溶液；流加氮源為200 mL/L玉米漿溶液。以上培養(yǎng)基均采用121 ℃、20 min濕熱滅菌。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1800紫外-可見分光光度計 日本島津公司；HZQ-X300C恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；FE28酸度計 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

將CL1501培養(yǎng)至對數(shù)期，無菌生理鹽水離心洗滌3 次，制成108CFU/mL的菌懸液備用。

1.3.2 培養(yǎng)方法

分批培養(yǎng)：將菌懸液接種于裝有100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，接種量為體積分數(shù)5%，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)18 h。

流加培養(yǎng)：將菌懸液接種于裝有100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，接種量為體積分數(shù)5%，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)26 h，期間每隔4 h分別流加葡萄糖溶液4 mL、玉米漿溶液4 mL，Na2CO3-NaHCO3溶液（pH 9）調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值至6。

1.3.3 生長曲線的測定

將菌種接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，2 8 ℃、200 r/min，每間隔2 h取樣測細胞收獲量，并繪制CL1501的生長曲線。

1.3.4 紫外誘變致死率曲線的測定

取10 mL菌懸液于無菌皿中，攪拌狀態(tài)下，進行不同劑量的紫外照射[16]，紫外照射條件：紫外燈15 W、垂直照射距離30 cm，分別照射30、60、90、120、150、180 s。統(tǒng)計致死率并確定最佳的誘變劑量。

1.3.5 NTG處理致死率曲線的測定

取7 支裝有1 mL菌液的試管，分別加入1 mL質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 g/L的NTG溶液，置于30 ℃恒溫水浴中分別反應(yīng)20 min，18 mL硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)[17]。統(tǒng)計致死率并確定最佳的誘變劑量。

1.3.6 流加培養(yǎng)基的優(yōu)化

采用L9（34）的正交表，優(yōu)化流加培養(yǎng)基中的葡萄糖、玉米漿及K2HPO4流加量，搖瓶流加培養(yǎng)26 h（流加條件見1.3.2節(jié)）之后以細胞收獲量為考察指標，其因素水平見表1。

表 1 L9（34）正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in L9(34) orthogonal array design

1.3.7 分析方法

1.3.7.1 菌體干質(zhì)量及蛋白質(zhì)含量的測定

取定量發(fā)酵液離心洗滌3 次，將濕菌體于105 ℃鼓風干燥箱中烘干至恒質(zhì)量[13]，測菌體干質(zhì)量；蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法[18]。

1.3.7.2 核酸含量的測定

取2 份5 mL發(fā)酵液，4 000 r/min離心洗滌菌體3 遍，一份收集菌體烘干測菌體干質(zhì)量，另一份重懸于90 mL蒸餾水中，冰浴，置于超聲波破碎儀中進行破碎，12 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液于紫外分光光度計260 nm波長處測吸光度，以蒸餾水做空白對照[19]。

式中：A為260 nm波長處吸光度；md為菌體干質(zhì)量/（g/L）；n為稀釋倍數(shù)；0.024為1 μg/mL核酸溶液的OD260nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 出發(fā)菌株性能從表2可以看出，產(chǎn)朊假絲酵母CL1501蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度較高，作為呈味酵母抽提物原料的高核酸酵母除需要有較高的核酸質(zhì)量濃度外，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度高也是比較重要的，因此，CL1501適合作為選育高核酸酵母的出發(fā)菌株。

表 2 出發(fā)菌株的性能測定Table 2 Properties of CL1501

2.2 復(fù)合誘變條件的確定

圖 1 CL1501的生長曲線Fig. 1 Growth curve of strain CL1501

當細胞進入對數(shù)期時，菌體大量繁殖、DNA等遺傳物質(zhì)也進行大量復(fù)制，許多堿基類似物在DNA復(fù)制過程中整合到DNA中[20]，此時是誘變處理的最佳狀態(tài)。測定CL1501的生長曲線，其結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，5～15 h時，CL1501進入對數(shù)期，15 h時對數(shù)期結(jié)束。選取培養(yǎng)至對數(shù)期中后期的菌種（培養(yǎng)時間12 h）進行誘變，既可保證菌種活力又可保證菌種數(shù)量。

圖 2 紫外誘變致死率曲線Fig. 2 Lethality rate of UV light mutagenesis

紫外是一種應(yīng)用廣泛、效果明顯的物理誘變劑，因其具有誘變頻率高、且不易回復(fù)突變等優(yōu)點，所以成為工業(yè)微生物育種上最常用和有效的誘變劑之一[21]。NTG是一種烷化劑，有超誘變劑之稱，能使細胞發(fā)生一次或多次突變，誘變效果好[20]。實驗選取紫外-NTG復(fù)合誘變，首先測定紫外照射時間對出發(fā)菌的誘變致死率曲線，結(jié)果見圖2。由圖2可知，當照射時間為90 s，致死率為63%，選擇紫外處理90 s先對菌懸液進行處理，再用不同濃度的NTG對菌懸液繼續(xù)進行誘變處理，其致死率曲線見圖3。由圖3可知，NTG處理的質(zhì)量濃度為0.6 g/L時，致死率達到80%。致死率為70%～80%時，誘變效果較好且易篩選[22]，故確定復(fù)合誘變處理方式為：紫外照射90 s后0.6 g/L的NTG處理20 min。復(fù)合誘變后平板篩選獲得200 株生長良好的突變株進行搖瓶初篩。

圖 3 紫外-NTG誘變致死率曲線Fig. 3 Lethality rate of UV-NTG mutagenesis

2.3 高核酸酵母篩選

圖 4 復(fù)篩結(jié)果Fig. 4 Results of secondary screening

圖 5 高產(chǎn)菌株發(fā)酵實驗對比Fig. 5 Comparison of fermentation characteristics of the original and mutant strains

以細胞收獲量為指標搖瓶初篩誘變獲得的200 株突變株，得到50 株生長良好的菌株進入搖瓶復(fù)篩，超聲波破碎并測定其核酸含量，挑選出15 株核酸含量較高的突變株（圖4）。突變株11、13、15號菌核酸質(zhì)量分數(shù)明顯高于出發(fā)菌株及其他突變株，將這3 株菌依次命名為CL15011、CL15013、CL15015，發(fā)酵實驗測定其細胞收獲量及核酸含量，其結(jié)果見圖5。由圖5可知，CL15013的核酸含量及細胞收獲量最高，經(jīng)測定其核酸含量、細胞收獲量較原始菌株分別提高了47.8%、28.9%，多次傳代及冰箱保存實驗證明該菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性，因此選擇CL15013進行發(fā)酵性能研究。

2.4 分批、流加培養(yǎng)方法對比

酵母培養(yǎng)中核酸的收獲量一方面與酵母核酸含量有關(guān)，另一方面，在穩(wěn)定的核酸含量下，與酵母細胞的收獲量有關(guān)，可以說，具有工業(yè)應(yīng)用潛力的高核酸酵母除具備核酸含量高以外，還應(yīng)具備細胞收獲量高的優(yōu)點。優(yōu)良的培養(yǎng)方法是獲得高細胞收獲量的重要途徑之一，也能有效地提高核酸收獲量。分批培養(yǎng)是傳統(tǒng)的酵母培養(yǎng)方法，在培養(yǎng)過程中，隨著發(fā)酵時間的延長，營養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，加上代謝物質(zhì)不斷產(chǎn)生，微生物的生長環(huán)境隨之逐步惡化，對于有持續(xù)發(fā)酵能力的菌株來說，其細胞收獲量將大大減少。而流加培養(yǎng)[23-26]由于不斷補充營養(yǎng)物質(zhì)并調(diào)節(jié)發(fā)酵環(huán)境，將有效克服上述問題，因此，流加培養(yǎng)對于高核酸酵母的生產(chǎn)具有較大的優(yōu)勢。

圖 6 分批、流加培養(yǎng)酵母的生長曲線Fig. 6 Growth curves of yeast in batch and fed-batch culture

圖 7 分批、流加培養(yǎng)發(fā)酵液的pH值Fig. 7 Changes in pH during batch and fed-batch culture

對突變株CL15013分別進行分批、流加培養(yǎng)并測定培養(yǎng)過程中細胞收獲量及發(fā)酵液的pH值，結(jié)果見圖6、7。從圖6可以看出，突變株經(jīng)流加培養(yǎng)后，對數(shù)期延長了約6 h，且流加培養(yǎng)細胞收獲量為16.9 g/L，為分批培養(yǎng)的1.93倍。由圖7可知，分批培養(yǎng)過程中，發(fā)酵液的pH值在遲滯期及對數(shù)期早期迅速降低，可以判斷，在發(fā)酵初期，產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)酸導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值下降到3左右，嚴重抑制菌體繁殖，菌體收獲量也逐減。流加培養(yǎng)時，由于不斷補充新鮮培養(yǎng)基并調(diào)節(jié)pH值，發(fā)酵環(huán)境保持適于產(chǎn)朊假絲酵母生長的狀態(tài)，其細胞收獲量相較分批培養(yǎng)大幅提高，因此，產(chǎn)朊假絲酵母進行高核酸酵母發(fā)酵更適合采用流加培養(yǎng)。

2.5 流加培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.5.1 流加培養(yǎng)基的單因素試驗結(jié)果

在預(yù)備實驗的基礎(chǔ)上，選取對細胞產(chǎn)率影響較大的4 種因素：葡萄糖流加量、玉米漿流加量、K2HPO4流加量、流加培養(yǎng)基pH值進行單因素試驗，單因素考察外的其他變量條件為：葡萄糖流加量40 g/L、玉米漿流加量40 mL/L、K2HPO4流加量5 g/L，pH 6.5。

圖 8 葡萄糖流加量對細胞收獲量的影響Fig. 8 Effect of glucose addition on cell yield

由圖8可知，細胞收獲量隨葡萄糖流加量的增多而提高，葡萄糖流加量對細胞收獲量影響顯著（P=0.005＜0.01），當葡萄糖流加量超過40 g/L后，細胞收獲量隨葡萄糖流加量的變化趨勢較為緩慢，細胞收獲量無顯著變化，因此選擇40 g/L為較優(yōu)葡萄糖流加量。

圖 9 玉米漿流加量對細胞收獲量的影響Fig. 9 Effect of corn steep liquor addition on cell yield

由圖9可知，當玉米漿流加量在30～40 mL/L范圍內(nèi)，細胞收獲量隨玉米漿流加量的增多而迅速提高，玉米漿流加量對細胞收獲量影響顯著（P=0.003＜0.01），繼續(xù)增加玉米漿流加量對細胞收獲量無顯著影響，因此選擇40 mL/L為較優(yōu)玉米漿流加量。

圖 10 K2HPO4流加量對細胞收獲量的影響Fig. 10 Effect of K2HPO4addition on cell yield

圖 11 不同pH值對細胞收獲量的影響Fig. 11 Effect of pH on cell yield

由圖10、11可知，K2HPO4流加量對細胞收獲量影響不顯著（P=0.078＞0.05）且較優(yōu)K2HPO4流加量為5 g/L；發(fā)酵過程pH值通過流加維持5～7，此范圍內(nèi)pH值變化對細胞收獲量影響不夠顯著，較優(yōu)pH值為6.5。

2.5.2 流加培養(yǎng)基正交試驗優(yōu)化結(jié)果

表 3 正交試驗結(jié)果及極差分析Table 3 Orthogonal array design with range analysis of experimental results

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以流加的葡萄糖、玉米漿、K2HPO4三個影響顯著的因素按L9（34） 正交設(shè)計表（表1）進行正交試驗，結(jié)果及數(shù)據(jù)分析見表3，方差分析見表4。正交試驗極差分析結(jié)果顯示：流加培養(yǎng)基正交試驗各因素對細胞收獲量影響的主次順序為B＞A＞C，其最佳條件組合為B2A2C2，即葡萄糖流加量40 g/L、玉米漿流加量40 mL/L、K2HPO4流加量5 g/L。方差分析顯示玉米漿流加量對細胞收獲量的影響達到了顯著水平，這是因為玉米漿不僅為細胞提供氮源，還提供其生長所必需的生長因子。因此，適當質(zhì)量濃度的玉米漿對于細胞的大量積累具有顯著影響。

表 4 正交試驗方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance for the orthogonal array design

對正交試驗所得的最優(yōu)條件進行重復(fù)性驗證實驗，結(jié)果菌體收獲量平均為21.3 g/L、其核酸質(zhì)量占菌體干質(zhì)量的16.8%。突變株CL15013經(jīng)流加優(yōu)化后培養(yǎng)，其胞內(nèi)核酸質(zhì)量分數(shù)無明顯變化，而細胞收獲量出現(xiàn)了較大幅度提高，這說明該菌在其對數(shù)生長期內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平已達到了最大，但由于細胞收獲量的提升，核酸收獲量也隨之提升，使其具有較好的工業(yè)應(yīng)用潛力。對比國內(nèi)其他研究，如陳文明等[27]高產(chǎn)RNA釀酒酵母的細胞收獲量12.2 g/L、核酸質(zhì)量分數(shù)12.6%，可以發(fā)現(xiàn)，CL15013細胞收獲量及核酸質(zhì)量分數(shù)有較大幅度提高。根據(jù)正交試驗及其方差分析結(jié)果，確定流加培養(yǎng)基最佳條件為葡萄糖流加量40 g/L、玉米漿流加量40 mL/L、K2HPO4流加量5 g/L。

3 結(jié) 論

性能良好的高核酸酵母是生產(chǎn)高品質(zhì)酵母抽提物的關(guān)鍵。實驗發(fā)現(xiàn)，通過誘變處理后可以篩選出核酸含量較大提高的突變株，且方法簡單高效。以產(chǎn)朊假絲酵母CL1501為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外-NTG復(fù)合誘變后，篩選出突變株CL15013，其核酸質(zhì)量占菌體干質(zhì)量的16.8%，比出發(fā)菌提高47.8%，且具有良好的遺傳穩(wěn)定性，適合用于生產(chǎn)高核酸酵母抽提物。進一步對比研究其分批和流加兩種培養(yǎng)方式，發(fā)現(xiàn)流加培養(yǎng)能有效延長菌株的對數(shù)期，獲得較高的細胞收獲量。分析原因發(fā)現(xiàn)在分批培養(yǎng)中，菌株在延滯期及對數(shù)期生長的同時產(chǎn)生了一定量的酸，導(dǎo)致培養(yǎng)體系過酸，從而阻止了細胞在對數(shù)期的快速繁殖，導(dǎo)致細胞收獲量不高；通過流加新鮮的培養(yǎng)基，保持了pH值的穩(wěn)定，使得細胞生長狀態(tài)良好、對數(shù)期延長，提高了細胞收獲量，從而提高了核酸收獲量。正交試驗優(yōu)化流加培養(yǎng)基，結(jié)果顯示玉米漿流加量對細胞收獲量影響最顯著，流加培養(yǎng)基的最優(yōu)添加量為：葡萄糖40 g/L、玉米漿40 mL/L、K2HPO45 g/L。利用優(yōu)化的流加培養(yǎng)基流加培養(yǎng)產(chǎn)朊假絲酵母CL15013，其細胞收獲量達21.3 g/L，較分批培養(yǎng)提高144.8%；其核酸質(zhì)量分數(shù)為16.8%，保持相對穩(wěn)定。具有良好生產(chǎn)應(yīng)用潛力的高核酸酵母應(yīng)具備核酸含量高及細胞收獲量大的優(yōu)點，這兩個優(yōu)點都需要菌株在培養(yǎng)中有較長的對數(shù)期，因此，如何構(gòu)建并完善高核酸酵母培養(yǎng)體系，獲得較高的細胞收獲量及核酸含量，是今后的研究重點。

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Breeding of a Candida utilis Mutant for Efficient Nucleic Acid Production and its Fermentation Performance

JIANG Xuewei1, YUE Xijie1, CHEN Daiwen2, ZHOU Zhiming2, LUO Xiaoming1,*, YE Jing1, LI Xiaowen1
(1. College of Chemical and Biological Engineering, Changsha University of Science & Technology, Changsha 410004, China; 2. Liannan Yao Autonomous County Qixiang Bio-Sci Co. Ltd., Qingyuan 513300, China)

Candida utilis CL1501 was mutagenized with a combination of UV irradiation and nitrosoguanidine treatment. An excellent mutant with high ability to produce nucleic acid, named as CL15013, was obtained. Its nucleic acid content was 16.8% on a dry cell weight basis, which was 47.8% higher than that of CL1501. The dry biomass yield of the mutant was 16.9 g/L in fed-batch culture, which was 94.3% higher than that from batch culture. Under optimized fed-batch culture conditions obtained by orthogonal array design, the biomass yield was up to 21.3 g/L, which was 144.8% higher than that from batch cultivation. These results indicated that mutant CL15013 has a great application potential in industrial production.

Candida utilis; combined mutation; nucleic acid; fed-batch culture

10.7506/spkx1002-6630-201710025

TQ926.1

A

1002-6630（2017）10-0149-06

蔣雪薇, 岳希潔, 陳代文, 等. 產(chǎn)朊假絲酵母核酸高產(chǎn)株的選育及其發(fā)酵性能研究[J]. 食品科學(xué),2017, 38(10): 149-154.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710025. http://www.spkx.net.cn

JIANG Xuewei, YUE Xijie, CHEN Daiwen, et al. Breeding of a Candida utilis mutant for efficient nucleic acid production and its fermentation performance[J]. Food Science, 2017, 38(10): 149-154. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201710025. http://www.spkx.net.cn

2016-07-18

清遠市科技計劃項目（2013A024；2014A023）；長沙市科技計劃重大專項（kq1601013）

蔣雪薇（1972—），女，副教授，博士，研究方向為工業(yè)微生物發(fā)酵及食品生物技術(shù)。E-mail：jxw_72@sina.com

*通信作者：羅曉明（1968—），男，副教授，碩士，研究方向為生物化工。E-mail：csluoxm@sina.com