蘇俊波，駱文龍，郝亞寧,王德平

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，重慶 400010)

論著·基礎(chǔ)研究

超聲微泡對堿性成纖維生長因子轉(zhuǎn)染大鼠損傷面神經(jīng)的修復(fù)作用研究*

蘇俊波，駱文龍△，郝亞寧,王德平

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，重慶 400010)

目的 應(yīng)用超聲微泡介導(dǎo)堿性成纖維生長因子(bFGF)基因進(jìn)行受損面神經(jīng)(大鼠模型)修復(fù)，研究其可行性及有效性。方法 將40只SD大鼠制作面神經(jīng)損傷模型，并分成4組，每組10只；A組：bFGF+超聲+微泡組； B組：bFGF+微泡組；C組：bFGF+超聲組；D組：單純手術(shù)組(PBS)。于bFGF基因轉(zhuǎn)染后第1、10、20、28天，觀察各組大鼠一般狀況，檢測損傷面神經(jīng)傳導(dǎo)速度、潛伏期及動作電位波幅。提取損傷處面神經(jīng)組織后采用RT-PCR檢測mRNA的表達(dá)，Western blot檢測bFGF蛋白表達(dá)。結(jié)果 轉(zhuǎn)染后第20天，A組大鼠術(shù)側(cè)有少量胡須可觀察到細(xì)微擺動；轉(zhuǎn)染后第28天，A組大鼠一般狀況較B、C、D 3組恢復(fù)得更好。A組面神經(jīng)損傷后修復(fù)的神經(jīng)電生理表現(xiàn)優(yōu)于B、C、D 3組；A組bFGF mRNA和蛋白表達(dá)量明顯高于B、C、D 3組(P<0.05)。結(jié)論 超聲微泡介導(dǎo)bFGF有助于面神經(jīng)損傷的修復(fù)。

超聲微泡；堿性成纖維生長因子；面神經(jīng)損傷

面神經(jīng)是支配面部肌肉運(yùn)動的神經(jīng)，面神經(jīng)損傷后致面癱，嚴(yán)重影響美觀及患者生活質(zhì)量[1-2]。雖經(jīng)國內(nèi)外大量研究，面神經(jīng)損傷后的修復(fù)依然是臨床重要的難題?；蛑委熌軓姆肿訉用婕m正疾病的發(fā)生發(fā)展，是極富前景的治療研究熱點。堿性成纖維生長因子(bFGF)對受損面神經(jīng)具有保護(hù)作用[3]。本研究應(yīng)用超聲輻照微泡作為基因?qū)敕椒?，將bFGF基因介導(dǎo)轉(zhuǎn)染大鼠面神經(jīng)損傷的模型，觀察bFGF的表達(dá)及大鼠模型受損面神經(jīng)恢復(fù)情況，探討該方法的可行性、有效性，為面神經(jīng)損傷后修復(fù)方法提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只清潔級SD大鼠(雌雄不限)，由重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，體質(zhì)量210～240 g，合格證號：SCXK(渝)2007-0011。

1.2 試劑 脂質(zhì)微泡由重醫(yī)附二院超聲影像學(xué)研究所提供；DFGF菌液由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝病研究治療中心提供，兔抗鼠β-actin多克隆抗體、Trizol試劑、羊抗兔IgG、兔抗鼠bFGF多克隆抗體、化學(xué)發(fā)光試劑等由武漢谷歌生物科技有限公司提供。

1.3 方法。

1.3.1 動物模型制作 體位：仰臥位；麻醉：腹腔內(nèi)注射5%戊巴比妥30 mg/kg，并局部注射5%利多卡因；操作：在手術(shù)顯微鏡下切開大鼠右側(cè)顳骨骨泡，磨去鐙骨肌支面神經(jīng)骨管約3 mm，蚊式鉗鉗夾面神經(jīng)干長約 2 mm，力量為三扣，持續(xù)60 s，松開30 s，再鉗夾60 s，手術(shù)顯微鏡觀察面神經(jīng)損傷程度為束膜性神經(jīng)中斷，符合 Sunderland 損傷Ⅳ度[7]。

1.3.2 質(zhì)粒提取 bFGF菌液經(jīng)大腸桿菌擴(kuò)增16 h后提取純化；應(yīng)用酶切電泳鑒定；濃度1 g/L(紫外分光光度計測定)。

1.3.3 脂質(zhì)微泡與bFGF基因的結(jié)合 在2 mL微泡濃度約為(0.5～1.0) ×108個/ mL的微泡瓶中加入0.5 mL含質(zhì)粒濃度為 1 g/L 的bFGF基因溶液，搖勻，室溫靜置30 min(混合液中質(zhì)粒濃度為0.2 g/L)。

1.3.4 動物分組及給藥 將面神經(jīng)損傷模型大鼠分成4組，每組10只；A組：bFGF+超聲+微泡組(經(jīng)股靜脈注入1 mL含0.2 mg bFGF的載基因微泡溶液后用超聲轉(zhuǎn)染儀緊貼大鼠面神經(jīng)受損部位體外照射，功率0.75 W/cm2，頻率1 MHz,照射10 s,間隔10 s,共2 min)； B組：bFGF+微泡組(僅經(jīng)股靜脈注入與A組同等劑量載基因微泡，但不用超聲輻照)；C組：bFGF+超聲組(經(jīng)股靜脈插管注入含0.2 mg bFGF溶液1 mL，并使用同A組參數(shù)的超聲輻照)；D組：單純手術(shù)組(僅輸入1 mL PBS作為對照)。

1.3.5 一般狀況觀察 于基因轉(zhuǎn)染第1、10、20、28天觀察每組大鼠飲食、胡須擺動、鼻尖偏向、眼瞼閉合情況。

1.3.6 神經(jīng)電生理檢測 于基因轉(zhuǎn)染第28天，以10%水合氯醛麻醉大鼠并固定，將針灸針刺激電極分別插至神經(jīng)損傷處外周和中樞端肌肉，記錄電極插入面頰肌(面神經(jīng)支配)約為3～5 mm，電極間距離4～6 mm。以頻率60 Hz、波寬1 ms的正方波刺激，刺激電流從0 mA開始，至出現(xiàn)動作電位。采用BL-6420C生物信號采集與處理系統(tǒng)，測定潛伏期、傳導(dǎo)速度及動作電位波幅。

1.3.7 標(biāo)本采集 面神經(jīng)損傷大鼠模型經(jīng)基因轉(zhuǎn)染28 d后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉；打開胸腔，升主動脈插管，剪開右心耳；迅速灌注0.9%NaCl至右心耳流出血液完全變清；先快后慢灌注約250 mL 4%多聚甲醛致大鼠四肢僵硬。切取損傷處面神經(jīng)1 cm×1 cm。

1.3.8 損傷處神經(jīng)組織中bFGF 基因mRNA轉(zhuǎn)錄的檢測 引物由武漢谷歌生物科技有限公司合成。提取吻合處神經(jīng)組織RNA(Trizol試劑)，合成cDNA第一鏈，并以其為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增(94 ℃，30 s,54 ℃,30 s,72 ℃,40 s,35個循環(huán))。mRNA水平用β-actin作為內(nèi)標(biāo)，以擴(kuò)增倍數(shù)=2-△△CT表示基因相對表達(dá)量。

1.3.9 損傷處神經(jīng)組織中bFGF蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法，按100 mg組織∶1 mL細(xì)胞裂解液的比例，4 ℃冰浴勻漿，提取總蛋白。用核酸蛋白定量儀進(jìn)行蛋白定量。取40 μg蛋白，經(jīng)12%SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，用封閉液(5%的脫脂奶粉)室溫封閉2 h；加入兔抗鼠GDNF多克隆抗體和兔抗鼠β-actin多克隆抗體(1∶ 200稀釋)，37 ℃孵育2 h；PBST洗膜，加入羊抗兔IgG(1∶ 400稀釋)，37 ℃孵育2 h；化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)約2 min，發(fā)光成像儀呈像并測定條帶吸光度值。以目的條帶和內(nèi)參條帶吸光度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用多個樣本均數(shù)間兩兩比較的q檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠的一般狀況 基因轉(zhuǎn)染后各組大鼠無死亡，切口無感染。轉(zhuǎn)染后第1天，每組大鼠均出現(xiàn)飲食降低，胡須伸直，無擺動，鼻尖偏左；轉(zhuǎn)染后第10天，各組大鼠情況較第1天無好轉(zhuǎn)，組間無明顯差別；轉(zhuǎn)染后第20天，B、C、D組一般狀況無明顯改變，A組大鼠術(shù)側(cè)有少量胡須可觀察到細(xì)微擺動，鼻尖仍偏左；轉(zhuǎn)染后第28天，B、C、D組大鼠術(shù)側(cè)胡須較前恢復(fù)，但擺動無力，鼻尖稍偏左，右眼不完全閉合，A組大鼠術(shù)側(cè)胡須可見有力的節(jié)律性擺動，鼻尖居中，右眼可閉合。

2.2 神經(jīng)電生理檢測 A組大鼠神經(jīng)動作電位波幅，傳導(dǎo)速度高于B、C、D組，潛伏期低于B、C、D組(P<0.05)，見表1。

表1 轉(zhuǎn)染后第28天各組大鼠損傷面神經(jīng)神經(jīng)電生理檢測指標(biāo)

2.3 各組大鼠損傷處神經(jīng)組織中bFGF基因 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平 A組bFGF mRNA表達(dá)量明顯高于B、C、D組(P<0.05)，見圖1。

圖1 損傷神經(jīng)組織中bFGF基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平

2.4 各組大鼠損傷處神經(jīng)組織中bFGF蛋白表達(dá)水平 A組bFGF蛋白表達(dá)量明顯高于B、C、D組(P<0.05)，見圖2、3。

圖2 損傷神經(jīng)組織中bFGF蛋白的表達(dá)

圖3 大鼠損傷處神經(jīng)組織中bFGF蛋白表達(dá)水平

3 討 論

面神經(jīng)損傷后的修復(fù)依然是臨床重要的難題。近年來，隨著基因治療的研究進(jìn)一步深入，基因治療的神秘面紗正被逐漸揭開，與傳統(tǒng)治療不同的是，基因治療通過轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染目的基因，使損傷的面神經(jīng)bFGF恢復(fù)到正常水平，能夠從基因水平調(diào)節(jié)神經(jīng)生長因子水平，從而促進(jìn)修復(fù)[4]，因此具有非?？捎^的前景。目前轉(zhuǎn)基因的載體主要有病毒載體與非病毒載體。兩種類型的載體各有優(yōu)劣，病毒載體較非病毒轉(zhuǎn)染效率高，但細(xì)胞毒性也高、免疫原性較強(qiáng)；而非病毒類載體則反之，雖然比較安全，但效率低[5]。選擇一個安全、合理以及高效的轉(zhuǎn)染方式在基因治療的應(yīng)用中極為重要。既往研究已經(jīng)證實超聲微泡是一種安全、新型及高效的載體。低頻超聲可介導(dǎo)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染,同時,微泡造影劑可提高超聲介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的最高轉(zhuǎn)染率[6]。當(dāng)微泡造影劑從靜脈注射到人體后，微泡會到達(dá)靶細(xì)胞周圍。此時在靶細(xì)胞周圍給予適當(dāng)?shù)某曒椪眨屑?xì)胞周圍的微泡即會破裂，由該微泡攜帶的目的基因釋放進(jìn)入細(xì)胞[7]。

近年來，靶向超聲微泡(球)造影劑因其不僅在疾病診斷，而且能在疾病治療中起到特殊作用而越來越受到關(guān)注[8]。在超聲靶向治療中，微泡造影劑有助于定點治療，且微泡本身能與其他治療方法相結(jié)合等諸多優(yōu)勢，其熱效應(yīng)、空化效應(yīng)及輻射力等有助于藥物在靶向組織中的沉積，從而為起到治療作用[9]。 低強(qiáng)度超聲本身也可以促進(jìn)神經(jīng)損傷的修復(fù)[10]。

既往研究表明，bFGF復(fù)合降解膜能夠提高面神經(jīng)離斷傷延期修復(fù)神經(jīng)再生。駱文龍等[11]研究顯示bFGF對面神經(jīng)元保護(hù)作用的機(jī)制可能是其使受損面神經(jīng)元Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)減少,Bcl-2蛋白表達(dá)增多,從而使面神經(jīng)元凋亡發(fā)生減少。bFGF可以不經(jīng)由雪旺細(xì)胞或血管生成機(jī)制而直接影響軸突，促進(jìn)受損面神經(jīng)再生[12]。但是，由于bFGF半衰期短及快速的擴(kuò)散，采用傳統(tǒng)給藥方式通常無明顯效果[13]。目前研究較多的是通過控制緩釋[14]和導(dǎo)管復(fù)合物[15-18]等方法來實現(xiàn)bFGF對神經(jīng)修復(fù)的作用。

通過文獻(xiàn)查閱及既往研究積累，本研究應(yīng)用超聲微泡作為基因載體，以bFGF作為轉(zhuǎn)染基因，獲得了較好的實驗效果。從結(jié)果可以得出，A組大鼠的一般狀況恢復(fù)較其余3組好，術(shù)側(cè)胡須擺動、鼻尖位置及右眼閉合情況均優(yōu)于其余3組。而從神經(jīng)電生理方面，A組大鼠的誘發(fā)電位波幅、面神經(jīng)傳導(dǎo)速度以及潛伏期也明顯優(yōu)于其他3組，A組大鼠面神經(jīng)損傷處bFGF蛋白及mRNA的表達(dá)量也顯著高于B、C、D 3組。本研究結(jié)果充分說明超聲微泡造影劑能有效地與目的基因相結(jié)合，在適當(dāng)強(qiáng)度和頻率的超聲作用下，能有效將目的基因轉(zhuǎn)染靶組織，為修復(fù)受損面神經(jīng)提供安全高效的途徑；同時，本研究證實bFGF夠促進(jìn)大鼠面神經(jīng)損傷的修復(fù)，為今后面神經(jīng)損傷的基因治療提供新的思路。

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Repair effect of ultrasound microbubble on injuried facial nerve by bFGF transfection in rat*

Su Junbo,Luo Wenlong△,Hao Yaning,Wang Deping

(Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery,Second Affiliated Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing 400010,China)

[Abstract] Objective To apply the ultrasound microbubble to mediate basic fibroblast growth factor(bFGF) for conducting the injuried facial nerve(rat model) repair and to investigate its feasibility and efficiency.Methods After establishing the models of facial nerve injury,40 SD rats were divided into 4 groups,10 cases in each group:group A,bFGF +ultrasound+microbubble(bFGF +MB/US),group B,bFGF and microbuble(bFGF+MB),group C,bFGF and ultrasound(bFGF +US) and group D,simple operation(PBS).The general status of rats on 1,10,20,28 d after bFGF gene transfection was observed.The nerve conduction velocity(NCV),incubation period and amplitude of facial nerve action potential were measured.After taking the facial nerve tissue in injuried site,mRNA expression was detected by RT-PCR.Western blot was used to detect the bFGF protein expression.Results On 20 d after transfection,small swing of a small quantity of beard in the operation site of the group A could be observed;on 28 d after transfection,the general slatws of recavely in rats in the group A was better than that in the group B,C and D.The nerve electrophysiology manifestations after facial nerve repair in the group A were superior to the group B,C and D;the amount of bFGF mRNA and protein pxpression in the group A was significantly higher than that in the group B,C and D.Conclusion Ultrasound microbubble mediated bFGF is conducive to the repair of facial nerve injury.

ultrasound mircobubble;basic fibroblast growth factor;facial nerve injury

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.13.006

重慶市衛(wèi)生局自然科學(xué)基金重點項目(2012-1-041)；重慶市教委科技項目(KJ1600219)。 作者簡介：蘇俊波(1977-)，碩士，講師，主要從事耳鼻喉頭頸外科疾病及教育教學(xué)研究。△

，E-mail:luowenlong163@163.com。

R745.11

A

1671-8348(2017)13-1747-03

2016-11-22

2017-01-10)