丁曉明，牟艷杰，楊鳳革，張賢梅，孫勤國

(湖北省武漢市第三醫(yī)院中醫(yī)科 430060)

論著·基礎(chǔ)研究

參芍軟肝湯抗大鼠肝纖維化的作用機制研究*

丁曉明，牟艷杰，楊鳳革，張賢梅，孫勤國△

(湖北省武漢市第三醫(yī)院中醫(yī)科 430060)

目的 研究參芍軟肝湯抗大鼠肝纖維化的作用及其機制。方法 選取Wistar雄性大鼠72只,正常喂養(yǎng)1周后分為對照組(n=12)和造模組(n=60)，造模組采用40%四氯化碳(CCl4)橄欖油溶液腹腔皮下注射構(gòu)建大鼠肝纖維化模型，造模成功后分為模型組(等量生理鹽水灌胃)、陽性對照組(秋水仙堿0.154 mg·kg-1·d-1)、低劑量組(每100 g體質(zhì)量2 mL，含參芍軟肝湯生藥0.23 g/mL)、中劑量組(每100 g體質(zhì)量2 mL，含參芍軟肝湯生藥0.46 g/mL)及高劑量組(每100 g體質(zhì)量2 mL，含參芍軟肝湯生藥0.69 g/mL)各12只，均治療8周后觀察大鼠的肝纖維化相關(guān)指標的差異。結(jié)果 對照組大鼠全部為0期標準，陽性對照組大鼠的肝組織纖維化程度顯著優(yōu)于模型組(P<0.05),低劑量組、中劑量組、高劑量組的大鼠肝組織纖維化程度逐漸減輕，高劑量組大鼠肝組織纖維化程度顯著輕于模型組和低劑量組(P<0.05)。模型組大鼠的Ⅲ型前膠原(PC-Ⅲ)、層粘連蛋白(LN)、Ⅳ-C型膠原(Ⅳ-C)、透明質(zhì)酸(HA)檢測值均顯著高于對照組大鼠(P<0.05)，陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組的PC-Ⅲ、LN、Ⅳ-C、HA檢測值均顯著低于模型組大鼠(P<0.05)。模型組大鼠的血清超氧化物歧化酶(SOD)檢測值均顯著低于對照組大鼠(P<0.05)，模型組大鼠的血清丙二醛(MDA)水平顯著高于對照組大鼠(P<0.05)；陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組的血清SOD檢測值均顯著高于模型組大鼠(P<0.05)，血清MDA水平顯著低于模型組大鼠(P<0.05)。結(jié)論 參芍軟肝湯能有效減輕大鼠肝纖維化程度，其作用機制為降低血清肝纖維化指標的水平，抑制過氧化物產(chǎn)生，減輕自由基對肝細胞的損傷作用。

肝硬化；中草藥；機制

肝纖維化是指由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性細胞外基質(zhì)過度沉淀的病理過程，是各種慢性肝病的病理基礎(chǔ)。病理學(xué)檢查可見肝臟假小葉形成，肝細胞排列紊亂、纖維組織增生、血管分布相對不足，進而導(dǎo)致門靜脈高壓等并發(fā)癥[1]。中醫(yī)對肝硬化的認識著重于整體觀念的理解，慢性肝病病因乘久，病邪乘機侵犯脾臟、胃以及腸道等器官，使得氣血淤滯而搏結(jié)[2-3]，通過針對性地解毒利濕驅(qū)邪、溫陽活血扶正治療，可以緩解肝硬化的發(fā)生發(fā)展，改善肝硬化患者的生存質(zhì)量[4]。本實驗重在分析參芍軟肝湯抗大鼠肝纖維化的效果并初步探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級成年雄性(SD)大鼠72只購自武漢大學(xué)動物實驗中心[SCXK(鄂)2008-0004]，體質(zhì)量(180±20)g；面粉、豬油及膽固醇配成的混合飼料由湖北中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供；中藥材原料購自湖北辰美中藥有限公司，參芍軟肝湯含有丹參、白芍、郁金、海藻、制鱉甲、垂盆草、女貞子、茯苓、制附片、炙甘草10味中藥成分,加水煎煮，去渣后濃縮至2.3 g/mL，密封，4 ℃保存，為本院制劑室配置；蘇木素伊麗春紅酸性復(fù)紅液試劑盒購自谷歌生物；大鼠血清透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅳ-C型膠原(Ⅳ-C)和 Ⅲ型前膠原(PC-Ⅲ)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自南京安培化工科技有限公司，檢測儀器為美國Biotek酶標儀；超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒及丙二醛(MDA)試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司；全自動生化分析儀購自美國貝克曼公司。

1.2 方法

1.2.1 分組 72只大鼠分為對照組(n=12)和造模組(n=60)。造模組分為模型組、陽性對照組、低劑量組、中劑量組及高劑量組各12只。各組大鼠初始體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2.2 建立肝纖維化模型 采用四氯化碳(CCl4)皮下注射法誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型。雄性 Wistar 大鼠 60 只，按《中藥藥物實驗方法學(xué)》用復(fù)合因素造模,實驗第 1 天皮下注射40% CCl4橄欖油溶液 0.5 mL/100 g體質(zhì)量,以后每隔3 d,皮下注射 40% CCl4橄欖油溶液 0.3 mL/100 g 體質(zhì)量,以 79.5% 單純面粉、20% 豬油及 0.5% 膽固醇配成混合飼料喂養(yǎng)制成大鼠肝纖維化模型。陽性對照組及治療組在造模同時給藥持續(xù)8周，正常對照組以同樣方法注射等量植物油。模型組除正常飲食、飲水外,每日給予 0.9% 氯化鈉灌胃,皮下注射40%CCl4橄欖油。

1.2.3 取材 對照組、模型組(等量生理鹽水灌胃)、陽性對照組(秋水仙堿0.154 mg·kg-1·d-1)、低劑量組(100 g/2 mL，含參芍軟肝湯生藥0.23 g/mL)、中劑量組(100 g/2 mL，含參芍軟肝湯生藥0.46 g/mL)及高劑量組(100 g/2 mL，含參芍軟肝湯生藥0.69 g/mL)，各組動物模型均于治療8周后處死，取下腔靜脈血液，分離血清樣本；迅速取部分肝組織以4%甲醛固定，用于肝組織病理及免疫組織化學(xué)染色觀察。

1.2.4 肝組織標本的制備及觀察 每只大鼠取相同部位肝臟用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，對各組大鼠的肝組織采用HE染色觀察病理變化，另采用Masson三色染色，石蠟切片脫蠟至水，依次用自來水和蒸餾水沖洗，用Regaud蘇木精染液或Weigert蘇木精液染核5～10 min，采用磷酸鹽緩沖液清洗3次，每次5 min，用Masson 麗春紅酸性復(fù)紅液5～10 min，1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min，95%乙醇、無水乙醇、二甲苯透明，中性樹膠封固。在光鏡下觀察并對肝組織纖維化程度進行評級，0期：無膠原纖維形成；Ⅰ期：匯管區(qū)擴大，纖維組織將匯管區(qū)粘連；Ⅱ期：匯管區(qū)周圍纖維化，纖維間隔形成，小葉結(jié)構(gòu)基本保留；Ⅲ期：肝組織匯管區(qū)與中央靜脈之間出現(xiàn)廣泛的纖維粘連；Ⅳ期：假小葉形成。所有切片由病理科醫(yī)師進行評價，每張切片選取8個高倍視野。

1.2.5 ELISA法測定各組大鼠血清的肝纖維化指標 PC-Ⅲ、LN、Ⅳ-C、HA及SOD、MDA的水平。

2 結(jié) 果

2.1 干預(yù)治療8周后各組大鼠的肝纖維化程度比較 對照組大鼠全部為0期標準，陽性對照組大鼠的肝纖維化程度顯著優(yōu)于模型組(P<0.05),低劑量組、中劑量組、高劑量組的大鼠肝纖維化程度逐漸減輕，高劑量組大鼠肝組織纖維化程度顯著輕于模型組和低劑量組(P<0.05)，見表1。

各組大鼠肝組織切片染色后結(jié)果見圖1。A為對照組大鼠肝組織HE染色結(jié)果，可見肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，無變形壞死，未見肝纖維組織增生；B為模型組，可見肝組織中肝小葉結(jié)構(gòu)遭到破壞，肝細胞排列紊亂、壞死、炎癥細胞浸潤；C為陽性對照組，D、E、F分別為低劑量組、中劑量組、高劑量組，可見肝臟組織結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)。Masson染色結(jié)果顯示膠原纖維、黏液、軟骨呈藍色(如光綠液染色為綠色)，胞質(zhì)、肌肉、纖維素、神經(jīng)膠質(zhì)呈紅色，胞核呈黑藍色。各組纖維化程度同HE染色結(jié)果一致(圖A1-F1)。

表1 干預(yù)治療8周后各組大鼠的肝組織纖維化程度比較(n)

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與低劑量組比較。

A：對照組(HE×100)；B：模型組(HE×100)；C：陽性對照組(HE×100)；D：低劑量組(HE×100)；E：中劑量組(HE×100)；F：高劑量組(HE×100)；A1：對照組(Masson×200)；B1：模型組(Masson×200)；C1：陽性對照組(Masson×200)；D1：低劑量組(Masson×200)；E1：中劑量組(Masson×200)；F1：高劑量組(Masson×200)。

圖1 肝組織切片

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與低劑量組比較。

2.2 干預(yù)治療8周后各組大鼠血清的肝纖維化指標變化情況 模型組大鼠的PC-Ⅲ、LN、Ⅳ-C、HA檢測值均顯著高于對照組大鼠(P<0.05)，陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組的PC-Ⅲ、LN、Ⅳ-C、HA檢測值均顯著低于模型組大鼠(P<0.05)，見表2。

2.3 干預(yù)治療8周后各組大鼠的血清SOD、MDA水平變化情況 模型組大鼠的血清SOD檢測值均顯著低于對照組大鼠(P<0.05)，模型組大鼠的血清MDA水平顯著高于對照組大鼠(P<0.05)；陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組的血清SOD檢測值均顯著高于模型組大鼠(P<0.05)，血清MDA水平顯著低于模型組大鼠(P<0.05)，見表3。

表3 干預(yù)治療8周后各組大鼠的血清SOD、MDA水平變化情況

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與低劑量組比較。

3 討 論

肝纖維化是機體對各種致病因素引起的慢性肝損傷后的一種自我修復(fù)反應(yīng)，盡管早期的肝纖維化臨床癥狀不是很明顯，但當肝臟受到持續(xù)的損傷時，肝纖維化可發(fā)展成肝硬化，肝硬化可導(dǎo)致門脈高壓、肝衰竭、肝性腦病、肝細胞癌等并發(fā)癥。有報道顯示，肝硬化5 年、10 年后發(fā)展成肝癌的概率分別約為17%、40%[5]。目前肝移植是嚴重肝病唯一有效的治療措施，但肝纖維化在某種程度上可逆轉(zhuǎn)[6]。 因此有效的抗纖維化藥物是十分必要的[7]。目前對于肝硬化發(fā)生機制的研究表明，層粘連蛋白、膠原蛋白Ⅳ以及膠原纖維的增生是導(dǎo)致肝硬化惡化的重要原因[8-9]。中醫(yī)理論認為，肝硬化過程中肝細胞正常的解毒、合成等功能受到多種因素的干擾，進而引起肝失疏泄、氣滯血淤、肝血不足、脾胃運化失調(diào)等病理變化[10]。通過疏肝活血理氣解毒、溫陽健脾利濕扶正等方式，可以改善間質(zhì)代償性增生[11]，并抑再生肝內(nèi)膽管的異常生成。另一方面，中醫(yī)治療肝硬化注重對疾病系統(tǒng)性的整體調(diào)節(jié)和辨證用藥，“見肝之病、知肝傳脾、當先實脾”，參芍軟肝湯含有丹參、白芍、郁金、海藻、制鱉甲、垂盆草、女貞子、茯苓、制附片、炙甘草10種中藥成分，在調(diào)理肝臟血流的同時可以“散脾之濕毒”、“扶正以祛邪”，進而達到整體治療的目的。

通過本實驗可以看出，不同的造模組通過四氯化碳進行肝臟纖維化誘導(dǎo)，模型組采用常規(guī)的秋水仙堿治療，中藥治療組采用不同劑量的參芍軟肝湯治療，經(jīng)過治療后處死動物并取肝臟組織染色分析，可見模型組的大鼠肝臟組織均呈現(xiàn)不同的假小葉結(jié)構(gòu)，再生的紅染纖維組織包裹肝細胞以及膽管細胞形成排列紊亂的非線性結(jié)構(gòu)，提示造模成功[12]。而低劑量組、中劑量組、高劑量組的大鼠肝組織纖維化程度逐漸減輕，高劑量參芍軟肝湯治療組的大鼠肝臟纖維再生程度較低，雖然可見肝組織中肝小葉結(jié)構(gòu)遭到破壞，肝細胞排列紊亂、壞死、炎癥細胞浸潤，但Masson染色結(jié)果顯示高劑量組的假小葉數(shù)量較少，間質(zhì)染色提示纖維化程度較輕，提示了參芍軟肝湯對于治療或者抑制肝臟纖維化的過程中具有一定的劑量依賴性。通過肝臟纖維化的生化指標分析可見，陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組的PC-Ⅲ、LN、Ⅳ-C、HA檢測值均顯著低于模型組大鼠，而高劑量組的HA、LN、Ⅳ-C等均有較為顯著的下降，其中LN可下降至(37.1±9.4)g/L，而Ⅳ-C的下降更為顯著，其平均值僅為(8.5±0.9)g/L，提示了高劑量的參芍軟肝湯對于抑制四氯化碳誘導(dǎo)的肝臟纖維化過程的抑制作用。據(jù)《溫病條辨》記載，參芍軟肝湯可以主“經(jīng)年不愈，下焦陰陽皆虛，不能收攝，少腹氣結(jié)”之證，散肝血解淤毒的同時可以調(diào)理陰陽氣血，參芍軟肝湯對于抑制肝臟纖維化的作用可能與“附子固守下焦之陽”、“茯苓、炙甘草守補中焦”有關(guān)。為進一步分析其作用機制，高劑量組的血清SOD檢測值均顯著高于模型組大鼠，而血清MDA呈現(xiàn)了相反的變化，SOD通過抑制細胞膜的過氧化損傷作用進而穩(wěn)定細胞膜以及細胞核[13]，維持細胞內(nèi)第二信使傳遞的穩(wěn)定性，而MDA在過氧化損傷的過程中可以通過調(diào)節(jié)白三烯等炎癥因子進而促進缺血再灌注損傷[14-15]，本研究結(jié)果提示參芍軟肝湯可能通過促進SOD的上調(diào)并抑制MDA的表達進而抑制肝臟纖維化，但本研究并未探討SOD介導(dǎo)的細胞內(nèi)信號作用及其與MDA的交互作用，提示了本研究的不足之處。

參芍軟肝湯對于減輕大鼠肝纖維化程度的作用存在明顯的劑量依賴性，其機制可能與抑制過氧化物產(chǎn)生、減輕自由基對肝細胞的損傷作用有關(guān)，但本研究僅限于動物試驗，相關(guān)結(jié)論和機制有待進一步探討。

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Study on effect and mechanism of Shenshaoruangan Decoction on liver fibrosis in rats*

Ding Xiaoming，Mou Yanjie，Yang Fengge，Zhang Xianmei,Sun Qinguo△

(Department of Traditional Chinese Medicine,Wuhan Municipal Third Hospital,Wuhan,Hubei 430060,China)

[Abstract] Objective To study the effect and mechanism of Shenshaoruangan Decoction on liver fibrosis in rats.Methods Seventy-two male Wistar rats were selected and normally fed for 1 week.Then they divided into the control group(n=12) and model constructing group(n=60).The model constructing group was subcutaneously and intraperitoneally injected by 40% CCl4olive oil for constructing fibrosis rat model.After successfully constructing model,which was divided into the model group(equivalent normal saline gavage),positive control group(colchicines 0.154 mg·kg-1·d-1),low-dose group(2 mL per 100 g body mass,containing Shenshaoruangan Decoction crude drug 0.23 g/mL),medium-dose group(2 mL per 100 g body mass,containing Shenshaoruangan Decoction crude drug 0.46 g/mL) and high-dose group(100 g/2 mL,containing Shenshaoruangan Decoction crude drug 0.69 g/mL),12 cases in each group.The differences of related indicators rat hepatic fibrosis after 8-weeks treatment were observed.Results The control group was the stage 0 standard,the liver fibrosis degree in the positive control group was significantly better than that in the model group(P<0.05)；the liver fibrosis degree in the low-dose group,medium-dose group and high-dose group was gradually alleviated；the liver fibrosis degree in the high-dose group was significantly slighter than that in the model group and-dose group(P<0.05).The detection values of PC-Ⅲ,LN,Ⅳ-C and HA in the model group were significantly higher than those in the control group(P<0.05),and the detection values of PC-Ⅲ,LN,Ⅳ-C and HA in the positive control group,low-dose group,medium-dose group and high-dose group were significantly lower than those in the model group(P<0.05).Serum SOD detection value of the model group was significantly lower than that in the control group(P<0.05),the serum MDA level in the model group was significantly higher than that in the control group(P<0.05);serum SOD level in the positive control group,low-dose group,medium-dose group and high-dose group was significantly higher than that in the model group(P<0.05),while serum MDA level in those group was significantly lower than that in the model group(P<0.05).Conclusion Shenshaoruangan Decoction can effectively alleviate the liver fibrosis degree,and its mechanism is to reduce the levels of liver fibrosis indicators,inhibit the prodmotion of peroxides and alleviate the damage of free radicals on liver cells.

livercirrhosis;drugs,chinese herbal;mecnanism

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.13.004

湖北省武漢市衛(wèi)生和計劃生育委員會資助項目(WZ16A11)。 作者簡介：丁曉明(1982-)，碩士，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)臨床研究。△

，E-mail:707986890@qq.com。

R575

A

1671-8348(2017)13-1740-03

2016-11-21

2017-01-09)