羅 昊，孟 贊，劉澤洪，陳曉露

(1.樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)教研室，四川樂山 614000；2.三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校病理學(xué)教研室，重慶萬州 404120；3.樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院病理學(xué)教研室，四川樂山 614000)

論著·基礎(chǔ)研究

阿糖胞苷通過自噬途徑影響K562細(xì)胞增殖凋亡的實驗研究

羅 昊1，孟 贊1，劉澤洪2，陳曉露3△

(1.樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)教研室，四川樂山 614000；2.三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校病理學(xué)教研室，重慶萬州 404120；3.樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院病理學(xué)教研室，四川樂山 614000)

目的 探討阿糖胞苷(Ara-C)通過自噬途徑影響人紅白血病K562細(xì)胞株增殖、凋亡的作用及可能的機制。方法 采用CCK-8法檢測不同濃度的Ara-C作用24 h和48 h后細(xì)胞增殖抑制率；流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測凋亡率和周期；Hoechest染色觀察細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)，吖啶橙染色觀察細(xì)胞酸性自噬小泡；Western blot檢測p38和p-p38蛋白表達(dá)變化；RT-PCR和免疫熒光檢測自噬凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)不同濃度的Ara-C均能抑制K562細(xì)胞增殖，并呈濃度和時間依賴性；FCM檢測顯示Ara-C能增加細(xì)胞的凋亡和將細(xì)胞周期阻滯在S期；Hoechest染色發(fā)現(xiàn)Ara-C處理K562細(xì)胞后呈凋亡形態(tài)改變；吖啶橙染色發(fā)現(xiàn)Ara-C組細(xì)胞綠色熒光增強，細(xì)胞出現(xiàn)大量的酸性自噬小泡；RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)Ara-C上調(diào)自噬關(guān)鍵基因Beclin-1、LC3A和LC3B表達(dá)；Western blot檢測發(fā)現(xiàn)Ara-C增加磷酸化p38表達(dá)；免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)Ara-C增加LC3表達(dá)。結(jié)論 Ara-C能夠激活p-p38介導(dǎo)的K562細(xì)胞發(fā)生自噬，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用。

阿糖胞苷；白血??；自噬；細(xì)胞凋亡

[Abstract] Objective To investigate the effect of cytarabine (Ara-C) on proliferation and apoptosis of human erythroleukemia K562 cell line through autophagy pathway and its possible mechanism.Methods The cellular proliferation inhibiting rate after different concentrations of Ara-C acting for 24,48 h was detected by CCK-8;the cell cycle and apoptosis were detected by flow cytometry(FCM);the chromatin morphological changes in nucleus were observed by Hoechst staining;the cell acidic autophagy vesicles were detected by acridine orange staining;the expression changes of p38 and p-p38 proteins were detected by Western blot．The expressions of autophagy apoptosis related gene and protein were examined by RT-PCR and immunofluorescence.Results The CCK-8 results found that different concentrations of Ara-C could inhibit the proliferation of K562 cells with dose- and time-dependent manners.FCM detecting indicated that Ara-C could increase apoptosis and could arrest the cell cycle at S phase;Hoechest staining showed that K562cells had typical apoptotic morphological changes after Ara-C treating;the Acridine orange staining revealed that Ara-C caused the inclease of the green fluorescene in cells of the Ara-C group,and the cells appeared a great number of acidic autophagy vesicles;RT-PCR results showed that Ara-C up-regulated the expression of autophagy key genes Beclin-1,LC3A and LC3B;Western blot results showed that Ara-C increased the expression of phosphorylated p-p38.Immunofluorescence results showed the expression of LC3B was significantly enhanced.Conclusion Ara-C can activate p-p38 mediated K562 cells to generate autophagy,then inhibit the cell proliferation and promotes apoptosis.

紅白血病是以紅、白(主要是粒細(xì)胞)兩系惡性增生的白血病，其發(fā)病機制為造血干細(xì)胞分化障礙，細(xì)胞周期調(diào)控紊亂，細(xì)胞凋亡受阻的惡性造血系統(tǒng)腫瘤[1]。阿糖胞苷(Ara-C)是白血病化療的常見藥物，其藥理機制是抑制細(xì)胞內(nèi)DNA合成，阻滯細(xì)胞增殖的嘧啶類代謝藥物[2]?，F(xiàn)臨床運用的Ara-C 有3種劑量，分別為高、中、低劑量，其治療的效果有差異，低劑量Ara-C能誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化，高劑量Ara-C能促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用和增強其他化療藥物的敏感性[3]。自噬受到自噬相關(guān)基因調(diào)控，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存及凋亡的功能，也參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程[4]。自噬基因的大量激活可導(dǎo)致細(xì)胞自噬增加，最終引起自噬性細(xì)胞死亡(也稱Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡)[5]。因此，抗腫瘤藥物可以通過自噬途徑殺傷腫瘤細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材料 人紅白血病K562細(xì)胞株購自上海ATCC細(xì)胞庫。每次取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞以1×109個/L接種于10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37 ℃，5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)，每1～2 d傳代和換液。

1.2 儀器與試劑 Ara-C購自美國Sigma公司，用PBS配制成0.1 mol/L的儲存液，-20 ℃條件下避光保存，實驗時用含血清的培養(yǎng)液稀釋成工作液。胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)，Hoechest染液(江蘇碧云天生物公司)，吖啶橙(美國Sigma公司)，p-38、p-p38、LC3B抗體(美國Cell Signaling Technology)，熒光顯微鏡(日本Nikcon公司)，酶標(biāo)儀(550型)、Western blot電泳儀、PCR儀(美國Biorad公司)，流式細(xì)胞儀(BD公司)。

表1 實時熒光定量PCR 相關(guān)基因引物序列

1.3 方法

1.3.1 CCK-8 法 培養(yǎng)對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，以1×104個/孔接種于96孔板中。分別加入不同濃度的Ara-C(0～7.5 μmol/L)，培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8檢測液，輕輕搖勻，孵育2 h 后，用酶標(biāo)儀(波長450 nm)檢測每孔吸光度(A)值，并計算Ara-C的細(xì)胞增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.3.2 FCM檢測周期 培養(yǎng)對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度分別至5×108/L，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。分別加入不同濃度的Ara-C(0、2.5、5.0 μmol/L)作用48 h后，分別收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌1次，加入75%乙醇于4 ℃固定過夜，去除固定液后，加入0.5 mL含PI和RNAase A的DNA 染液，室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞DNA水平，根據(jù)DNA水平計算細(xì)胞周期，重復(fù)實驗3次。

1.3.3 FCM檢測凋亡 培養(yǎng)對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度分別至5×108個/L，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。分別加入不同濃度的Ara-C(0、2.5、5.0 μmol/L)作用48 h后，分別收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌1次，4 ℃ 1 200×g離心5 min。檢測前離心去除固定液，加入碘化丙啶(PI) 和Annexin V，置于冰上染色處理30 min，每組細(xì)胞1×105個，行流式細(xì)胞儀檢測，此實驗重復(fù)3次。

1.3.4 吖啶橙染色 K562細(xì)胞用Ara-C(5.0 μmol/L)作用24 h后，分別收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌1次。用新配制的吖啶橙(2 μ/mL)，37 ℃避光孵育15 min，用PBS漂洗3次后，調(diào)整細(xì)胞濃度，取一滴細(xì)胞懸液滴到玻片上，待細(xì)胞沉積到玻片上時，吸去上層液體，封片置于熒光顯微鏡下觀察酸性的自噬小泡，實驗重復(fù)3次。

1.3.5 Hoechst染色 K562細(xì)胞用Ara-C(5.0 μmol/L)作用24 h后，分別收集各組細(xì)胞，加固定液室溫固定20 min，用預(yù)冷PBS洗滌1次。直接加入Hoechst染色液避光、室溫染色15 min，PBS洗滌3次，再加PBS制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度，滴在載玻片上，封片，觀察，采圖，實驗重復(fù)3次。

1.3.6 RT-PCR 參照試劑盒說明書進(jìn)行，Trizol提取細(xì)胞織總RNA。采用TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄酶試劑和反轉(zhuǎn)錄cDNA。應(yīng)用TaKaRa的SYBRⅡ試劑，PCR反應(yīng)體系為10 μL。檢測自噬重要基因的mRNA 水平。引物由上海生工生物公司提供，引物序列見表1。以GAPDH為內(nèi)參基因，用目的基因與GAPDH 的起始拷貝數(shù)比值表示目的基因的相對表達(dá)量，實驗重復(fù)3次。

1.3.7 Western blot K562細(xì)胞用Ara-C(5.0 μmol/L)作用24 h后，分別收集各組細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌2次，用RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，4 ℃離心后取上清液。BCA法測得蛋白濃度，沸水中煮沸至蛋白完全變性后，保證每孔中有40 μg待測蛋白樣品，行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，分別加入抗體p38、p-p38和β-Actin按1∶1 000稀釋抗體，4 ℃孵育過夜；以1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，再用TBST漂洗3次，每次10 min置于脫色搖床上；最后在保鮮膜上滴入ECL化學(xué)發(fā)光液，在暗室進(jìn)行X膠片曝光，洗片，膠片晾干后。掃描膠片，Quantity One軟件定量分析，此實驗重復(fù)3次。

1.3.8 免疫熒光 K562細(xì)胞用Ara-C(5.0 μmol/L)作用48 h后，收集細(xì)胞，用固定液在室溫下固定細(xì)胞30 min后，用0.3% Triton X-100破膜處理10 min，PBS漂洗3次。在37 ℃濕盒內(nèi)用5%山羊血清封閉30 min后，分別加入一抗LC3B(1∶200)，4 ℃孵育過夜后，于37 ℃復(fù)溫1 h，PBS漂洗3次，再加入1∶500稀釋的紅色熒光標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，室溫避光孵育40 min；最后加入PI作用1 min后，PBS漂洗3次，封片，顯微鏡觀察并采圖，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 Ara-C抑制K562細(xì)胞增殖 CCK-8測細(xì)胞增殖抑制實驗顯示，不同濃度的Ara-C(0.625、1.25、2.5、5.0、7.5 μmol/L) 處理K562細(xì)胞24 h 和48 h 后，各組細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，并呈時間和濃度依賴性(見圖1)。其中Ara-C(7.5 μmol/L)作用24 h 時，細(xì)胞增殖抑制率達(dá)45.93%±2.47%，作用48 h時達(dá)66.10%±4.50%,而Ara-C作用K562細(xì)胞48 h 時，半數(shù)抑制率為5 μmol/L左右。

2.2 Ara-C阻滯K562細(xì)胞周期在S期 不同濃度的Ara-C(2.5、5.0 μmol/L)處理K562細(xì)胞48 h 后，F(xiàn)CM檢測結(jié)果顯示，隨藥物濃度的增加，Ara-C(2.5、5.0 μmol/L)與空白對照組相比，G0/G1和G2/M期細(xì)胞比例降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)； Ara-C(2.5、5.0 μmol/L)與空白對照組相比，S期細(xì)胞比例增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

圖1 Ara-C對K562細(xì)胞的增殖抑制作用

Ara-C(μmol/L)G0/G1G2/MS042.96±3.4613.02±3.4453.02±3.482.536.11±1.977.29±3.7156.60±2.305.031.16±2.303.36±3.2365.48±4.00

2.3 Ara-C誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡 不同濃度的Ara-C(2.5、5.0 μmol/L) 處理K562細(xì)胞48 h 后，F(xiàn)CM檢測結(jié)果顯示隨藥物濃度的增加細(xì)胞早期和晚期凋亡數(shù)量明顯增多，其早期凋亡率分別為5.09%±0.87%、11.00%±1.76%，且隨著濃度的增高，早期凋亡率增高，分別與空白對照組(3.18%±0.52%)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；晚期凋亡率分別為5.78%±1.02%、18.32%±2.16%，且隨著濃度的增高，晚期凋亡率增高，分別與空白對照組(1.19%±0.42%)相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 Ara-C對K562細(xì)胞凋亡的影響

2.4 Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡 Ara-C(5.0 μmol/L)誘導(dǎo)K562細(xì)胞24 h后，用Hoechst染色顯示，細(xì)胞核出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、核碎裂、核邊集的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，并且細(xì)胞發(fā)出藍(lán)色熒光較空白對照組細(xì)胞強，說明Ara-C能誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡(圖2)。

圖2 Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡

2.5 Ara-C誘導(dǎo) K562細(xì)胞自噬 Ara-C(5.0 μmol/L)誘導(dǎo)K562細(xì)胞24 h后，用吖啶橙染色后，觀察細(xì)胞內(nèi)的酸性自噬泡，細(xì)胞內(nèi)綠色小泡代表酸性自噬小體。Ara-C誘導(dǎo)后，與對照組比較，細(xì)胞內(nèi)酸性的自噬小泡明顯增加，而對照組細(xì)胞綠色的自噬小泡基本看不見。

圖3 吖啶橙染色檢測細(xì)胞自噬

2.6 Ara-C影響自噬重要基因的表達(dá) RT-PCR檢測結(jié)果如圖6顯示，與對照組比較，K562細(xì)胞經(jīng)Ara-C(5.0 μmol/L)作用24 h后，自噬重要基因(Atg3、Atg12)在細(xì)胞中變化不明顯，而自噬最重要的基因Atg5、Atg7、Beclin-1、LC3A、LC3B表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中自噬關(guān)鍵基因Beclin-1、LC3A、LC3B表達(dá)上調(diào)尤為明顯。

*：P<0.05，與對照組比較。

圖4 RT-PCR檢測Ara-C影響自噬重要基因的表達(dá)

*：P<0.05，與空白對照組比較。

圖5 Western blot檢測Ara-C影響MAPK通路

圖6 免疫熒光檢測LC3B的表達(dá)

2.7 Western blot檢測Ara-C對MAPK通路的影響 Western blot結(jié)果如圖6顯示，與對照組比較，K562細(xì)胞經(jīng)Ara-C(2.5、5.0 μmol/L)作用24 h后。與空白對照組相比，隨濃度的升高，p38表達(dá)無明顯差異，然而p-p38表達(dá)隨Ara-C濃度增加其表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明Ara-C能激活MAPK信號通路。

2.8 免疫熒光檢測LC3B的表達(dá) 與對照組比較，K562細(xì)胞經(jīng)Ara-C(5.0 μmol/L)作用24 h后，自噬重要蛋白LC3B表達(dá)主要在細(xì)胞質(zhì)中，圖中可見Ara-C作用后，細(xì)胞質(zhì)中的LC3B表達(dá)增加，說明Ara-C能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬(圖6)。

3 討 論

臨床實踐證明，Ara-C在高、中、低3種不同劑量治療急性髓性白血病有不同的療效，其中大劑量Ara-C的使用會對機體產(chǎn)生極大的傷害[3]。本實驗采用了CCK-8法檢測Ara-C對人紅白血病K562細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明Ara-C能有效抑制K562細(xì)胞增殖，但是高劑量是并沒有極大改變Ara-C對白血病細(xì)胞的增殖，為臨床上運用大劑量的Ara-C不能增加療效提供體外實驗依據(jù)。Ara-C是嘧啶類抗代謝藥物，能阻滯細(xì)胞周期在S期，其藥理機制是阻止細(xì)胞DNA合成，從而阻滯細(xì)胞增殖[2]。FCM結(jié)果顯示，Ara-C可將K562細(xì)胞周期阻滯在S期，提示Ara-C可能通過細(xì)胞周期阻滯來抑制K562細(xì)胞增殖。

細(xì)胞自噬和凋亡密切相關(guān)，凋亡的早期，細(xì)胞出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，會出現(xiàn)自噬[5]。自噬異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，可以從不同的生物學(xué)行為影響腫瘤的進(jìn)程，其中有細(xì)胞周期、增殖、凋亡、耐藥、血管生成及腫瘤的治療等方面的調(diào)控[6]。文獻(xiàn)[7]研究報道，自噬和細(xì)胞凋亡的關(guān)系存在兩面性，維持細(xì)胞生存和促進(jìn)細(xì)胞死亡。為了探討Ara-C對白血病細(xì)胞自噬凋亡的關(guān)系，筆者運用了吖啶橙染色，發(fā)現(xiàn)加藥組早期細(xì)胞出現(xiàn)酸性的自噬泡增多，RT-PCR結(jié)果顯示自噬關(guān)鍵基因(Beclin-1、LC3A和LC3B)的表達(dá)均升高，證明了Ara-C能誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生自噬。Ara-C也能促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，F(xiàn)CM和Hoechst染色無論從數(shù)量上還是從形態(tài)上都說明了Ara-C能夠促進(jìn)K562細(xì)胞的凋亡。本實驗結(jié)果顯示了不同濃度的Ara-C可以誘導(dǎo)K562細(xì)胞自噬，也可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，證明Ara-C能夠通過自噬途徑抑制K562細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

自噬的分子誘導(dǎo)機制復(fù)雜且具有高度保守性，MAPK參與調(diào)節(jié)自噬活性，從而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。在腫瘤藥物中JNK、ERK和p38的磷酸化水平都發(fā)生改變，激活p38可以激活細(xì)胞自噬和凋亡[7-8]。本文將研究的重心轉(zhuǎn)移到p38這個可以調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡和自噬的關(guān)鍵因子，Western blot實驗證明Ara-C能改變細(xì)胞中磷酸化p38的水平，這說明Ara-C能激活MAPK信號通路。

LC3B是自噬關(guān)鍵蛋白，其含量在一定程度上反映了自噬活性[9-10]。實驗運用免疫熒光檢測LC3B時，發(fā)現(xiàn)Ara-C能夠增加LC3B的表達(dá)。還有FCM和Hoechst染色無論從數(shù)量上還是從形態(tài)上都說明了Ara-C能夠促進(jìn)K562細(xì)胞的凋亡，這說明Ara-C能夠通過自噬途徑誘導(dǎo)K562細(xì)凋亡。

綜上所述，Ara-C在體外能夠抑制白血病細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)凋亡，其機制可能是通過激活MAPK信號通路，調(diào)控細(xì)胞自噬，從而抑制白血病細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

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《重慶醫(yī)學(xué)》對臨床研究論文醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求

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《重慶醫(yī)學(xué)》編輯部

Experimental study on influence of cytarabine on K562 cells proliferation and apoptosis by autophagy pathway

Luo Hao1,Meng Zan1,Liu Zehong2,Chen Xiaolu3△

(1.Department of Human Anatomy,Histology and Embryology,Leshan Vocational and Technical College,Leshan,Sichuan 614000,China；2.Department of Pathology,Three Gorges Medical College,Chongqing 404120,China；3.Department of Pathology,Leshan Vocational and Technical College,Leshan,Sichuan 614000,China)

Ara-C;leukemia;autophagy;cell apoptosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.13.003

羅昊(1979-)，碩士，講師，主要從事解剖組胚和白血病方面的研究?！?/p>

，E-mail:173290788@qq.com。

R733.7

A

1671-8348(2017)13-1736-04

2016-11-20

2017-01-08)