譚小兵，劉 佳，郭 宇，徐靜舒，戴青原

(1.云南省第一人民醫(yī)院/昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院口腔內(nèi)科，昆明 650032；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，昆明 650032)

論著·基礎(chǔ)研究

人牙源性iPSCs 3種培養(yǎng)底物的比較*

譚小兵1，劉 佳1，郭 宇1，徐靜舒1，戴青原2△

(1.云南省第一人民醫(yī)院/昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院口腔內(nèi)科，昆明 650032；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，昆明 650032)

目的 對(duì)比研究3種人牙源性誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSCs)培養(yǎng)底物的特點(diǎn)。方法 使用3種底物培養(yǎng)人牙源性iPSCs：小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)、基質(zhì)膠和重組人玻連蛋白(VTN-N)，對(duì)比iPSCs的生長(zhǎng)情況。結(jié)果 3種底物的制備時(shí)間分別為14、3、1 h，三者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；iPSCs重編程時(shí)間分別為(30±1.6)、(26±2.1)、(27±1.4)d，其中MEF組明顯多于其他兩組(P<0.05)；重編程效率分別為0.3%±0.03%、0.56%±0.08%、0.7%±0.02%(P<0.05)。3種底物均能較好支持iPSCs生長(zhǎng)，使其保持未分化狀態(tài)。結(jié)論 重組人玻連蛋白無(wú)異源性動(dòng)物組分，制備簡(jiǎn)便、標(biāo)準(zhǔn)可控、重編程時(shí)間較短，是目前理想的支持iPSCs生長(zhǎng)的底物。

人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞；小鼠胚胎成纖維細(xì)胞；基質(zhì)膠；重組人玻連蛋白

2007年Yamanaka等[1-2]兩個(gè)獨(dú)立研究小組先后將轉(zhuǎn)錄基因Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc或Oct4/Sox2/Nanog/Lin28導(dǎo)入人皮膚成纖維細(xì)胞，將其誘導(dǎo)為具有胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)性質(zhì)的細(xì)胞，并命名為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pliripetent stem cells，iPSCs)，為干細(xì)胞治療與再生醫(yī)學(xué)研究提供了新的思路[3-6]。iPSCs在形態(tài)、細(xì)胞倍增能力、類胚體和畸胎瘤形成、分化能力等多方面與ESCs非常相似，在組織再生、疾病模型、個(gè)性化治療等方面具有巨大的應(yīng)用前景[7-9]。iPSCs應(yīng)用于臨床研究時(shí)必須考慮其生物安全性，除了采用非整合性重編程方法(如仙臺(tái)病毒、質(zhì)粒載體、mRNAs、蛋白等)進(jìn)行誘導(dǎo)以外[10]，飼養(yǎng)層底物也是影響iPSCs生物安全性的重要影響因素。人牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells，DPSCs)為間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)來(lái)源，一定條件下可分化為脂肪、成骨或軟骨系細(xì)胞，但與iPSCs相比其增殖和分化能力有限。本研究采用仙臺(tái)病毒將人DPSCs誘導(dǎo)為iPSCs，觀察比較3種培養(yǎng)底物對(duì)iPSCs生長(zhǎng)的支持程度，篩選符合臨床要求的最佳底物。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 α-MEM、2.5 g/L胰蛋白酶、0.25 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、bFGF、重組人玻連蛋白(VTN-N)、Ⅰ型膠原酶購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，基質(zhì)膠(生長(zhǎng)因子減少型)購(gòu)自美國(guó)BD公司，Ⅱ型中性蛋白酶購(gòu)自瑞士Roche公司，CytoTune?-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit購(gòu)自美國(guó)Life公司，重編程培養(yǎng)基、PSC-easy培養(yǎng)基購(gòu)自北京賽貝生物科技公司，H9細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)國(guó)家干細(xì)胞庫(kù)。

1.2 方法

1.2.1 人DPSCs的分離培養(yǎng) 參照Gronthos方法[11]：收集本院口腔頜面外科拔除的下頜第三磨牙，術(shù)前告知并取得書(shū)面同意。分離牙髓組織、剪碎，Ⅰ型膠原酶與Ⅱ型中性蛋白酶混合液(3∶4，mg/mL)孵育60 min，離心、棄上清液，加入完全培養(yǎng)基(α-MEM + 15% FBS + 1%谷氨酰胺 + 1%青/鏈霉素)，過(guò)濾得到單細(xì)胞懸液，37 ℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)，90%融合后傳代，第3～5代用于實(shí)驗(yàn)。觀察細(xì)胞形態(tài)特征，流式細(xì)胞儀檢測(cè)特異標(biāo)記物的表達(dá)。所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)云南省第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2.2 人DPSCs重編程及培養(yǎng) 利用Sendai Reprogramming Kit試劑盒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，0.5 mmol/L EDTA液消化傳代。人胚胎干細(xì)胞H9為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。仙臺(tái)病毒(Sendai virus，SeV)轉(zhuǎn)染：前兩天，第3代DPSCs鋪到6孔板內(nèi)(1×105/孔)常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染當(dāng)天(第0天)，將適量SeV溶解到70 μL DPSCs培養(yǎng)基內(nèi)，1 d后再加入130 μL 培養(yǎng)基，第2天換新鮮含SeV培養(yǎng)液。第3天將已轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別轉(zhuǎn)移到3種底物覆蓋的6孔板內(nèi)，加入重編程培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，3周左右可觀察到克隆出現(xiàn)?？寺〕墒鞎r(shí)，“十字法”分割，轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)板內(nèi)，PSC-easy培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.3 3種培養(yǎng)底物的制備 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts，MEF)按照文獻(xiàn)[12]制備：處死受孕小鼠，去除胚胎所有臟器、剪碎，0.25%胰酶/EDTA、37 ℃消化15 min，制成單細(xì)胞懸液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)(此時(shí)為第0代MEF)，90%融合時(shí)傳代或凍存。傳代90%融合時(shí)，加入含絲裂霉素C的培養(yǎng)液(10 μg/mL)，2 h后消化細(xì)胞，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿，第2天即可使用?；|(zhì)膠(matrigel)：4 ℃解凍，預(yù)冷槍頭混勻，冷PBS稀釋(50 μg/mL，1∶100)，取適量包被培養(yǎng)板，37 ℃孵育2 h或4 ℃過(guò)夜，吸去基質(zhì)膠，加入PSC-easy液備用；Vitronectin，VTN-N：常溫解凍，常溫PBS液稀釋(5 μg/mL，1∶100)，取適量包被培養(yǎng)板，37 ℃孵育1 h，吸去VTN-N，加入PSC-easy液備用。

1.2.4 3種不同底物培養(yǎng)系統(tǒng)的比較

1.2.4.1 iPSCs克隆生長(zhǎng)情況 (1)觀察iPSCs克隆在3組不同底物上的形態(tài)特征(H9為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照)。(2)RT-PCR：TriZOL試劑盒提取iPSCs總RNA，20 μL體系逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成單鏈cDNA，反應(yīng)條件25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，35次循環(huán)(95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)，72 ℃ 7 min，電泳檢測(cè)、成像，檢測(cè)iPSCs特異性標(biāo)記物Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc的表達(dá)情況，人H9為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，水為陰性對(duì)照。根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)相應(yīng)引物(表1)。

表1 人DPSCs-iPSCs標(biāo)記物基因上下游引物堿基序列

1.2.4.2 重編程時(shí)間 包括3組不同底物的準(zhǔn)備時(shí)間(培養(yǎng)基、飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備)、從目標(biāo)細(xì)胞接種到iPSCs克隆出現(xiàn)所需時(shí)間，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4.3 重編程效率 出現(xiàn)克隆數(shù)占重編程體細(xì)胞數(shù)量的比例是一個(gè)重要參數(shù)。計(jì)算公式：克隆數(shù)/體細(xì)胞數(shù)量×100%，重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 人DPSCs培養(yǎng)及鑒定 分離培養(yǎng)第1天即可看到細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，第4天形成克隆，第10天形成單細(xì)胞層。細(xì)胞為紡錘形或長(zhǎng)梭形，形態(tài)較大(圖2A、2B)。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示DPSCs不表達(dá)CD34、CD45，幾乎所有細(xì)胞為CD90、CD105陽(yáng)性，CD146染色陽(yáng)性(28.4%)，說(shuō)明為MSCs來(lái)源；Stro-1和Oct-4染色均為陽(yáng)性(分別為28.3%、43.6%)，說(shuō)明細(xì)胞具有多向分化潛能。

圖2 人DPSCs培養(yǎng)及鑒定

2.2 人iPSCs重編程及其在3種底物上的培養(yǎng) 轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種到3組底物，重編程3 d即可觀察到纖維細(xì)胞樣克隆出現(xiàn)，7～10 d后生長(zhǎng)停止，出現(xiàn)胞核凝固，細(xì)胞分解，克隆松散直至消失。ES樣克隆多出現(xiàn)于轉(zhuǎn)染后4周左右，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)染細(xì)胞縮小為圓形或規(guī)則多邊形，單層排列緊密，邊緣銳利清晰，邊界清楚。此時(shí)ES樣克隆即為iPS原代細(xì)胞(P0)。吸取原代iPSCs克隆種植于底物上傳代培養(yǎng)，此時(shí)為iPS第1代(P1)?？寺∩L(zhǎng)迅速，EDTA液消化傳代，4～5 d傳代1次，細(xì)胞繼續(xù)維持ES樣克隆特征。3種底物均可很好地支持DPSCs-iPS和H9細(xì)胞的生長(zhǎng)，克隆呈集落樣生長(zhǎng)；與周圍有清晰分界線，克隆內(nèi)細(xì)胞排列致密，保持未分化狀態(tài)(圖3)。RT-PCR結(jié)果顯示iPSCs特異標(biāo)記物的表達(dá)穩(wěn)定，提示iPSCs處于未分化狀態(tài)(圖4A)。

A:MEF;B:基質(zhì)膠；C：重組人玻連蛋白；D：MEF;E:基質(zhì)膠；F：重組人玻連蛋白。

圖3 人DPSCs-iPS與H9生長(zhǎng)于不同培養(yǎng)底物

2.3 3種底物準(zhǔn)備及重編程時(shí)間 MEF培養(yǎng)基準(zhǔn)備2 h，鋪板過(guò)夜12 h，絲裂霉素處理時(shí)間2 h，總計(jì)14 h，重編程第30天左右克隆開(kāi)始出現(xiàn)?；|(zhì)膠準(zhǔn)備時(shí)間1 h，包被孵育2 h，重編程第26天時(shí)克隆開(kāi)始，VTN-N準(zhǔn)備時(shí)間0.2 h，包被孵育1 h，重編程第25天克隆開(kāi)始出現(xiàn)(P<0.05)(圖4B)。

2.4 重編程效率 人DPSCs重編程前細(xì)胞數(shù)量為1×104，重編程后3種底物上分別得到30、56、70個(gè)克隆，重編程效率為0.3%±0.03%、0.56%±0.08%、0.7%±0.02%，重編程效率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

圖4 人DPSCs-iPS特異性標(biāo)記物RT-PCR分析及不同底物重編程時(shí)間比較

圖5 人DPSCs-iPS不同培養(yǎng)底物上的重編程效率比較

3 討 論

考慮到倫理道德及免疫排斥因素，iPSCs比ESCs更適于細(xì)胞移植和再生醫(yī)學(xué)，是目前最有應(yīng)用前景的種子細(xì)胞[13]。能滿足臨床應(yīng)用要求的iPSCs稱為臨床級(jí)別iPSCs，理論上須滿足以下3個(gè)條件：(1)細(xì)胞捐獻(xiàn)者須符合《組織捐獻(xiàn)指南》的要求；(2)細(xì)胞處理全過(guò)程須在GMP級(jí)別實(shí)驗(yàn)環(huán)境中進(jìn)行，使用無(wú)異源性動(dòng)物組分試劑；(3)獲得的iPSCs無(wú)外源性基因或病毒整合，生物安全性有保證[14]。

目前制約iPSCs應(yīng)用于臨床的其中一個(gè)因素就是其生物安全性，如重編程載體帶來(lái)的致瘤性可能、培養(yǎng)底物成分、含異源性動(dòng)物組分試劑等。本實(shí)驗(yàn)采用一種非整合性RNA載體-仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)人DPSCs重編程為iPSCs，RT-PCR結(jié)果證實(shí)得到的iPSCs無(wú)仙臺(tái)病毒或外源性轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)，同時(shí)所用iPSCs培養(yǎng)基無(wú)異源性動(dòng)物組分(重編程培養(yǎng)基和PSC-easy培養(yǎng)基)，保證了iPSCs的生物安全性(結(jié)果另文報(bào)道)。在此基礎(chǔ)上筆者選擇3種培養(yǎng)底物，對(duì)比研究哪種可以最佳支持iPS細(xì)胞的生長(zhǎng)。

自從人ESCs成功培養(yǎng)以來(lái)，許多人ESCs和iPSCs系陸續(xù)成功建立，細(xì)胞生物學(xué)特性的研究有助于了解自我更新和定向分化過(guò)程中的關(guān)鍵通道和轉(zhuǎn)錄因子，而這又反過(guò)來(lái)促進(jìn)了iPSCs的培養(yǎng)條件最佳化。iPSCs的培養(yǎng)底物經(jīng)歷了從飼養(yǎng)層到無(wú)飼養(yǎng)層體系的發(fā)展。早期iPSCs培養(yǎng)大多基于Thomson等創(chuàng)立的ESCs培養(yǎng)體系[15]，MEF作為飼養(yǎng)層可以分泌多種生長(zhǎng)因子、激素和胞外基質(zhì)如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、激活素A、層粘連蛋白和玻連蛋白，支持穩(wěn)定可靠的iPSCs。但MEF存在異源性動(dòng)物組分污染可能，成分不明，制備耗時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)不易控制，同時(shí)MEF及其產(chǎn)物對(duì)iPSCs本身是可能的病原體[16]。為了純化細(xì)胞產(chǎn)物，需要采用無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)體系。無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體系大多基于Thomson體系加以改良[17]，matrigel首先用于培養(yǎng)底物。有研究將人iPSCs培養(yǎng)于3種不同的底物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)matrigel可以很好支持iPSCs生長(zhǎng)，與MEF無(wú)明顯差異[15]。matrigel是一種富含層粘連蛋白111的可溶性基底膜基質(zhì)，同時(shí)含TGF-β、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、組織纖維酶原活化因子等[18]。matrigel在室溫下可自動(dòng)聚集產(chǎn)生類似于哺乳動(dòng)物細(xì)胞基底膜的生物活性基質(zhì)材料，生成類似體內(nèi)環(huán)境的良好基底膜狀態(tài)，有助于iPSCs的附著生長(zhǎng)，為iPSCs保持未分化狀態(tài)提供理想支持，是常用的培養(yǎng)底物[17]。matrigel成分相對(duì)單一，制備簡(jiǎn)便，標(biāo)準(zhǔn)可控，但其為小鼠源性腫瘤組織，限制了iPSCs的臨床使用。重組人玻連蛋白(VTN-N)來(lái)自于人血漿的純化，其主要整合素結(jié)合多肽是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)，通過(guò)αvβ5整合素支持人ESCs和iPSCs的生長(zhǎng)，使其保持未分化和自我更新能力[18]。本研究從細(xì)胞形態(tài)、特異性標(biāo)記物表達(dá)等方面進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種底物均能很好地使人DPSCs-iPSCs和H9長(zhǎng)期維持未分化狀態(tài)，與其他學(xué)者研究結(jié)果一致[17-19]。同時(shí)本研究分別在3種底物上對(duì)人DPSCs進(jìn)行重編程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VTN-N所需重編程時(shí)間最短，重編程效率也明顯高于其他兩組，說(shuō)明VTN-N可以為iPSCs的生長(zhǎng)提供理想支持條件。

重組人玻連蛋白無(wú)異源性動(dòng)物組分污染，制備簡(jiǎn)便，標(biāo)準(zhǔn)可控，是人牙源性iPSCs的理想底物。GMP標(biāo)準(zhǔn)下嚴(yán)格要求iPSCs重編程的全過(guò)程，包括目標(biāo)細(xì)胞捐獻(xiàn)者篩選、非整合性重編程載體的選擇、合適底物、目標(biāo)細(xì)胞及iPSCs的生物安全性檢測(cè)、無(wú)異源性動(dòng)物組分試劑的使用等方面，建立安全的臨床級(jí)別人牙源性iPSCs，是筆者今后的研究方向。

[1]Takahashi K,Tanabe K,Ohnuki M,et al.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors[J].Cell,2007,131(5):861-872.

[2]Takahashi K,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell,2006,126(4):663-676.

[3]Ramalho-Santos M.iPS cells:insights into basic biology[J].Cell,2009,138(138):616-618.

[4]Liu L,Huang JS,Han C,et al.Induced pluripotent stem cells in huntington′s disease:disease modeling and the potential for cell-based therapy[J].Mol Neurobiol,2016，53(10)：6698-6708.

[5]Pozzobon M,Ghionzoli M,De Coppi P.ES,iPS,MSC,and AFS cells.Stem cells exploitation for pediatric surgery:current research and perspective[J].Pediatr Surg Int,2010,26(1):3-10.

[6]Casaroli-Marano RP,Nieto-Nicolau N,Martínez-Conesa EM,et al.Potential role of induced pluripotent stem cells(IPSCs) for cell-based therapy of the ocular surface[J].J Clin Med,2015,4(2):318-342.

[7]Wang A,Tang Z,Park IH,et al.Induced pluripotent stem cells for neural tissue engineering[J].Biomaterials,2011,32(22):5023-5032.

[8]Tafaleng EN,Chakraborty S,Han B,et al.Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from α1-antitrypsin deficiency[J].Hepatology,2015,62(1):147-157.

[9]Montgomery A,Wong A,Gabers N,et al.Engineering personalized neural tissue by combining induced pluripotent stem cells with fibrin scaffolds[J].Biomater Sci,2015,3(2):401-413.

[10]Hibaoui Y,Feki A.Concise review:methods and cell types used to generate down syndrome Induced pluripotent stem cells[J].J Clin Med,2015,4(4):696-714.

[11]Bilic J,Izpisua Belmonte JC.Concise review:induced pluripotent stem cells versus embryonic stem cells:close enough or yet too far apart[J].Stem Cells,2012,30(1):33-41.

[12]Thomson JA,Odorico JS.Human embryonic stem cell and embryonic germ cell lines[J].Trends Biotechnol,2000,18(2):53-57.

[13]Vallier L.Serum-free and feeder-free culture conditions for human embryonic stem cells[J].Methods Mol Biol,2011,690(1):57-66.

[14]Ninomiya H,Mizuno K,Terada R,et al.Improved efficiency of definitive endoderm induction from human induced pluripotent stem cells in feeder and serum-free culture system[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim,2015,51(1):1-8.

[15]Ghasemi-Dehkordi P,Allahbakhshian-Farsani M,Abdian N,et al.Comparison between the cultures of human induced pluripotent stem cells(hiPSCs) on feeder-and serum-free system(matrigel matrix),MEF and HDF feeder cell lines[J].J Cell Commun Signal,2015,9(3):233-246.

[16]Nagaoka M,Kobayashi M,Kawai C,et al.Design of a vitronectin-based recombinant protein as a defined substrate for differentiation of human pluripotent stem cells into hepatocyte-like cells[J].PLoS One,2015,10(8):e0136350.

[17]Badenes SM,Fernandes TG,Cordeiro CS,et al.Correction:defined essential 8 medium and vitronectin efficiently support scalable xeno-Free expansion of human induced pluripotent stem cells in stirred microcarrier culture systems[J].PLoS One,2016,11(5):e0155296.

[18]Braam SR,Zeinstra L,Litjens S,et al.Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem c ell self-renewal via alphavbeta5 integrin[J].Stem cells,2008,26(9):2257-2265.

[19]Rowland TJ,Miller LM,Blaschke AJ,et al.Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin[J].Stem Cells Dev,2010,19(8):1231-1240.

Comparison among 3 kinds of culture substrates of odontogenic induced pluripotent stem cells*

Tan Xiaobing1，Liu Jia1,Guo Yu1,Xu Jingshu1,Dai Qingyuan2△

(1.Department of Endodontics,Yunnan Provincial First People′s Hospital/Kunming Univerty ofscience and Technology Affiliated Hospital,Kunming,Yunnan 650032,China;2.Department of Cardiology,First Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming,Yunnan 650032,China)

[Abstract] Objective To comparatively study the characteristics of 3 kinds of culture substrates of human odontogenic induced pluripotent stem cells(iPSCs).Methods The human odontogenic iPSCs were cultured by 3 kinds of substrates:mouse embryonic fibroblasts(MEF),matrigel and recombinant human vitronectin(VTN-N).The iPSCs growth situation was compared among three groups.Results The preparation time of these 3 kinds of substrates was 14,3,1 hlespectively,and,the difference was statistically significant (P<0.05).The iPSCs reprogramming time was (30±1.6),(26±2.1),(27±1.4)d,lespectively,wht that in the MEF group significantly higer than in other two groups (P<0.05).The reprogramming efficiencies were 0.3%±0.03%,0.56%±0.08%,0.7%±0.02% respectively(P<0.05).Three kinds of substrate could better support iPSCs growth and make them to maintain un-differentiation status.Conclusion with no heterologous animal components,and the adrantaga of simple pleparation,oonfrollable standard and shorter gramming time is easy to prepare,the standard is controllable and the reprogramming time is shorter,which is an ideal substrate for supporting iPSCs growth.

human induced pluripotent stem cell；MEF；matrigel;vitronectin

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.13.005

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360161)；云南省教育廳基金資助項(xiàng)目(2015Y153)。 作者簡(jiǎn)介：譚小兵(1974-)，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事干細(xì)胞在牙髓再生中的應(yīng)用研究。△

，E-mail:dqy0823@163.com。

R78

A

1671-8348(2017)13-1743-04

2016-11-25

2017-01-13)