丁順斌，王簡勤，蔡明春，葉鑫，姜天華

(1德陽市人民醫(yī)院，四川德陽618000；2蘭州大學(xué)附屬第二醫(yī)院；3第三軍醫(yī)大學(xué)高原生理學(xué)和高原生物學(xué)教研室)

miR-630在胃癌組織中的表達(dá)變化及對胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖、侵襲能力的影響

丁順斌1，王簡勤2，蔡明春3，葉鑫1，姜天華1

(1德陽市人民醫(yī)院，四川德陽618000；2蘭州大學(xué)附屬第二醫(yī)院；3第三軍醫(yī)大學(xué)高原生理學(xué)和高原生物學(xué)教研室)

目的 觀察miR-630在胃癌組織中的表達(dá)變化，及miR-630對胃癌細(xì)胞株SGC-7901增殖、侵襲能力的影響。方法 收集131例胃癌患者的胃癌組織及癌旁正常胃組織，采用實時熒光定量PCR法檢測miR-630。培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞，分為實驗組、空載組和對照組，實驗組轉(zhuǎn)染miR-630，空載組轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒，對照組僅加入PBS；分別于培養(yǎng)12、24、48、72 h后采用MTT法檢測細(xì)胞增殖能力；培養(yǎng)24 h后以Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲能力；培養(yǎng)24 h后，采用Western blotting法檢測細(xì)胞中的p27、MMP-2、MMP-9蛋白。結(jié)果 胃癌組織、癌旁組織中miR-630的相對表達(dá)量分別為1.93±0.41、2.74±0.48，胃癌組織中miR-630相對表達(dá)量低于癌旁組織(P均<0.05)。腫瘤直徑≥5 cm者胃癌組織中miR-630相對表達(dá)量低于直徑<5 cm者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，浸潤深度為T2～T4級者低于T1級者，Ⅲ～Ⅳ期者低于Ⅰ～Ⅱ期者(P均<0.05)。轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，實驗組細(xì)胞增殖能力均低于轉(zhuǎn)染同時點的空載組和對照組(P均<0.01)。實驗組、空載組、對照組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為15.4±2.7、24.3±23.1、29.7±19.4，實驗組穿膜細(xì)胞數(shù)少于對照組和空載組(P均<0.01)。實驗組細(xì)胞中p27蛋白相對表達(dá)量高于空載組和對照組，MMP-2、MMP-9蛋白相對表達(dá)量低于空載組和對照組(P均<0.01)。結(jié)論 胃癌組織中miR-630表達(dá)減少，mir-630低表達(dá)可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)；miR-630有抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲的作用，機(jī)制可能與p27蛋白表達(dá)上調(diào)及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

胃癌；胃癌細(xì)胞；微小RNA；微小RNA630；細(xì)胞增殖；細(xì)胞侵襲

盡管胃癌的手術(shù)和化療方案不斷優(yōu)化，但晚期胃癌患者的5年生存率仍只有5%～20%?，F(xiàn)有研究表明，抑癌基因缺失和致癌基因過表達(dá)參與胃癌的發(fā)生發(fā)展[1]。因此，研究并揭示胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因機(jī)制有助于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點。微小RNA(miRNA)是一類長度為18～25個核苷酸的普遍存在于細(xì)胞中的非編碼RNA。多種腫瘤存在miRNA表達(dá)水平失調(diào)，且人類一半以上的miRNA基因位于腫瘤相關(guān)性位點，這提示miRNA可能有類似癌基因或抑癌基因的功能?，F(xiàn)已證實miRNA在胃癌細(xì)胞增殖和侵襲中具有重要的調(diào)控作用[2]。miR-630是一種抑癌miRNA，可調(diào)節(jié)多種與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、侵襲有關(guān)的抑癌基因或蛋白表達(dá)[3,4]。但是，miR-630在胃癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能并不清楚。本研究觀察了miR-630在胃癌組織中的表達(dá)變化，及miR-630對胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖、侵襲能力的影響，并探索相關(guān)機(jī)制，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2010～2011年德陽市人民醫(yī)院收治的胃腺癌患者131例，男94例、女37例，年齡41～83(62.2±8.6)歲。所有患者術(shù)前均未行任何放、化療，均經(jīng)術(shù)后病理診斷確認(rèn)?；颊呔炇鹬橥鈺⒂傻玛柺腥嗣襻t(yī)院倫理委員會審核通過。留取患者術(shù)后胃癌組織標(biāo)本及癌旁正常胃組織標(biāo)本，保存于-80 ℃冰箱備檢。

1.2 胃癌組織中miR-630檢測 提取胃癌組織及癌旁正常胃組織中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用實時熒光定量PCR法檢測miR-630，反應(yīng)條件為94 ℃ 15 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共循環(huán)40次，最后72 ℃延伸8 min。每組樣品重復(fù)3次，實驗重復(fù)3次，取均值。

1.3 miR-630對胃癌細(xì)胞增殖、侵襲的影響觀察

1.3.1 miR-630轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞 miR-630過表達(dá)質(zhì)粒miR-630mimic由上海吉瑪公司設(shè)計合成，上游引物序列為5′-AGUAUUCUGUACCAGGGAAGGU-3′，下游引物序列為3′-ACCUUCCCUGGUACAGAAUACU-5′。將胃癌細(xì)胞株SGC-7901接種至6孔板，生長至50%～70%密度時，以脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染miR-630mimic(實驗組)和空載質(zhì)粒(空載組)各100 pmol；以只加PBS的細(xì)胞為對照組。培養(yǎng)24 h后提取總RNA采用實時熒光定量PCR法檢測miR-630驗證轉(zhuǎn)染成功，再進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.3.2 SGC-7901細(xì)胞增殖能力檢測 采用MTT法。將各組SGC-7901細(xì)胞加入96孔板，每組設(shè)3個復(fù)孔、2個無細(xì)胞的空白孔。分別于培養(yǎng)12、24、48、72 h后每孔加入MTT液20 μL，37 ℃下繼續(xù)孵育4～6 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩10 min，用酶標(biāo)儀測定492 nm波長處各孔OD值，反映細(xì)胞增殖能力。

1.3.3 SGC-7901細(xì)胞侵襲能力檢測 采用Transwell法。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，先用血清饑餓各組細(xì)胞使細(xì)胞同步化，以1.8 mmol/L的羥基脲作用12 h抑制細(xì)胞增殖，用0.25%胰蛋白酶消化SGC-7901細(xì)胞后，用含1% FBS的DMEM培養(yǎng)基配成細(xì)胞懸液并計數(shù)；調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL，在配套Transwell小室上室加入細(xì)胞懸液200 μL，下室加入含有10% FBS的培養(yǎng)液500 μL，培養(yǎng)12 h。用棉簽擦去上層未穿透膜的SGC-7901細(xì)胞，取下Transwell半透膜，PBS洗3次，3.7%多聚甲醛室溫固定5 min，PBS洗3次，用1 μg/mL的結(jié)晶紫染色，PBS洗3次，顯微鏡下每組隨機(jī)取5個視野觀察計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.3.4 SGC-7901細(xì)胞中p27、MMP-2、MMP-9蛋白檢測 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，采用Western blotting法檢測p27、MMP-2、MMP-9蛋白。提取組織或細(xì)胞中總蛋白，BCA法定量蛋白，SDS-PAGE膠每孔加入30 μL的樣品，70 V 30 min進(jìn)行蛋白濃縮，100 V 2 h進(jìn)行蛋白電泳，并用孔徑0.45 μm的PVDF膜250 mA 90 min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后常溫下TBST洗膜3次、封閉1 h后，以1∶1 000濃度加入兔(鼠)抗人P21一抗(或抗p27、MMP-2、MMP-9、β-actin一抗)，4 ℃孵育過夜，常溫下TBST洗膜3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔(鼠)二抗孵育后ECL化學(xué)發(fā)光法檢測?？逻_(dá)膠片暗室顯影，Quantity One軟件分析，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參灰度值的比值表示目的蛋白相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0、Medcalc和Graph Pad Prism6.0軟件。中位數(shù)比較用median檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料比較用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織中miR-630表達(dá)變化及其與腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系 胃癌組織、癌旁組織中miR-630的相對表達(dá)量分別為1.93±0.41、2.74±0.48，胃癌組織中miR-630相對表達(dá)量低于癌旁組織(P均<0.05)。腫瘤直徑≥5 cm者胃癌組織中miR-630相對表達(dá)量低于直徑<5 cm者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，浸潤深度為T2～T4級者低于T1級者，Ⅲ～Ⅳ期者低于Ⅰ～Ⅱ期者(P均<0.05)。詳見表1。

表1 胃癌組織中miR-630表達(dá)與腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.2 miR-630對胃癌細(xì)胞增殖、侵襲的影響

2.2.1 胃癌細(xì)胞增殖能力變化 轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，實驗組細(xì)胞增殖能力均低于轉(zhuǎn)染同時點的空載組和對照組(P均<0.01)。見表2、圖1。

表2 各組胃癌細(xì)胞增殖能力比較

注：與同時點空載組、對照組相比，*P<0.01。

圖1 不同時點各組胃癌細(xì)胞增殖能力

2.2.2 胃癌細(xì)胞侵襲能力變化 實驗組、空載組、對照組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為15.4±2.7、24.3±23.1、29.7±19.4，實驗組穿膜細(xì)胞數(shù)少于對照組和空載組(P均<0.01)。見圖2。

圖2 各組穿膜細(xì)胞情況

2.2.3 胃癌細(xì)胞中p27、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)變化 實驗組細(xì)胞中p27蛋白相對表達(dá)量高于空載組和對照組，MMP-2、MMP-9蛋白相對表達(dá)量低于空載組和對照組(P均<0.01)。見表3、圖3。

表3 各組胃癌細(xì)胞中p27、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)比較

注：與空載組、對照組相比，*P<0.01。

圖3 各組胃癌細(xì)胞中p27、MMP-2、MMP-9蛋白電泳結(jié)果

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)的miRNA超過1 900種，在哺乳動物中，miRNA可調(diào)控超過60%的基因表達(dá)[5]。目前認(rèn)為miRNA參與細(xì)胞增殖、凋亡和分化等多種過程的調(diào)節(jié)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也起重要作用。大量研究發(fā)現(xiàn)miRNAs在胃癌中異常表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，參與胃癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移等過程[6]。Wang等[7]研究表明miR-218能抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這種抑癌作用可能是通過調(diào)控LASP1蛋白表達(dá)實現(xiàn)的。miR-561被發(fā)現(xiàn)同樣能抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力，并與胃癌患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[8]。另有學(xué)者[9]研究了miR-1對胃癌細(xì)胞的作用，結(jié)果顯示miR-1過表達(dá)能抑制胃癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移能力，提示miR-1在胃癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用。miR-630是一種抑癌miRNAs，可調(diào)節(jié)多種與腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)有關(guān)的抑癌基因或蛋白表達(dá)，從而調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Zhou等[3]檢測了乳腺癌組織標(biāo)本中的miR-630，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量顯著低于正常乳腺組織，隨后發(fā)現(xiàn)miR-630能明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力。另外，在肺癌細(xì)胞中，miR-630能靶向調(diào)控細(xì)胞周期依賴性激酶7(CDC7)，影響細(xì)胞增殖和凋亡[10]。先前，Chu等[11]通過檢測236例未行放化療的胃癌患者胃癌組織及癌旁正常胃組織中的miR-630，發(fā)現(xiàn)miR-630在胃癌組織中表達(dá)降低，并進(jìn)一步通過病例隨訪發(fā)現(xiàn)miR-630的表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后有關(guān)。最近研究又發(fā)現(xiàn)miR-630在結(jié)腸癌和肝癌的發(fā)展中有重要作用。

為觀察和分析miR-630在胃癌中的生物學(xué)功能，我們先檢測了胃癌組織中的miR-630，并分析胃癌組織中miR-630表達(dá)與腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示，胃癌組織中miR-630相對表達(dá)量低于癌旁組織；腫瘤直徑≥5 cm者胃癌組織中miR-630相對表達(dá)量低于直徑<5 cm者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，浸潤深度為T2～T4級者低于T1級者，Ⅲ～Ⅳ期者低于Ⅰ～Ⅱ期者。這表明miR-630與胃癌的發(fā)病及進(jìn)展有一定關(guān)系。我們進(jìn)一步進(jìn)行胃癌細(xì)胞離體培養(yǎng)，觀察轉(zhuǎn)染miR-630后細(xì)胞增殖、侵襲能力變化，并初步探索其機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，實驗組細(xì)胞增殖能力均低于轉(zhuǎn)染同時點的空載組和對照組；實驗組穿膜細(xì)胞數(shù)少于對照組和空載組。

MMPs在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用，其一方面通過與細(xì)胞黏附分子相互作用降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤向周圍組織增殖、遷移提供空間，另一方面MMPs還可以激活細(xì)胞內(nèi)的PI3K/AKT通路從而增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和增殖能力[12,13]。p27蛋白參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖，p27表達(dá)增加時，腫瘤細(xì)胞的增殖受到抑制[14]。我們的實驗結(jié)果顯示，實驗組細(xì)胞中p27蛋白相對表達(dá)量高于空載組和對照組，MMP-2、MMP-9蛋白相對表達(dá)量低于空載組和對照組。上述結(jié)果提示，miR-630可明顯抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，這種作用可能與p27蛋白表達(dá)上調(diào)及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

結(jié)合上述研究結(jié)果，我們認(rèn)為，miR-630低表達(dá)可能參與胃癌的發(fā)生與進(jìn)展，miR-630可抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究結(jié)果為miR-630用于胃癌的治療提供了實驗基礎(chǔ)。

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Expression of miR-630 in gastric carcinoma and its effect on proliferation and invasion ability of gastric cancer cell line SGC-7901

DINGShunbin1,WANGJianqing,CAIMingchun,YEXin,JIANGTianhua

(1DeyangPeople'sHospital,Deyang618000,China)

Objective To investigate the expression of miR-630 in gastric carcinoma and its effect on the proliferation and invasion ability of gastric cancer cell line SGC-7901 in vitro. Methods The gastric cancer tissues and adjacent normal gastric tissues were collected from 131 patients with gastric cancer. The expression of miR-630 in the tissues was detected by RT-PCR. The cultured SGC-7901 cells were divided into 3 groups: the experimental group, empty vector group and control group which were transfected with miR-630, empty vector and PBS, respectively. The cells were cultured for 12, 24, 48 and 72 h, and MTT assay was employed to test the proliferation ability of cells. At 24 h, Transwell assay was used to test the invasion ability of cells, and Western blotting was used to investigate the expression of p27, MMP-2, MMP-9 in SGC-7901 cells. Results The relative expression levels of miR-630 in the gastric cancer tissues and adjacent normal tissues were 1.93±0.41 and 2.74±0.48, respectively. The relative expression of miR-630 in the gastric cancer tissues was lower than that in the adjacent normal tissues (allP<0.05). The relative expression of miR-630 in gastric cancer patients with diameter ≥5 cm, with lymph node metastasis, in T2-T4grade and in Ⅲ-Ⅳ phase was successively lower than that in patients with diameter >5 cm, without lymph node metastasis, in T2-T4grade, and in Ⅲ-Ⅳ phase (allP<0.05). In vitro studies, at 24, 48 and 72 h after transfection, the cell proliferation ability of the experimental group was lower than that of the empty vector group and control group (allP<0.01). The transmembrane cells in the experimental group, empty vector group and control group were 15.4±2.7, 24.3±23.1 and 29.7±19.4, respectively. The number of the transmembrane cells in the experimental group was less than that in the empty vector group and the control group (allP<0.01). The relative expression of p27 protein in the the experimental group was higher, and the expression of MMP-2 and MMP-9 protein was lower than that in the empty vector group and control group (allP<0.01). Conclusions The expression of miR-630 in the gastric cancer tissues is decreased, and the low expression of mir-630 might be related to the development of gastric cancer. MiR-630 could inhibit the proliferation and invasion of gastric cancer cells, which may be related to the up-regulation of p27 and down-regulation of MMP-2 and MMP-9.

gastric carcinoma; gastric carcinoma cells; miRNA; miR-630; cell proliferation; cell invasion

甘肅省衛(wèi)生行業(yè)科研計劃資助項目(GSWST2013-02)。

丁順斌(1969-)，男，副主任醫(yī)師，主要研究方向為胃食管反流病、消化系統(tǒng)腫瘤和功能性疾病的診治。E-mail: 420384109@qq.com

姜天華(1969-)，男，副主任技師，主要研究方向為臨床檢驗與輸血管理。E-mail: docjth1976@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.15.003

R543.3

A

1002-266X(2017)15-0009-04

2016-09-12)