李恒聰，裴永峰，黃惠妮，吳國光

(廣西壯族自治區(qū)南寧中心血站/南寧輸血醫(yī)學研究所 530007)

論著·臨床研究

人類白細胞抗原A、B和DRB1測序分型模棱兩可結果的分布及解決*

李恒聰，裴永峰，黃惠妮，吳國光△

(廣西壯族自治區(qū)南寧中心血站/南寧輸血醫(yī)學研究所 530007)

目的 調查廣西人群HLA-A、B、DRB1基因測序分型中模棱兩可結果的分布狀況，提出解決方案。方法 采用聚合酶鏈反應-直接測序分型方法對1 000名中華骨髓庫廣西分庫供者的HLA-A、B、DRB1基因進行測序分型，分析3個基因座模棱兩可分型結果的分布情況，并分別采用高分辨聚合酶鏈反應-序列特異性引物法和組特異性測序引物法進行解決。結果 1 000份標本中，96.7%的標本HLA-A、B、DRB1基因至少有1個位點出現(xiàn)模棱兩可結果，其中HLA-A、B、DRB1各位點出現(xiàn)模棱兩可結果的比例分別為65.7%、58.8%、77.2%。對于檢出的模棱兩可結果標本，單獨采用組特異性測序引物法可以解決87.37%HLA-A、93.54%HLA-B和60.49%的HLA-DRB1基因模棱兩可分型結果，使用高分辨聚合酶鏈反應-序列特異性引物法解決12.63% HLA-A、4.76%HLA-B和15.29%HLA-DRB1基因模棱兩可分型結果，剩余1.70%HLA-B和24.22%的HLA-DRB1基因模棱兩可分型結果聯(lián)合使用組特異性測序引物法和高分辨聚合酶鏈反應-序列特異性引物法解決。結論 組特異性測序引物法和高分辨聚合酶鏈反應-序列特異性引物法分別對位于HLA-A、B和HLA-DRB1基因檢測區(qū)內、外的模棱兩可分型結果具有較高的解決能力，二者互為補充，可有效解決HLA高分辨基因分型結果模棱兩可問題。

人類白細胞抗原；模棱兩可；高分辨聚合酶鏈反應-序列特異性引物法；組特異性測序引物法

人類白細胞抗原(HLA)是迄今所知人類最復雜的免疫遺傳多態(tài)性系統(tǒng)，并具有顯著的種族特性。準確的HLA分型技術和分型數(shù)據(jù)，已被廣泛用于器官和造血干細胞移植中尋找HLA相匹配的供者、HLA與疾病相關性的研究等應用領域。HLA-A、B、DRB1基因是造血干細胞移植中的3個最重要功能基因，供受者間HLA等位基因的配合程度與移植效果密切相關，精確的HLA分型有助于提高移植療效[1-2]。近年來隨著基因測序儀的普及和臨床移植配型的要求，聚合酶鏈反應-直接測序分型法(PCR-SBT)在大規(guī)模HLA高分辨率分型工作中逐漸被廣泛采用[3]。但與其他分型方法一樣，PCR-SBT并非完美，其中一個固有的問題是在分型判斷時存在較高比例的模棱兩可組合的結果[4]，給HLA分型數(shù)據(jù)的精確判斷帶來了很大程度的困擾。

本文通過調查廣西壯族自治區(qū)人群的HLA-A、B、DRB1基因直接測序分型中的模棱兩可結果的分布狀況，采用高分辨率聚合酶鏈反應-序列特異性引物法(PCR-SSP)和組特異性測序引物法(GSSP)[5]分別解決兩類模棱兩可分型結果，探討HLA直接測序分型模棱兩可分型結果的解決方案。

1 材料與方法

1.1 標本來源 1 000名造血干細胞捐獻者乙二胺四乙酸鹽抗凝血液各5 mL，全部來自中華骨髓庫廣西分庫，所有供者按照中華骨髓庫要求簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 Gene Amp 9700型PCR擴增儀(美國ABI公司)；3730型基因測序儀(美國ABI公司)。DNA提取試劑盒(批號：139309879)購自美國Qiagen公司；HLA-A、B和DRB1基因的SBT分型試劑(批號：A位點1022134，B位點1034372，DRB1位點1037946)購自美國Invitrogen公司；高分辨聚合酶鏈反應-序列特異性引物法分型試劑(批號：1263281)購自美國Invitrogen公司；組特異性測序引物法引物(批號：1263282)購自美國Invitrogen公司。

1.3 基因組DNA制備 采用DNA提取試劑盒從全血中提取制備基因組DNA，調節(jié)DNA濃度為40～50 ng/μL，純度(A260/A280值)要求在1.65～1.80，置-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 HLA-A、B、DRB1基因的直接測序分型 常規(guī)檢測HLA -A、B基因的第2～4外顯子、HLA-DRB1基因的第2外顯子，PCR擴增嚴格按照HLA測序試劑盒說明書操作。PCR擴增產物采用ExoSAP-IT酶進行純化，去除多余的游離PCR引物和底物dNTPs。測序反應產物采用乙醇/醋酸鈉/EDTA沉淀法。經純化后的測序反應產物于ABI PrisTM3730型基因測序儀電泳檢測并收集電泳后的序列數(shù)據(jù)信息。電泳后的序列數(shù)據(jù)信息導入HLA SBT uTYPE 6.1(Life Tech)分析軟件，分析受檢者HLA等位基因型。

1.5 模棱兩可結果解決 對于常規(guī)檢測區(qū)內(HLA-A、B檢測第2～4外顯子，HLA-DRB1檢測第2外顯子)的模棱兩可結果，用GSSP進行鑒定，按照試劑盒說明書操作。對于常規(guī)檢測區(qū)外的模棱兩可結果，用高分辨PCR-SSP方法進行鑒定，按照試劑盒說明書進行操作；擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，特異性陽性條帶與說明書的陽性條帶圖譜比對，確定分型結果。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用直接計數(shù)法，統(tǒng)計HLA-A、B、DRB1位點模棱兩可結果的種類及比例。

2 結 果

2.1 HLA-A、B、DRB1基因直接測序分型模棱兩可結果分布 1 000份標本HLA-A、B、DRB1基因直接測序分型結果顯示：96.7%的標本其HLA-A、B、DRB1基因至少有1個位點出現(xiàn)模棱兩可結果。從單個HLA位點來看，HLA-A、B、DRB1位點模棱兩可結果的比例分別為65.7%、58.8%、77.2%，見表1。

表1 HLA-A、B、DRB1基因直接測序分型模棱兩可結果分布

-：模棱兩可結果，+：無模棱兩可結果。

2.2 HLA-A、B、DRB1基因的直接測序模棱兩可分型結果的種類分布 根據(jù)產生模棱兩可分型結果的堿基序列是否在常規(guī)檢測區(qū)內將所有模棱兩可分型結果分為3類：檢測區(qū)內、檢測區(qū)外和兩種情況并存。657個HLA-A、588個HLA-B、772個HLA-DRB1模棱兩可結果的分類分布情況見表2。HLA-A、B、DRB1基因檢測區(qū)內的模棱兩可比例都高于檢測區(qū)外。

表2 HLA-A、B、DRB1基因模棱兩可的種類分布情況[n(%)]

2.3 HLA-A、B、DRB1基因測序分型模棱兩可結果解決 組特異性測序引物法分型結果顯示：位于檢測區(qū)內的模棱兩可分型標本574個HLA-A，559 個HLA-B和652個HLA-DRB1采用1～3個組特異性測序引物分離法引物均獲得清晰分離結果。說明組特異性測序引物法解決此類模棱兩可結果的能力較強(超過了99%)，見表3。但有個別模棱兩可等位基因組合，如B*38:02 B*57:01 /B*38:08 B*57:43由于現(xiàn)有組特異性測序引物法無法解決，采用高分辨聚合酶鏈反應-序列特異性引物法予以解決。

表3 組特異性測序引物法解決模棱兩可結果[n(%)]

高分辨聚合酶鏈反應-序列特異性引物法分型結果：83例HLA-A，38例HLA-B，305例HLA-DRB1模棱兩可標本通過PCR-SSP解決了檢測區(qū)外的模棱兩可(表4)，但其中有10例HLA-B，187例HLA-DRB1因同時還存在檢測區(qū)內模棱兩可，還使用了組特異性測序引物法來予以解決。

表4 檢測區(qū)外模棱兩可等位基因的PCR-SSP分型結果

3 討 論

HLA基因測序分型技術是HLA基因分型的金標準，被公認為器官移植前和造血干細胞移植前HLA高分辨配型的最佳方法。供受者間HLA高分辨水平匹配相合程度對移植效果具有顯著影響[1-2]，精確的HLA分型有助于提高移植療效。

HLA模棱兩可等位基因組合按形成原因主要分為兩種：(1)常規(guī)檢測區(qū)序列完全相同，差異堿基在常規(guī)檢測區(qū)外導致(常規(guī)檢測區(qū)外模棱兩可)；(2)由于PCR產物的雜合性，有時不同等位基因的組合可得到相同的雜合子序列，即檢測區(qū)內雜合序列一致(檢測區(qū)內模棱兩可)[6]。目前用于解決HLA基因分型模棱兩可的方法有主要有PCR-SSP法、GSSP、GSA[7-8]、基因克隆測序法[9]、單倍型分離法[10]、焦磷酸測序法[11]、參照鏈介導構象分析法(RSCA)[12]等實驗性方法，此外還有非實驗性的統(tǒng)計學方法[13]。

本文對1 000名廣西人群HLA-A、B、DRB1的直接測序分型結果顯示，僅有3.3%的標本未出現(xiàn)模棱兩可分型結果，96.7%的標本至少有1個位點出現(xiàn)模棱兩可結果，表明PCR-SBT方法存在較高比例的模棱兩可分型結果。HLA-A、B、DRB1位點模棱兩可結果的比例分別為65.7%、58.8%、77.2%，其中HLA-A，BDRB1位點的檢測區(qū)范圍內的模棱兩可比例(87.37%，93.54%，60.49%)明顯高于檢測區(qū)外(12.63%，4.76%，15.29%)。

組特異性測序引物法是一種簡單快捷、準確可靠、易實現(xiàn)高通量的解決模棱兩可分型結果的方法。本文數(shù)據(jù)顯示其解決位于檢測區(qū)內的模棱兩可分型結果的能力達到99%，總體能解決87.37%的HLA-A基因，93.37%B基因和60.23%的HLA-DRB1基因的模棱兩可分型結果，因此需要采用聚合酶鏈反應-序列特異性引物法等其他方法來補充。

PCR-SSP從理論上可以解決所有的模棱兩可分型結果，但該方法本身存在如引物設計工作量大、難以實現(xiàn)高通量等明顯缺點，使其難以作為大規(guī)模分型實驗中解決模棱兩可分型結果的主要方法，但可作為輔助方法少量應用，以彌補其他方法的不足。其他如組特異性擴增法存在未能解決同個擴增組內的模棱兩可、實驗工作量大等缺點，而基因克隆測序法、單倍型分離法等方法操作更為繁瑣，部分存在與聚合酶鏈反應-序列特異性引物法相同的缺點，難以作為解決模棱兩可分型結果的常規(guī)方法。

綜上所述，在HLA-A、B、DRB1基因測序分型中，存在較高比例的模棱兩可分型結果，影響了分型結果的準確性。GSSP和PCR-SSP分別對HLA-A、B和HLA-DRB1基因的模棱兩可分型結果具有較高的解決能力，兩種方法互為補充、共同發(fā)揮作用，可較好解決基因測序分型模棱兩可問題，為臨床移植配型和骨髓庫供者分型提供更好的技術保障。

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Ambiguity results distribution and its solutions of HLA-A,B and DRB1 sequence-based typing*

Li Hengcong,Pei Yongfeng,Huang Huini,Wu Guoguang△

(Nanning Blood Center /Nanning Institute of Transfusion Medicine,Nanning,Guangxi 530007,China)

[Abstract] Objective To investigate the ambiguity results distribution of HLA-A,B and DRB1 gene sequence-base typing in Guangxi population and to propose the way to resolve.Methods HLA-A,B and DRB1 genes of 1 000 donors in the Guangxi branch bank of China′ bone marrow bank were genotyped by PCR-SBT,and then the ambiguity results distribution of the three loci was analyzed.The typing ambiguities results were resolved by high-resolution polymerase chain reaction- sequence-specific primers(PCR-SSP) and group specific sequencing primer(GSSP) methods,respectively.Results Among 1 000 samples,at least 1 locus in HLA-A,B and DRB1 genes in 96.7% samples appeared the ambiguity results,in which the proportions of HLA-A,B and DRB1 loci appearing ambiguity results were 65.7%,58.8% and 77.2% respectively.For the samples of detected ambiguity results,single using the GSSP method could resolve the ambiguity typing results of 87.37% HLA-A,93.54% HLA-B and 60.49% HLA-DRB1,using high-resolution PCR-SSP could resolve the ambiguity typing results of 12.63% HLA-A,4.76% HLA-B and 15.29%HLA-DRB1,and the rest 1.70%HLA-B and 24.22%HLA-DRB1 ambiguity results were resolved by both GSSP and high-resolution PCR-SSPs method.Conclusion GSSP and high-resolution PCR-SSPs methods have high abilities to solve HLA ambiguity results both locate inside and outside the sequencing region,respectively.GSSP and high-resolution PCR-SSPs methods are supplement for each other,which can effectively resolve the problem of ambiguity results in high resolution HLA typing.

HLA antigens;ambiguity;high-resolution polymerase chain reaction-sequence-specific primers;group specific sequencing primer

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.13.010

廣西壯族自治區(qū)南寧市科學研究與技術開發(fā)計劃項目(201003048C-3)，廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳科技研究計劃項目(Z2010198)。 作者簡介：李恒聰(1979-)，碩士，助理研究員，主要從事輸血醫(yī)學研究。△

，E-mail:guangwu@szonline.net。

R446.1

A

1671-8348(2017)13-1759-03

2016-12-03

2017-01-21)