陳 瑜，劉婉薇，李良芳，岑榮英，聶勝利，盧艷嫻,，李銳鋒,，李子俊,△

(1.南方醫(yī)科大學(xué)，廣州 510515；2.廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣州 510080)

·生物信息學(xué)·

功能性消化不良患者唾液菌群的研究*

陳 瑜1，劉婉薇2，李良芳2，岑榮英2，聶勝利2，盧艷嫻1,2，李銳鋒1,2，李子俊1,2△

(1.南方醫(yī)科大學(xué)，廣州 510515；2.廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣州 510080)

目的 分析功能性消化不良患者與健康對(duì)照者唾液菌群的差異。方法 收集功能性消化不良患者及健康對(duì)照者的唾液標(biāo)本，提取總基因組DNA，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)樣本中細(xì)菌的16S rRNA-V4區(qū)進(jìn)行DNA測(cè)序后進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果 功能性消化不良組唾液中的菌群以變形菌門為主，健康對(duì)照組以擬桿菌門為主。功能性消化不良唾液菌群的Chao1、ACE、Shannon指數(shù)分別為1 295、1 351、4.93，健康對(duì)照組為1 001、1 019、5.28。 PCoA可基本將兩組間的唾液菌群區(qū)分開。LEfSe分析發(fā)現(xiàn)兩組間有差異菌群共有16個(gè)，包括普式菌屬、奈瑟菌屬及變形菌門等。結(jié)論 功能性消化不良患者唾液有其特征性的菌群組成，以變形菌門為主，但兩組間的豐富度及多樣性無差別，奈瑟菌屬是兩組間差異顯著的細(xì)菌之一。

功能性消化不良；唾液；細(xì)菌；奈瑟菌屬

胃及食管長期以來均被認(rèn)為“無菌”或僅有“過路菌”，而近年來通過高通量測(cè)序等技術(shù)發(fā)現(xiàn)胃及食管都有著其獨(dú)特的細(xì)菌組成。Bik等[1]研究發(fā)現(xiàn)，胃黏膜中細(xì)菌主要由厚壁菌門及變形菌門組成，而細(xì)菌與上消化道疾病的關(guān)系也越來越受到重視。研究[2-3]發(fā)現(xiàn)，反流性食管炎、Barrett食管與正常的食管黏膜細(xì)菌組成不同，不同的細(xì)菌群落可能與食管疾病有關(guān)[4]。非萎縮性胃炎、腸化生、胃癌胃黏膜中的細(xì)菌多樣性依次降低，非萎縮性胃炎與胃癌的細(xì)菌組成有顯著不同[5]。此外，細(xì)菌與消化性潰瘍、萎縮性胃炎也有密切聯(lián)系。功能性消化不良(functional dyspepsia，F(xiàn)D)是一種常見的功能性胃腸病，其發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚，包括胃排空延遲、容受性舒張功能下降、精神心理因素等[6-7]。胃與口腔及食管相通，口腔中的細(xì)菌可通過唾液吞咽等方式影響胃內(nèi)細(xì)菌組成，有研究提示胃內(nèi)的耐酸細(xì)菌主要是來源于口腔和食物的過路菌[8]。因此，筆者推測(cè)，唾液中的細(xì)菌改變與功能性消化不良的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2015年7月至2016年3月廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)就診的FD患者14例及同期行健康體檢的健康對(duì)照者(health control,HC)10例作為研究對(duì)象。本研究已通過廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)的倫理委員會(huì)審查，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) FD患者需符合羅馬Ⅲ診斷標(biāo)準(zhǔn)，健康對(duì)照者為無器質(zhì)性疾病、系統(tǒng)性疾病、口腔疾病、腫瘤家族史的健康人，兩組人群年齡均大于18歲，且無幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)感染。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 近4周內(nèi)有腹瀉病史、感染性疾病史或急性胃腸炎病史；近4周內(nèi)使用調(diào)節(jié)腸道菌群藥物、抗生素、質(zhì)子泵抑制劑、其他抑酸藥物、非甾體類抗炎藥及根除Hp藥物等；有胃、食管及其他消化道手術(shù)史等； 合并其他部位腫瘤、器質(zhì)性疾病、系統(tǒng)性疾病和急性口腔感染等；孕婦或哺乳期婦女。

1.4 方法

1.4.1 唾液收集 用50 mL無菌無酶離心管收集非刺激性唾液。唾液收集前需禁食、禁飲2 h以上，唾液總量5 mL以上，30 min內(nèi)完成。收集完后1 h內(nèi)放入-80℃冰箱保存。

1.4.2 唾液DNA提取 采用Ultra Clean Microbial DNA Isolation Kit提取唾液總DNA，具體步驟按說明書操作。

1.4.3 DNA檢測(cè) 提取后的DNA需達(dá)以下標(biāo)準(zhǔn)：DNA總量大于或等于150 ng；OD 260/280值1.8～2.0，DNA濃度大于或等于5 ng/μL。樣品檢測(cè)合格后送至北京諾禾致源生物科技技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina Hiseq PE250。

1.4.4 生物信息學(xué)處理 主要包括物種注釋、操作分類單位(operational taxonomic unit，OTU)、 樣品α多樣性分析、β多樣性分析等。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS21.0軟件處理數(shù)據(jù)，年齡間差異及組間菌群相對(duì)豐度的差異采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，性別間差異采用χ2檢驗(yàn)，OTU數(shù)量及α多樣性指數(shù)差異采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 本研究納入FD患者14例，健康對(duì)照者10例。FD平均年齡為35歲，健康對(duì)照組平均年齡41歲，年齡、性別比例組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 OTU分析及物種分析 FD和健康對(duì)照組的唾液樣本共獲得1 589 781條序列，平均每個(gè)樣本為66 241條。FD組獲得序列平均為66 675條，健康對(duì)照組獲得序列平均為61 642條。以97%的一致性將序列聚類成為OTU，F(xiàn)D組平均得到(1 162±503)個(gè)OTU，健康對(duì)照組平均得到(928±425)個(gè)OTU。物種分析表明門水平的細(xì)菌有42種，屬水平有309種，種水平有91種。 在門水平，F(xiàn)D組以變形菌門(Proteobacteria)為主，占40.7%，健康對(duì)照組以擬桿菌門(Bacteroidetes)為主，占37.3%。在屬水平，F(xiàn)D組以奈瑟菌屬(Neisseria)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、普式菌屬(Prevotella)為主，健康對(duì)照組以普式菌屬(Prevotella)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、韋榮球菌屬(Veillonella)為主(圖1)。

圖1 兩組唾液菌群門水平相對(duì)豐度柱形圖

2.3 α多樣性分析 當(dāng)序列數(shù)達(dá)約30 000條，兩組的稀釋曲線達(dá)到平臺(tái)期，表明測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋大部分物種。兩組的平均指數(shù)平均達(dá)到98%以上(圖2)。FD的平均Chao1、ACE、Shannon及Simpson指數(shù)為1 295、1 351、4.93、0.90，健康對(duì)照組的為1 001、1 019、5.28、0.92，表明兩組樣本中細(xì)菌物種豐富且較為復(fù)雜。但上述指數(shù)組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 兩組稀釋曲線

2.4 β多樣性分析 本試驗(yàn)采用Qiime軟件，采用uniFrac進(jìn)行β多樣性分析。該方法可展示菌群之間的相似度[9]。兩組菌群構(gòu)成的主成分分析(Principal Co-ordinates Analysis,PCoA)顯示，PCoA可基本將FD組和健康對(duì)照組唾液內(nèi)細(xì)菌群落分開，說明兩組細(xì)菌群落構(gòu)成不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

圖3 功能性消化不良組和健康對(duì)照組唾液細(xì)菌群落構(gòu)成PCoA分析

2.5 LEfSe分析 LEfSe是一種用于發(fā)現(xiàn)高維生物標(biāo)識(shí)和揭示基因組特征的軟件分析，能夠在組與組之間尋找具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的物種。LEfSe分析得出兩組間有差異菌群共有16個(gè)，其中11個(gè)在健康對(duì)照組富集，分別為Bacteroidia、擬桿菌目(Bacteroidales)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、普式菌屬(Prevotella)、普雷沃菌科(Prevotellaceae)、厚壁菌門(Firmicutes)、梭狀芽孢桿菌(Clostridia)、梭菌目(Clostridiales)、韋榮球菌科(Veillonellaceae)、韋榮球菌屬(Veillonella)、dispar，5個(gè)在FD組富集，分別為奈瑟菌屬(Neisseria)、奈瑟菌目(Neisseriales)、奈瑟菌科(Neisseriaceae)、β變形菌(Betaproteobacteria)及變形菌門(Proteobacteria)(圖4)。

圖4 LDA值分布柱狀圖

3 討 論

細(xì)菌與上消化道疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。Blackett等[10]研究發(fā)現(xiàn)胃食管反流病及Barrett食管黏膜中彎曲桿菌屬明顯增加，且與IL-18增多相關(guān)，IL-18可介導(dǎo)體內(nèi)免疫反應(yīng)發(fā)生，可能與食管相關(guān)疾病發(fā)病有關(guān)。Khosravi等[11]發(fā)現(xiàn)消化性潰瘍與鏈球菌屬相關(guān)，可能是除Hp外另一個(gè)致病菌。Mattarelli等[12]發(fā)現(xiàn)胃酸過少患者的胃黏膜中存在大量雙歧桿菌科，而正常黏膜中沒有發(fā)現(xiàn)。此外，食管癌、胃癌等其他上消化道疾病也有其各自的微生物群落組成[13]。胃內(nèi)的細(xì)菌組成部分來源于口腔，唾液是口腔微生態(tài)的介質(zhì)之一，大量微生物存在于唾液中[14]。因此，研究唾液中的微生物組成，對(duì)上消化道疾病的發(fā)病、診斷、治療等方面有重大意義。

本研究顯示健康對(duì)照組唾液中以普式菌屬、梭桿菌屬、韋榮球菌屬為主，與既往研究結(jié)果相似，而FD患者唾液中以奈瑟菌屬、梭桿菌屬、普式菌屬為主。Alpha多樣性分析包括稀釋曲線、Chao1、ACE、Shannon等指數(shù)。 Chao1及ACE用于計(jì)算菌群的豐度，數(shù)值越大，說明物種總數(shù)越多。Shannon及Simpson用于計(jì)算菌群的多樣性，Shannon值越大，Simpson值越小，說明群落多樣性越高。這些結(jié)果結(jié)合稀釋曲線、Coverage 指數(shù)及Rank Abundance曲線，表明兩組測(cè)序深度足夠，足以覆蓋唾液中的大部分細(xì)菌種屬，表明各組樣品豐富度、多樣性及均勻度良好。但上述指數(shù)的組間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明兩組樣品間豐富度及多樣性無明顯差異。PCoA分析表明兩組間細(xì)菌群落構(gòu)成不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)，F(xiàn)D患者唾液有其特征性的細(xì)菌組成。

LEfSe分析發(fā)現(xiàn)兩組間有差異菌群共有16個(gè)，其中11個(gè)在健康對(duì)照組富集，其中大部分屬于擬桿菌門(如普式菌屬)及厚壁菌門(如韋榮球菌屬)，這二者在健康對(duì)照組門水平共占比約56.6%。另5個(gè)在FD組富集，分別為奈瑟菌屬、奈瑟菌目、奈瑟菌科、β變形菌及變形菌門。這5種細(xì)菌均屬于變形菌門，而變形菌門是功能性消化不良組在門水平占比最高的細(xì)菌，奈瑟菌屬是屬水平占比最高的細(xì)菌。

奈瑟菌屬與消化道疾病關(guān)系密切。有研究發(fā)現(xiàn)，Hp陽性的上消化道疾病患者(包括胃潰瘍、非潰瘍性消化不良、反流性食管炎等)胃黏膜中除Hp外，主要的細(xì)菌為奈瑟菌屬、鏈球菌屬、羅氏菌屬及葡萄球菌屬，并且，非潰瘍性消化不良黏膜中上述細(xì)菌比胃潰瘍黏膜要高(P<0.01)，這提示了其他的細(xì)菌在非潰瘍性消化不良發(fā)病中的致病作用。Muto等[14]研究發(fā)現(xiàn)，相比于口腔中的其他細(xì)菌，奈瑟菌屬可以在加入乙醇的培養(yǎng)基中產(chǎn)生大量的乙醛。長期積累的乙醛可能影響上呼吸道及消化道的上皮細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。另外，V?kev?inen等[15]發(fā)現(xiàn)胃中的胃酸缺乏時(shí)，某些細(xì)菌(主要為奈瑟菌屬及羅氏菌屬)產(chǎn)乙醛的量增多，而乙醛是已知的致癌物質(zhì)，因此，菌群的改變可能與胃酸缺乏的人上消化道的腫瘤發(fā)生有關(guān)。

胃內(nèi)的細(xì)菌組成部分來源于口腔，奈瑟菌屬屬于人體口腔內(nèi)的正常菌群，一般認(rèn)為是無害的，但在特殊情況下(如長期酗酒)也可能對(duì)人體產(chǎn)生不利的影響。盡管功能性消化不良是一種功能性疾病，但這對(duì)指導(dǎo)患者的生活習(xí)慣也有一定的意義。此外，某些患者可能長期服用抗酸藥/抑酸藥[16]，可能導(dǎo)致胃酸缺乏，因此，這對(duì)臨床用藥也有一定的指導(dǎo)意義。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FD患者的唾液菌群結(jié)構(gòu)與健康人不同，有其特征性的細(xì)菌組成，以變形菌門為主。并且，奈瑟菌屬在FD唾液屬水平中占比最高，且為兩組間有差異性的細(xì)菌之一，其對(duì)FD的發(fā)病及治療等方面可能有重大意義。但此研究尚存在許多不足之處。首先，樣本量較少，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)本研究所得結(jié)論。其次，未將功能性消化不良進(jìn)行分型后檢測(cè)其各自菌群變化，可在后續(xù)研究中繼續(xù)細(xì)化，這對(duì)臨床的診斷及治療等方面更有意義。

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Analysis on saliva microbiome in patients with functional dyspepsia*

Chen Yu1,Liu Wanwei2,Li Liangfang2,Cen Rongying2,Nie Shengli2,Lu Yanxian1,2,Li Ruifeng1,2,Li Zijun1,2△

(1.Southern Medical Universtiy，Guangzhou，Guangdong 510515，China；2.Guangdong Provincial People′s Hospital/Guangdong Academy of Medical Sciences ，Guangzhou，Guangdong 510080，China)

[Abstract] Objective To analyze the difference of salivary microbiome between the patients with functional dyspepsia and healthy controls.Methods Saliva samples were collected from the patients with functional dyspepsia and healthy control.Genomic DNA of the samples was extracted,and the high-throughput sequencing technology was used to conduct DNA sequence of 16S rRNA-V4 region.Subsequently,all the data were performed by the bioinformatic analysis.Results The salivary microbiome in the functional dyspepsia group was dominated by Proteobacteria,while Bacteroidetes was the top microbiota in the heathy control group.In the functional dyspepsia group,the Chao1 index,ACE index,Shannon index and Simpson index were 1 295,1 351,4.93 and 0.90 respectively.In the healthy control group,the above indexes were 1 001,1 351,5.28 and 0.92 respectively.The PCoA basically separated the microbiome composition of the two groups.Sixteen kinds of microbiota were significantly different between two groups using linear discriminant analysis effect size tool,including Bacteroidetes,Prevotella,Prevotellaceae,Neisseria,Betaproteobacteria and Proteobacteria,etc.Conclusion Saliva in the patients with functional dyspesia has characteristic microbiome composition,which is dominated by Proteobacteria,but the richness and diversity between the two groups have no difference.Neisseria is one of the significantly different bacteria between the two groups.

functional dyspepsia；saliva；microbiome；Neisseria

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.13.020

廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B021800198)。 作者簡(jiǎn)介：陳瑜(1992-)，碩士，主要從事功能性胃腸病與微生態(tài)研究。△

，E-mail:zijunli2005@aliyun.com。

R573.5

A

1671-8348(2017)13-1789-03

2016-12-07

2017-01-25)