李 強(qiáng)，楊成明

(1.重慶市南川區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科 408400；2.第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所大坪醫(yī)院心內(nèi)科 400042)

論著·基礎(chǔ)研究

原花青素B2保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞延緩凋亡及機(jī)制研究

李 強(qiáng)1，楊成明2△

(1.重慶市南川區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科 408400；2.第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所大坪醫(yī)院心內(nèi)科 400042)

目的 以H2O2誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞凋亡為模型，觀察原花青素B2(GSPB2)延緩人內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 用0.5 mmol H2O2預(yù)處理細(xì)胞，分別加入不同濃度的GSPB2(5.0、10.0、20.0 μmol/L)保護(hù)細(xì)胞，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡；Western blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)分子Caspase-3、Bax、Bcl-2以及影響凋亡的相關(guān)分子PI3K、p-Akt、Akt的蛋白表達(dá)；Transwell小室檢測(cè)各組細(xì)胞遷移情況。結(jié)果 0.5 mmol H2O2致人內(nèi)皮細(xì)胞凋亡明顯增加(P<0.01)，GSPB2能明顯減輕H2O2所致的人內(nèi)皮細(xì)胞凋亡(P<0.05)，10 μmol/mL的GSPB2就能接近恢復(fù)到H2O2未處理的對(duì)照組水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：Caspase-3、bax蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)；PI3K、p-Akt、Akt表達(dá)上調(diào)。結(jié)論 不同濃度的GSPB2對(duì)H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，而且表現(xiàn)為濃度依賴性和時(shí)間依賴性，其機(jī)制與相關(guān)分子PI3K、p-Akt、Akt有關(guān)。

原花青素B2；凋亡；血管內(nèi)皮細(xì)胞

心血管疾病的發(fā)病率和病死率在所有疾病中是最高的，血管內(nèi)皮細(xì)胞分布廣，極易受到多種因素的影響，其中，氧化與抗氧化對(duì)弈、凋亡與抗凋亡的矛盾，都發(fā)生在血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而與心血管疾病相關(guān)聯(lián)。原花青素(grape seed proanthocyanidins,GSPs)廣泛存在于水果、蔬菜、花、堅(jiān)果、種子和樹(shù)皮中，是一類多羥基黃烷-3-酚的低聚物，也有以高聚物形式存在的酚類化合物，原花青素與縮合單寧是同系物，是多羥基黃烷-3-酚的寡聚或高聚物，大多以C4→C8鍵相互連接，也存在C4→C6鍵連接[1]。具有抗氧化、清除自由基、心血管保護(hù)、抗炎、抗血小板聚集、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂、抗高血壓、抑制細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)肝臟、抑制細(xì)胞凋亡以及抗疲勞、改善睡眠等廣泛的生物活性,且具有高效、低毒、生物利用度高等特點(diǎn)[2-5]。研究發(fā)現(xiàn)：Bax/Bcl-2蛋白和半胱天冬酶-3活化與GSP處理誘導(dǎo)的凋亡現(xiàn)象間有所關(guān)聯(lián)[6]。因此，探討原花青素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 原花青素B2(GSPB2)(貨號(hào)B10957)，標(biāo)準(zhǔn)品大于或等于98%，購(gòu)自上海士鋒生物科技有限公司；H2O2DMSO購(gòu)自Sigma公司，小鼠抗人caspase-3、 抗人BCL-2 、抗人bax、抗人akt、抗人 p-akt、抗人PI3K單抗均購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。Tulne試劑盒購(gòu)自羅氏公司，一次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶(25 cm2、75 cm2)細(xì)胞培養(yǎng)板等購(gòu)自Coster公司。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自Shellab公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司；電子天平(Thermo Scientific)、酶標(biāo)儀、電泳儀購(gòu)自Bio-Rad公司；純水制備系統(tǒng)購(gòu)自Millipore公司；pH計(jì)購(gòu)自上海大普儀器有限公司；光學(xué)顯微鏡及其成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司；搖床、組化筆、小型染色缸、濕盒(塑料飯盒與紗布)、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規(guī)格的移液器及槍頭等。

1.2 主要溶液配制方法 (1)GSPB2溶液：用DMSO直接溶解粉狀的GSPB2至終濃度為40 mmd/L，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?2)10%FBS的DMEM/H細(xì)胞完全培養(yǎng)基：于500 mL裝的DMEM/H培養(yǎng)液中加入青霉素與鏈霉素使其終濃度都為100 U/mL，于4 ℃保存。使用前與胎牛血清以9∶1的比例混合，4 ℃保存待用。(3)PBS溶液：將PBS緩沖體系(粉末)充分溶于超純水，配制成1×PBS緩沖液，分裝后高溫高壓滅菌。(4)0.25%胰酶：稱取0.25 g胰蛋白酶和0.02 g乙二胺四乙酸(EDTA)，溶解于100 mL PBS緩沖液中，充分?jǐn)嚢杌靹颍? ℃放置過(guò)夜后于超凈工作臺(tái)用一次性過(guò)濾器過(guò)濾除菌，4 ℃保存。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株CRL-2932細(xì)胞購(gòu)自ATCC公司。用含有10%胎牛血清的DMEM/H的完全培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2且濕度飽和的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%～95%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。

1.3.1 分組 (1)空白對(duì)照組,換無(wú)血清DMEM/H繼續(xù)培養(yǎng)；(2)H2O2組，換無(wú)血清DMEM/H培養(yǎng)基2 h后，加入終濃度為1 mmol/L的H2O2培養(yǎng)24 h。(3)GSPB2+H2O2組，換無(wú)血清培養(yǎng)基，不同濃度的GSPS(5.0、10.0、20.0 μmol/L)預(yù)處理2 h后加H2O2孵育24 h。但是免疫印跡選用的時(shí)間為24 h，GSPB2的濃度為10.0 μmol/L。

1.3.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞的存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，接種于96孔板(每孔接2 000個(gè)細(xì)胞)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)條件培養(yǎng)過(guò)夜，按分組要求給予不同因素的處理，每組設(shè)8個(gè)平行孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用分光光度計(jì)在540 nm出讀取光度值(OD)，取其8孔的平均值按公司計(jì)算細(xì)胞的存活率，細(xì)胞的存活率(%)=處理組OD/對(duì)照組×100%。

1.3.3 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞的凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞，消化成為細(xì)胞懸液，1×105個(gè)細(xì)胞/每孔接種于24孔板中，24孔板內(nèi)放入細(xì)胞爬片，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)條件培養(yǎng)過(guò)夜，按分組要求給予不同因素的處理，培養(yǎng)24 h后。PBS洗3次-4%多聚甲醛固定-PBS洗3次-0.3%triton-100透化細(xì)胞-PBS洗3次-滴加TUNEL反應(yīng)物，37 ℃孵育60 min-沖洗樣品5～20 min-用抗熒光碎滅封片劑封片，熒光顯微鏡拍照分析結(jié)果。

1.4 免疫印跡檢測(cè)Caspase-3、Bax、Bcl-2、PI3K、p-Akt、Akt蛋白表達(dá) 提取各組CRL-2932細(xì)胞的總蛋白，用BCA法測(cè)定各組細(xì)胞蛋白的含量，每孔上樣25 μg的總蛋白，用5%積層膠和10%的分離膠電泳后，半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫用TBST配制的5%脫脂奶粉封閉1 h。分別加入人抗的總Caspase-3(1∶500稀釋)，活化的Caspase-3(1∶500稀釋)，人抗的Bax(1∶1 000稀釋)，人抗的PI3K(1∶1 000稀釋)，人抗的p-Akt(1∶1 000稀釋) 人抗的Akt(1∶1 000稀釋)，4℃過(guò)夜孵育，復(fù)溫半小時(shí)，TBST洗3次，每次10 min，加入HRP標(biāo)記的兔抗人的二抗(1∶2 000稀釋)，室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，化學(xué)發(fā)光顯影目的條帶和內(nèi)參，用Quantity Qne軟件分析光密度值，代表蛋白表達(dá)的相對(duì)含量。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞存活率 用H2O2孵育內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，明顯下降(P<0.05)，細(xì)胞的存活率僅為對(duì)照組的59.1%±1.2%。用不同濃度的GSPB2和H2O2共同孵育內(nèi)皮細(xì)胞后，細(xì)胞的存活率依次分別為：64.5%±1.8%，80.5 %±2.2%，85.4 %±1.9%。隨著GSPB2濃度增高，內(nèi)皮細(xì)胞的存活率增加，成濃度依賴性，但10.0 μmol/L和20.0 μmol/L之間對(duì)細(xì)胞的活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 10.0 μmol/L GSPB2對(duì)H2O2誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡保護(hù)作用

A:對(duì)照組；b：H2O2(0.5 mmol/L)；c：H2O2(0.5 mmol/L)+GSPB2(10 μmol/L)。

圖2 10 μmol/L GSPB2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用

2.2 GSPB2對(duì)H2O2誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響 采用TUNEL染色檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，觀察GSPB2(濃度10.0 μmol/L)保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：正常情況下細(xì)胞凋亡率為1.0%，存活率為99.0%，在濃度為1.0 mml/L的H2O2孵育24 h后，細(xì)胞的凋亡率明顯增加，為41.0%，存活率為59.0%。用濃度為10.0 μmol/L的GSPS預(yù)處理2 h后，再加H2O2孵育，在第6小時(shí)尚未見(jiàn)明顯變化，但在第12、24、48小時(shí)的凋亡率分別為：36.0%、27.0%、25.0%。第48小時(shí)與24小時(shí)的凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1。

2.3 Caspase-3、Bax、Bcl-2、PI3K 、p-Akt、Akt的蛋白表達(dá) Western bloting結(jié)果顯示：H2O2處理內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組比較，總Caspase-3的表達(dá)不變，活化的Caspase-3表達(dá)上調(diào)，用10 μmol/L的GSPB2預(yù)處理后，再加入H2O2，活化的Caspase-3表達(dá)下調(diào)(圖2E)。同時(shí)Caspase-3的下游蛋白bax上調(diào)，Bcl-2上調(diào)(圖2，A、B)。影響細(xì)胞凋亡的信號(hào)分子PI3K(圖2D)明顯增加；同時(shí)，p-Akt、Akt明顯增加(圖2C)。

3 討 論

原花青素是一種天然多酚類化合物，是由不同數(shù)量的兒茶素、表兒茶素縮合而成的聚合體，因其具有極強(qiáng)的抗氧化活性和清除自由基能力，而被廣泛應(yīng)用于保健食品、護(hù)膚品及醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域。以往的研究發(fā)現(xiàn)GSPE主要有以下作用，(1)調(diào)節(jié)血脂:GSPE能夠降低血清TC、TG、LDL水平，同時(shí)升高HDL水平，而且還能夠增加血清卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LACT)活性，調(diào)節(jié)膽固醇外流，減少膽固醇聚集，減輕泡沫細(xì)胞的聚集；(2)抗炎作用:GSPE主要通過(guò)下調(diào)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，減少單核細(xì)胞向內(nèi)膜下的遷入以及抑制類花生燒酸合成酶的基因轉(zhuǎn)錄和酶活性,抑制炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，以及對(duì)NF-kB途徑的調(diào)控等發(fā)揮其強(qiáng)大的抗炎作用,對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種急慢性炎性疾病都有很好的抗炎作用[7-9]；(3) GSPE可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡，對(duì)抗血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，抑制VSMC的增殖和遷移,發(fā)揮心血管保護(hù)效應(yīng)，能夠抑制心臟損傷時(shí)心肌細(xì)胞的凋亡等等。凋亡是由抗凋亡和促凋亡效應(yīng)分子，如Bcl-2和Bax，所組成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來(lái)調(diào)控的，Bax/Bcl-2比率升高會(huì)導(dǎo)致半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的裂解且會(huì)誘導(dǎo)凋亡過(guò)程[10-12]。體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)都證實(shí)與食物中不添加GSPs的無(wú)胸腺裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)的腫瘤內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)水平相比，GSPs可在鼠乳腺癌細(xì)胞(4T1)和人類鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞中下調(diào)Bcl-2表達(dá)的同時(shí)上調(diào)Bax的表達(dá)，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的表達(dá)水平增加。血管內(nèi)皮功能紊亂則是AS的起始環(huán)節(jié)，與CHD的發(fā)生有密切的關(guān)系[14]，因此，保護(hù)內(nèi)皮功能也已成為心血管疾病防治的重要目標(biāo)之一。

Akt可以磷酸化Caspas-9前體(ProCaspas-9)從而阻斷內(nèi)源性蛋白酶的活性，已知ProCaspas-9是Caspas級(jí)聯(lián)反應(yīng)的起始蛋白酶，Caspas-9的活化可以激活Caspas-3、Caspas-6、Caspas-7等蛋白酶，在凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起中間的轉(zhuǎn)接作用，在凋亡調(diào)控中發(fā)揮主要功能。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：不同濃度的GSPB2可以有效保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞延緩凋亡，作用的影響，而且是通過(guò)調(diào)節(jié)Akt磷酸化的方式發(fā)揮作用的[13]。

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Study on effect and mechanism of GSPB2 for protecting vascular endothelial cell and delaying apoptosis

Li Qiang1,Yang Chengming2△

(1.Department of Cardiology,Nanchuan District People′s Hospital，Chongqing 408400；2.Department ofCardiology,Daping Hospital,Third Military Medical University，Chongqing 400042,China)

[Abstract] Objective To observe the protective effect of GSPB2 for delaying the human endothelial cells apoptosis with H2O2induced human endothelial cells apoptosis as the model and to investigate its mechanism.Methods The human endothelial cells were pre-treated by 0.5 mmol H2O2,then different concentrations of GSPB2(5.0,10.0,20.0 μmol/L) was added for protecting cells.The cellular apoptosis was detected by TUNEL method;the apoptosis related molecules,such as Caspase-3,Bax,Bcl-2,and influencing apoptosis related molecules such as PI3K,p-Akt and Akt protein expression were detected by Western blot;Transwell chamber was used to detect cell migration situation.Results 0.5 mmol H2O2induced obvious increase of human endothelial cells (P<0.01).GSPB2 could significantly alleviate the H2O2induced apoptosis of human endothelial cells(P<0.05).10 μmol/mL GSPB2 could be close to return to H2O2untreated control group level.Further found that Caspase-3,Bax protein expression were up-regulaed,Bcl-2 expression was down-regulated and the expression of PI3K,p-Akt and Akt wa sup-regulated.Conclusion The different concentrations of GSPB2 has a protective effect on vascular endothelial cells induced by H2O2,moreover which manifested by the concentration and time dependence.Its mechanism is related with the related molecules PI3K,p-Akt and Akt

GSPB2;apoptosis;vascular endothelial cell

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.13.008

李強(qiáng)(1971-)，本科，副主任醫(yī)師，主要從事高血壓、冠心病的臨床診治方面的研究?！?/p>

，E-mail:yangchmi@163.com。

R54

A

1671-8348(2017)13-1753-03

2016-11-24

2017-01-12)