張金秋，朱 萍，陸敏華，董建峰，印永祥，趙 華

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市婦幼保健院病理科，江蘇無錫 214002)

論著·臨床研究

細(xì)胞免疫化學(xué)p16/Ki-67雙染結(jié)合DNA倍體分析預(yù)測HSIL的研究*

張金秋，朱 萍，陸敏華，董建峰，印永祥△，趙 華

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市婦幼保健院病理科，江蘇無錫 214002)

目的 探討DNA倍體分析聯(lián)合細(xì)胞免疫化學(xué)p16/Ki-67雙染檢測對宮頸高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)及宮頸鱗癌(SCC)的診斷價值。方法 隨機收集細(xì)胞學(xué)檢查73例，其中有少量DNA倍體異常細(xì)胞53例,DNA倍體陰性20例，通過細(xì)胞免疫化學(xué)雙染檢測p16/Ki-67結(jié)果。以病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，對比分析DNA倍體分析和DNA倍體分析聯(lián)合p16/Ki-67雙染對HSIL+的診斷價值。結(jié)果 20例DNA倍體陰性的標(biāo)本中p16/Ki-67雙染結(jié)果全部陰性。DNA倍體分析對HSIL+的陽性預(yù)測值為34.62%，DNA倍體分析聯(lián)合p16/Ki-67雙染對HSIL+的敏感性為84.62%，特異性為92.31%，陽性預(yù)測值為78.57%,陰性預(yù)測值為94.74%，明顯高于DNA倍體分析對HSIL+的陽性預(yù)測值(P<0.05)。結(jié)論 p16/Ki-67雙染可以明顯提高HSIL檢出的預(yù)測值，DNA倍體分析聯(lián)合p16/Ki-67雙染是預(yù)測HSIL+的有效方法，適合在醫(yī)療資源缺乏的地區(qū)實施。

宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變；p16/Ki-67雙染；細(xì)胞免疫化學(xué)；DNA倍體分析

宮頸癌發(fā)病率居女性惡性腫瘤的第二位，病死率居惡性腫瘤的第七位。許多因素導(dǎo)致我國宮頸癌篩查工作的第一階梯細(xì)胞學(xué)檢查不確定性、不穩(wěn)定性、不標(biāo)準(zhǔn)性，加上細(xì)胞學(xué)只具有適度的敏感性，需要其他檢測提高宮頸癌篩查有效性。近年來DNA倍體分析用來進(jìn)行宮頸癌篩查。最近國內(nèi)外大量研究顯示：腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后與腫瘤抑制基因p16及增殖細(xì)胞核抗原Ki67活性密切相關(guān)[1-2]。本文通過細(xì)胞免疫化學(xué)p16/Ki-67雙染、DNA倍體檢測和病理活檢結(jié)果探討細(xì)胞免疫化學(xué)p16/Ki-67雙染在預(yù)測宮頸高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年無錫市婦幼保健院病理科行細(xì)胞學(xué)DNA倍體檢測結(jié)果中可見DNA倍體異常細(xì)胞且具有活檢結(jié)果53例，年齡21～68歲，中位年齡40.5歲。同期選擇細(xì)胞學(xué)DNA倍體檢測陰性20例，年齡22～60歲，中位年齡40歲。

1.2 DNA倍體檢測 所有DNA染色片由南京福怡科技發(fā)展有限公司全自動細(xì)胞DNA定量分析系統(tǒng)(SPICM-DNA型全自動細(xì)胞腫瘤篩查分析系統(tǒng))進(jìn)行掃描。每張玻片掃描5 000個以上細(xì)胞核，系統(tǒng)根據(jù)不同細(xì)胞核所具有的不同參數(shù)特征進(jìn)行計數(shù)和分類。結(jié)果分為：(1)未見DNA倍體異常細(xì)胞；(2)少量DNA倍體異常細(xì)胞：出現(xiàn)1～2個病變細(xì)胞(DI)>2.5的異倍體細(xì)胞或5%～10%的細(xì)胞1.252.5的異倍體細(xì)胞或超過10%的細(xì)胞1.25

1.3 病理活檢結(jié)果判斷 按2014年WHO《女性生殖器官腫瘤分類》標(biāo)準(zhǔn)分級，分宮頸炎、宮頸低級別鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)、HSIL、宮頸鱗癌(SCC)。以HSIL及以上病變稱為HSIL +認(rèn)為組織學(xué)陽性。

1.4 細(xì)胞學(xué)p16/Ki-67雙染方法 細(xì)胞學(xué)p16/Ki-67雙染試劑盒購置福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。細(xì)胞薄片置于95%乙醇中固定30 min，流水沖洗1 min。(1)對標(biāo)本進(jìn)行EDTA8.0 95 ℃熱修復(fù)20 min。(2)滴加過氧化物酶室100 μL，室溫孵育10 min。(3)滴加組合p16抗體、Ki-67抗體的一抗100 μL，室溫孵育60 min。(4)滴加顯色劑AP-RED 100 μL，室溫孵育20 min。(5)滴加顯色劑DAB 100 μL，室溫孵育5 min。(6)蘇木素襯染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.5 細(xì)胞學(xué)p16/Ki-67雙染檢測結(jié)果判斷 p16定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)上，呈紅色；Ki-67定位在細(xì)胞核上，呈黃色；細(xì)胞核部分交叉反應(yīng)呈棕褐色。陽性結(jié)果是指染色片中出現(xiàn)一個或一個以上的“雙染細(xì)胞”?！半p染細(xì)胞”是指一個染色細(xì)胞，其細(xì)胞質(zhì)呈紅色同時細(xì)胞核呈黃色或棕褐色。陰性結(jié)果是指染色片中無“雙染細(xì)胞”，但可以有或沒有“單染細(xì)胞”?！皢稳炯?xì)胞”一個染色細(xì)胞，僅細(xì)胞質(zhì)呈紅色而細(xì)胞核無黃色或棕褐色著色，或細(xì)胞核呈黃色或棕褐色而細(xì)胞質(zhì)無紅色顯色的狀態(tài)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 利用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

73例宮頸細(xì)胞學(xué)DNA倍體分析結(jié)果顯示，20例宮頸細(xì)胞學(xué)DNA倍體檢測陰性，53例宮頸細(xì)胞學(xué)DNA倍體檢測為可見少量DNA倍體異常細(xì)胞，組織活檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)宮頸炎16例、LSIL 18例、HSIL 13例、SCC 5例。檢測HSIL+的陽性預(yù)測值為33.96%。

20例宮頸細(xì)胞學(xué)DNA倍體檢測陰性病例中P16/Ki-67雙染檢測結(jié)果全部陰性，因DNA倍體檢測陰性沒有做宮頸活檢，認(rèn)為是宮頸正常。53例DNA倍體檢測可見少量DNA倍體異常細(xì)胞病例中因有1例細(xì)胞學(xué)重新制片檢測時細(xì)胞學(xué)中無病變細(xì)胞故剔除不計在內(nèi)，52例病例中有14例P16和Ki-67雙染陽性，14例P16和Ki-67雙染陽性病例中活檢結(jié)果HSIL+11例，LSIL 3例。

DNA倍體聯(lián)合p16/Ki-67雙染檢測對HSIL+的敏感性84.62%，特異性92.31%，陽性預(yù)測值78.57%,陰性預(yù)測值94.74%。與DNA倍體檢測對HSIL+的陽性預(yù)測值相比，DNA倍體聯(lián)合p16/Ki-67雙染檢測可明顯提高HSIL+的陽性預(yù)測值(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 p16/Ki67雙染結(jié)果與宮頸高級別病變比較

A：p16/Ki-67雙染陰性；B：p16/Ki-67雙染陽性。

圖1 p16/Ki-67雙染在宮頸細(xì)胞學(xué)上的表達(dá)

3 討 論

目前在很多發(fā)達(dá)國家所沿用的常規(guī)細(xì)胞學(xué)或巴氏檢查被證實能有效降低宮頸癌的發(fā)病率和病死率。超過99%的宮頸癌與高危型人乳頭狀病毒(HR-HPV)相關(guān)[4]。HPV檢測有很高的陰性預(yù)測值，HPV陰性的婦女在5～7年內(nèi)不會發(fā)展為宮頸癌，因為有非?？尚诺淖C據(jù)顯示從最初感染HPV到宮頸癌至少需要8年時間[5]。文獻(xiàn)報道認(rèn)為6個月后重復(fù)檢測細(xì)胞學(xué)只發(fā)現(xiàn)少數(shù)HSIL，其中28%的HSIL HPV持續(xù)感染最終診斷，認(rèn)為通過重復(fù)檢查細(xì)胞學(xué)或HPV檢測在減少陰道鏡方面缺乏有效性[6]。需要增加新的檢測方法提高宮頸高級別病變檢出率。

目前為了對抗宮頸癌及其癌前病變，幾種輔助診斷方法已經(jīng)應(yīng)用于提高細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)診斷的準(zhǔn)確度。有癌變趨勢或已經(jīng)癌變的細(xì)胞核酸異常增生，核酸改變早于細(xì)胞形態(tài)改變，定量分析細(xì)胞內(nèi)DNA核酸是否改變和改變多少可以直接判斷是否異常。由于遺傳不穩(wěn)定性引起染色體的非整倍性已公認(rèn)為腫瘤形成的主要事件，通過圖像檢測DNA倍體可能是腫瘤形式的標(biāo)記物[7]。

DNA倍體檢測認(rèn)為是用來預(yù)測宮頸癌前病變的一線主觀診斷的方法。當(dāng)然DNA非整倍體宮頸上皮異常對于每個病人而言，不足以預(yù)測臨床預(yù)后[8]。DNA倍體分析預(yù)測宮頸高級別鱗狀上皮內(nèi)病變的敏感度為78.26%，陽性預(yù)測值為33.33%[9]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)DNA倍體分析預(yù)測HSIL+的陽性預(yù)測值為33.96%。有文獻(xiàn)報道常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢測預(yù)測HSIL+的陽性預(yù)測值是35.2%，DNA倍體檢測的陽性預(yù)測值是65.9%[10],結(jié)果不一致可能與選擇標(biāo)本、例數(shù)多少有關(guān)。

細(xì)胞學(xué)診斷是形態(tài)學(xué)檢測，因形態(tài)變化缺少客觀的判斷標(biāo)準(zhǔn)，造成診斷結(jié)果重復(fù)性不好。最近研究已證實p16和Ki-67的表達(dá)均與HR-HPV感染相關(guān)[11-12]。目前p16單染和或Ki-67單染已應(yīng)用于組織學(xué)宮頸鱗狀上皮病變輔助診斷中，但需要與組織形態(tài)學(xué)和染色方式結(jié)合鑒別鱗狀上皮是病變還是化生、反應(yīng)性改變或萎縮性改變。以往細(xì)胞學(xué)上研究大多是p16單染和或Ki-67單染進(jìn)行評估，結(jié)果欠佳。有文獻(xiàn)報道，p16過表達(dá)提示經(jīng)HPV E7癌蛋白激活，但p16也表達(dá)在非異常的細(xì)胞上，p16只可能作為CINⅠ級的預(yù)后因子[13]。也有相反的報道，使用p16染色用于裁定女性生殖道下段及肛門標(biāo)本上可能會更準(zhǔn)確預(yù)測病變級別，避免不必要的切除治療[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，p16不僅僅局限于表達(dá)在異常細(xì)胞上，也部分表達(dá)在正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞、柱狀細(xì)胞和化生細(xì)胞中。

最近一個重要的生物標(biāo)記物觀點，報道在宮頸細(xì)胞學(xué)標(biāo)本上檢測p16/Ki-67雙標(biāo)蛋白表達(dá)。p16過表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，Ki-67作為通過HPV轉(zhuǎn)化感染介導(dǎo)細(xì)胞周期調(diào)控的代替標(biāo)記物[15]。在一個細(xì)胞上p16/Ki-67雙陽可以作為通過HPV基因蛋白調(diào)控細(xì)胞周期的標(biāo)記物，可能是HPV轉(zhuǎn)化感染的標(biāo)記物[16]。Solares等[17]報道，對130例最初的陰道鏡檢查正常的病例隨訪1年發(fā)現(xiàn)，有9例發(fā)生宮頸鱗狀上皮病變或高級別病變，這9例病例中2/3的病例中最初p16/Ki-67雙標(biāo)陽性。最新文獻(xiàn)顯示，p16/Ki-67雙標(biāo)在HSIL+的陽性預(yù)測值明顯高于HPV的陽性預(yù)測值[18]。本文的研究數(shù)據(jù)表明，p16/Ki-67雙標(biāo)檢測在DNA倍體陽性標(biāo)本中敏感性84.62%，特異性92.31%，陽性預(yù)測值78.57%，陰性預(yù)測值94.74%。 p16/Ki-67雙標(biāo)具有重要的臨床意義，p16/Ki-67雙陽性可明顯提高預(yù)測宮頸高級別鱗狀上皮內(nèi)病變，與Donà等[16]的報道相符。當(dāng)然也存在一定的假陽性率和假陰性率，目前仍然沒有一個抗體可以100%預(yù)測細(xì)胞的惡性潛能[19]。

通過p16/Ki-67雙染，陽性記數(shù)獨立于細(xì)胞形態(tài)學(xué)。P16作為宮頸鱗狀上皮病變的早期事件，而Ki-67在宮頸鱗狀上皮病變進(jìn)展中持續(xù)存在[20]。盡管目前在重復(fù)細(xì)胞學(xué)制片中存在少數(shù)病例中無陽性特征細(xì)胞，筆者有理由認(rèn)為有可重復(fù)性的細(xì)胞學(xué)制片的基礎(chǔ)上，在DNA倍體分析的基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行p16/Ki-67雙染可以減少一過性感染造成的假陽性，可明顯提高宮頸高級別鱗狀上皮內(nèi)病變檢出的預(yù)測值，減少了陰道鏡和宮頸活檢創(chuàng)傷性檢查、不必要的患者心理壓力和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，特別在細(xì)胞學(xué)醫(yī)師缺乏、醫(yī)療資源缺乏的地區(qū)實施。細(xì)胞免疫化學(xué)p16/Ki-67雙染有可能成為實現(xiàn)宮頸細(xì)胞學(xué)精準(zhǔn)篩查的有效輔助方法之一。

[1]文華清，耿源源，蔡金鳳，等．p16和Ki-67蛋白在宮頸上皮內(nèi)瘤變中的臨床意義[J]．臨床腫瘤學(xué)雜志，2010，15(7)：613-616．

[2]Barber BR,Biron VL,Klimowicz AC,et al.Molecular predictors of locoregional and distant metastases in oropharyngeal squamous cell carcinoma[J].J Otolaryngol Head Neck Surg,2013,42(1):53.

[3]朱曉娟，趙華，詹惠英．DNA倍體分析在宮頸病變篩查中的應(yīng)用[J]．南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2013，33(9)：1294-1296．

[4]Walboomers JM,Jacobs MV,Manos MM,et al.Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide[J].J Pathol,1999,189(1):12-19.

[5]Liebrich C,Brummer O,Von Wasielewski R,et al.Primary cervical cancer truly negative for high-risk human papillomavirus is a rare but distinct entity that can affect virgins and young adolescents[J].Eur J Gynaecol Oncol,2009,30(1):45-48.

[6]Luyten A,Scherbring S,Reinecke-Lüthge A,et al.Risk-adapted primary HPV cervical cancer screening project in Wolfsburg,Germany--experience over 3 years[J].J Clin Virol,2009,46(Suppl 3):S5-10.

[7]B?cking A,Nguyen VQ.Diagnostic and prognostic use of DNA image cytometry in cervical squamous intraepithelial lesions and invasive carcinoma[J].Cancer,2004,102(1):41-54.

[8]Reich O,Ballon M.DNA cytometry as a first-line method for diagnosis of cervical precancer with respect to clinical behaviour[J].Eur J Gynaecol Oncol,2010,31(4):372-374.

[9]林丹，羅新，蔣學(xué)風(fēng)，等.DNA倍體分析聯(lián)合高危型人乳頭瘤病毒檢測篩查宮頸病變[J].實用婦產(chǎn)科雜志，2014，30(7):531-534.

[10]Grote HJ,Nguyen HV,Leick AG,et al.Identification of progressive cervical epithelial cell abnormalities using DNA image cytometry[J].Cancer Cytopathol,2004,102(6):373-379.

[11]Samir R,Asplund A,Tot T,et al.High-risk HPV infection and CIN grade correlates to the expression of c-myc,CD4+,FHIT,E-cadherin,Ki-67,and p16INK4a[J].J Low Genit Tract Dis,2011,15(4):280-286.

[12]Mimica M,Tomic S,Kardum G,et al.Ki-67 quantitative evaluation as a marker of cervical intraepithelial neoplasia and human papillomavirus infection[J].Int J Gynecol Cancer,2010,20(1):116-119.

[13]Del Pino M,Garcia S,Fusté V,et al.Value of p16(INK4a) as a marker of progression/regression in cervical intraepithelial neoplasia grade 1[J].Am J Obstet Gynecol,2009,201(5):488.

[14]Maniar KP,Sanchez B,Paintal A,et al.Role of the biomarker p16 in downgrading in 2 diagnoses and predicting higher-grade lesions[J].Am J Surg Pathol,2015,39(12):1708-1718.

[15]Petry KU,Schmidt D,Scherbring S,et al.Triaging pap cytology negative,HPV positive cervical cancer screening results with p16/Ki-67 dual-stained cytology[J].Gynecol Oncol,2011,121(3):505-509.

[16]Donà MG,Vocaturo A,Giuliani M,et al.p16/Ki-67 dual staining in cervico-vaginal cytology:correlation with histology,human papillomavirus detection and genotyping in women undergoing colposcopy[J].Gynecol Oncol,2012,126(2):198-202.

[17]Solares C,Velasco J,lvarez-Ruiz E,et al.Expression of p16/Ki-67 in ASC-US/LSIL or normal cytology with presence of oncogenic HPV DNA[J].Anticancer Res,2015,35(11):6291-6295.

[18]Bergeron C,Ikenberg H,Sideri M,et al.Prospective evaluation of p16/Ki-67 dual-stained cytology for managing women with abnormal papanicolaou cytology:PALMS study results[J].Cancer Cytopathol,2015,123(6):373-381.

[19]Fowler LJ,Lachar WA.Application of immunohistochemistry to cytology[J].Arch Pathol Lab Med,2008,132(3):373-383.

[20]Zhong P,Li J,Gu Y,et al.P16 and Ki-67 expression improves the diagnostic accuracy of cervical lesions but not predict persistent high risk human papillomavirus infection with CIN1[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(3):2979-2986.

Study on immunocytochemistry p16/Ki-67 double staining combined with DNA ploidy analysis for analyzing and predicting cervical high grade squamous intraepithelial lesion*

Zhang Jinqiu,Zhu Ping,Lu Minhua,Dong Jianfeng,Yin Yongxiang△,Zhao Hua

(Department of Pathology,Affiliated Wuxi Municipal Maternal and Child Health Care Hospital,Nanjing Medical University,Wuxi,Nanjing 214002,China)

[Abstract] Objective To investigate the diagnostic value of DNA ploidy analysis combined with immunocytochemistry p16/ki-67 double staining in cervical high grade squamous intraepithelial neoplasia(HSIL) and cervical squamous cell carcinoma(SCC).Methods A total of 73 cases of cytological tests were randomly collected.Among them,53 cases were small DNA ploidy abnormal cells and 20 cases were DNA ploidy negative.The p16/Ki-67 results were detected by immunocytochemistry double staining.With the pathological results as the golden standard,the diagnostic values of DNA ploidy analysis and DNA ploidy analysis combined with p16/Ki-67 double staining in HSIL + was contrastively analyzed by pathologic results.Results Among 20 samples of DNA ploidy negative,the p16/Ki-67 double staining results all were negative.The positive predictive value of DNA ploidy analysis for HSIL + was 34.62%.The sensitivity of DNA ploidy analysis combined with p16/Ki-67 double staining for HSIL + was 84.62%,and its specificity was 92.31%,the positive predictive value was 78.57% and the negative predictive value was 94.74%,which were significantly higher than those of DNA ploidy analysis(P<0.05).Conclusion p16/Ki-67 double staining can significantly improve the prediction value of HSIL.The DNA ploidy analysis combined with p16/Ki-67 double staining is an effective method for predicting HSIL +,which is suitable for the implementation in the areas with lack of medical resources.

cervical intra epithelial neoplasia；p16/Ki-67 double staining;immunocytochemistry;DNA ploidy analysis

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.13.014

江蘇省無錫市衛(wèi)計委婦幼健康成果技術(shù)推廣項目(FYTG2016-2)；江蘇省無錫市衛(wèi)生計生科技成果和適宜技術(shù)推廣項目(T201645)。 作者簡介：張金秋(1993-)，本科，技師，主要從事腫瘤病理方面的研究?！?/p>

，E-mail:yinyrh@sina.com。

R711.74

A

1671-8348(2017)13-1770-03

2016-11-28

2017-01-16)