張 濤，國建飛，邢琳琳，張金玲，張宇新

(1.河北醫(yī)科大學附屬邢臺人民醫(yī)院，河北邢臺 054031；2.邢臺醫(yī)學高等?？茖W校，河北邢臺 054001；3.華北理工大學醫(yī)學院,河北唐山 063000)

·論 著·

塞來昔布下調(diào)Apaf-1蛋白表達促進大鼠顱腦損傷后學習記憶功能恢復的研究*

張 濤1，國建飛1，邢琳琳1，張金玲2，張宇新3

(1.河北醫(yī)科大學附屬邢臺人民醫(yī)院，河北邢臺 054031；2.邢臺醫(yī)學高等專科學校，河北邢臺 054001；3.華北理工大學醫(yī)學院,河北唐山 063000)

目的 探討塞來昔布對大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后學習記憶功能和環(huán)氧化酶(COX-2)及凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)蛋白表達的影響。方法 將72只成年雄性Wistar大鼠等量分為對照組、假手術(shù)組、損傷組和治療組，術(shù)后72 h灌注取腦，應用免疫組化法和Western blot法分別檢測 COX-2 及Apaf-1蛋白表達變化；術(shù)前5 d和術(shù)后72 h采用Morris水迷宮實驗觀察大鼠學習記憶功能。結(jié)果 損傷組COX-2和Apaf-1蛋白表達明顯高于其他組，治療組與損傷組比較蛋白表達均下降(P<0.05)，但仍高于假手術(shù)組和對照組(P<0.05)；Morris水迷宮實驗中，損傷組逃避潛伏期時間延長為4組之最(P<0.05)，治療組較損傷組時間有所縮短(P<0.05)。結(jié)論 COX-2抑制劑塞來昔布可下調(diào)COX-2和Apaf-1蛋白表達，抑制炎性反應、細胞凋亡，改善腦損傷后的學習、記憶障礙。

腦損傷；環(huán)氧化酶-2；凋亡蛋白酶活化因子-1；學習；記憶

眾多的研究表明，炎癥因子所激發(fā)的一系列炎性反應，是加重繼發(fā)性腦損傷的重要原因之一[1]，因此臨床上迅速減少炎性反應所帶來的繼發(fā)性損傷尤為重要。環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)是花生四烯酸代謝的限速酶，后者產(chǎn)生的前列腺素及血栓素是腦創(chuàng)傷后炎癥級聯(lián)反應的重要介質(zhì)，與繼發(fā)性腦損傷關系密切[2]。凋亡蛋白酶活化因子-1(antipernicious anemia factor,Apaf-1)作為線粒體凋亡途徑中一個重要促凋亡因子，能促進凋亡小體的形成，激活通路下游的一系列Caspases成員[3]，切割特定的凋亡底物，最終導致細胞凋亡[4]。本實驗以大鼠顱腦損傷為模型，通過塞來昔布對COX-2蛋白的超選擇性抑制，調(diào)節(jié)凋亡因子Apaf-1蛋白的表達，抑制顱腦損傷后炎性反應和減少神經(jīng)細胞凋亡，為腦損傷的臨床治療提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar大鼠72只，雄性，體質(zhì)量(280±20)g，SPF級，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供[許可證號：SCXX(京)2007-0008]，自由進食飲水，室溫(25±2)℃，自然光照。

1.2 藥品與試劑 塞來昔布購自北京輝瑞制藥有限公司(國藥準字J20120063，規(guī)格200 mg，批號C1420006862)；總蛋白提取試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(南京碧云天生物技術(shù)研究所)；增強型ECL化學發(fā)光檢測試劑盒(美國Biologycal Industries公司)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物有限公司)；兔抗COX-2及Apaf-1多克隆一抗(美國Santa Cruz公司)；兔抗GAPDH多克隆一抗、辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗(美國Abcam公司)；JEM-1230投射電子顯微鏡(日本Jeol公司)；分子生物學凝膠電泳儀及化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；LEICA-Rm2145型半自動輪轉(zhuǎn)切片機(德國Leica公司)。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 將72只SPF級雄性Wistar大鼠分為對照組、開顱即縫合的假手術(shù)組、改良Foda[5]自由落體法建立的損傷組和損傷組基礎上腹腔注射塞來昔布的治療組(250 mg/kg/6 h)，前3組相同條件下注入等量生理鹽水，每組18只大鼠，各組均在造模前5 d隨機選取6只大鼠進行Morris水迷宮訓練，其余各組剩余12只大鼠直至術(shù)后72 h常規(guī)灌注取材。

1.3.2 顱腦損傷模型制備 參照文獻[5]大鼠重型顱腦損傷模型構(gòu)建方法加以改良，制備損傷組模型。術(shù)前禁食8 h并在術(shù)前0.5 h時，腹腔注射阿托品(30 mg/kg)，無不良反應后，以10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，顱頂除毛，75%乙醇消毒術(shù)區(qū)。將大鼠取俯臥位固定于腦立體定向儀上，沿正中矢狀線切口開顱，在冠狀縫及人字縫交匯處暴露骨膜并固定打擊片，將450 g打擊錘以1.2 m高度自由落體后，迅速保護大鼠，防止二次損傷。明膠海綿止血并人工輔助呼吸及傷口清創(chuàng)縫合，術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3.3 標本制備 術(shù)后72 h將各組大鼠以10%水合氯醛(350 mg/kg)經(jīng)腹腔麻醉，沿胸腹腔正中線暴露心尖，用生理鹽水及4%多聚甲醛先后灌注，充分固定后斷頭取腦。腦組織行后固定經(jīng)常規(guī)梯度乙醇脫水、透明、浸蠟、包埋后石蠟橫切片(厚5 μm)，烘干后待染色。

1.3.4 COX-2和Apaf-1免疫組織化學及結(jié)果判斷 術(shù)后72 h，采用Envision二步法對組織切片進行SP染色，分別加入兔抗COX-2、Apaf-1多克隆一抗(1∶50)，用鹽酸鹽緩沖液(PBS)取代一抗作為陰性對照，各組圖片均使用200倍光鏡從左上、左下、右上、右下及中間5個視角攝取結(jié)果。結(jié)果判定：以細胞顏色呈棕褐(黃)色顆粒且強度高于背景非特異性著色則視為陽性結(jié)果。評分要求：一個視野內(nèi)細胞數(shù)大于75%、51%～74%、11%～50%、<10%時分別對應分值為4、3、2、1分，陰性為0分；染色強度評分依次為棕褐色3分、棕黃色2分、淡黃色1分，無色0分；兩項得分相乘為陽性表達“+、++、+++”分別代表3、4、5分，“-”為0～2分屬陰性表達。

1.3.5 Western blot法檢測COX-2、Apaf-1蛋白表達變化 術(shù)后72 h，迅速剝離各組大鼠頂葉皮層下方海馬區(qū)域腦組織，按蛋白提取試劑盒說明提取各組總蛋白。依照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明測定總蛋白濃度，各組攝取統(tǒng)一濃度樣品行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)跑膠、聚偏氟乙烯(PVDF) 轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后行一抗反應(COX-2、Apaf-1一抗1∶200和GAPDF一抗1∶400)，4 ℃孵育過夜，次日行二抗反應1∶500，室溫孵育2 h，ECL試劑盒顯影后使用Bio-Rad攝片，運用Quantity One系統(tǒng)分析各組目的蛋白/GAPDH的相對表達量。

1.3.6 學習記憶能力測試 造模前5 d從各組選取6只大鼠，進行全天各4次，每次60 s，持續(xù)5 d的Morris水迷宮方法定位航行試驗及空間探索訓練[6]。將大鼠從左上、左下、右上、右下方向隨機放入渾濁水中，從入水到爬上隱藏平臺所需時間即逃避潛伏期(escape latency，EL)，記錄每只大鼠每天的EL平均值就是平均逃避潛伏期(average escape latency，AEL)，如超過120 s未能登陸隱藏平臺則引導其登陸，并記錄搜索平臺線路軌跡，此時EL記為120 s，用于觀察學習認知能力；移除水下平臺，記錄大鼠120 s內(nèi)穿過原始平臺所在的位置次數(shù)(停留2 s以上)，考察其記憶能力。

2 結(jié) 果

2.1 COX-2和Apaf-1免疫組織化學結(jié)果 腦組織海馬區(qū)域中運用免疫組織化學法分別檢測4組模型COX-2和Apaf-1表達變化，陽性表達主要位于細胞質(zhì)中呈棕褐或黃色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組及假手術(shù)組均呈陰性表達(圖1A、B；圖2A、B)，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1；損傷組呈棕褐色且數(shù)量較多(圖1C、圖2C)，加入塞來昔布后的治療組呈棕黃色表現(xiàn)(圖1D、圖2D)，與損傷組比較COX-2、Apaf-2均有所減少但仍高于其他兩組(P<0.05)，見表1。

A：對照組；B：假手術(shù)組；C：損傷組；D：治療組。

圖1 腦組織海馬區(qū)域中的COX-2表達(SP，×200)

A：對照組；B：假手術(shù)組；C：損傷組；D：治療組。

圖2 腦組織海馬區(qū)域中的Apaf-1表達(SP，×200)

2.2 Western blot檢測COX-2 和 Apaf-1在各組中蛋白表達變化 COX-2和Apaf-1各組目的條帶分別在72×103和130×103處顯示，與其相對分子質(zhì)量相符(圖3)。蛋白定量分析結(jié)果顯示，COX-2和Apaf-1假手術(shù)組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，損傷組與其他各組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，治療組與損傷組比較均有所降低，但數(shù)值仍高于對照組及假手術(shù)組(P<0.05)，見表2。

表1 免疫組織化學檢測各組COX-2和Apaf-1的陽性表達情況

圖3 Western blot檢測COX-2和Apaf-1在各組中的蛋白表達變化

組別COX-2/GAPDHApaf-1/GAPDH對照組0.46±0.090.57±0.05假手術(shù)組0.57±0.140.42±0.09損傷組2.79±0.482.41±0.33治療組1.64±0.361.24±0.12F16.44838.514

2.3 Morris水迷宮測試結(jié)果 術(shù)后1周對各組大鼠進行連續(xù)4 d Morris水迷宮測試，其中AEL和探索次數(shù)可有效反映大鼠認知功能，而大鼠游泳軌跡分為4種：隨機型、邊緣型、直線型及趨向型，其中直線型和趨向型則最能反映大鼠記憶功能。通過對比各組大鼠行為學測試發(fā)現(xiàn)，對照組和假手術(shù)組無論AEL、探索次數(shù)還是游泳軌跡均較為接近，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。損傷組與其他3組比較AEL時間均明顯延長，探索次數(shù)也均顯著降低，認知功能顯著下降(P<0.05)，通過對游泳軌跡發(fā)現(xiàn)，直線型和趨向型次數(shù)均屬組別最低，記憶能力嚴重受損(P<0.05)。治療組與創(chuàng)傷組比較AEL時間、探索次數(shù)以及直線型和趨向型游泳軌跡次數(shù)均有所改善，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠Morris水迷宮AEL和探索次數(shù)

表4 Morris水迷宮大鼠游泳軌跡檢測(次)

3 討 論

腦損傷后尋找有效的神經(jīng)保護藥物，對于患者的學習記憶及運動功能障礙的恢復尤為重要。炎性反應是導致神經(jīng)元繼發(fā)性損傷進行性加重的重要原因，而COX-2 是介導炎性反應的關鍵酶，因此在繼發(fā)性腦損傷中如何抑制COX-2介導的炎性反應有著重大意義。COX-2是花生四烯酸(AA)代謝的限速酶，產(chǎn)生的前列腺素及血栓素是腦創(chuàng)傷后炎癥級聯(lián)反應的重要介質(zhì)。炎癥介質(zhì)前列腺素E2(Prostaglandin，PGE2)生物合成的限速酶[7-9]，其代謝產(chǎn)物可導致白細胞介素(IL)-1、一氧化氮(NO)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)增多[7]。Apaf-1 是一個具有多功能結(jié)構(gòu)域的蛋白，JNK 途徑中是線粒體依賴的關鍵蛋白酶，由3個結(jié)構(gòu)域組成，其氨基末端有一個半胱氨酸蛋白酶募集域(caspase recruitment domain，CARD) ，CED24 同源域內(nèi)包含一個保守P環(huán)，羧基末端則由12 個 WD240 重復片段組成。另外，Apaf-1在細胞凋亡過程中，起著“扳機點”的作用，活化的 Apaf-1通過 N 端的 CARD 結(jié)構(gòu)域與 Pro-Caspase-9 分子中的 CARD 結(jié)構(gòu)域形成寡聚化，活化的Caspase-9 可激活下游其他 Caspases 成員，導致細胞發(fā)生不可逆的凋亡[10-13]。

Caspases-3在凋亡過程中處于蛋白級聯(lián)反應的核心位置，一旦被活化將使蛋白酶級聯(lián)反應放大，促使細胞發(fā)生不可逆的凋亡[14]。筆者在既往的實驗中發(fā)現(xiàn)，塞來昔布能夠減少顱腦損傷后大鼠海馬區(qū)域Caspases-3 蛋白的表達，并且與COX-2蛋白表達呈正相關[15]。有研究報道COX-2/NF-κB信號通路與Apaf-1/caspase凋亡通路緊密相關，通過抑制COX-2表達可明顯降低Apaf-1表達，從而抑制細胞凋亡[16]。本研究通過免疫組織化學及Western blot結(jié)果均證實損傷組COX-2、Apaf-1的蛋白表達較假手術(shù)組均明顯增高，治療組表達量均明顯低于損傷組，提示COX-2抑制劑塞來昔布可有效抑制或減少細胞凋亡；海馬作為腦損傷后易損區(qū)，損傷后出現(xiàn)神經(jīng)細胞延遲性死亡，可導致長期學習記憶功能障礙[1]。Morris水迷宮檢測方法是檢測動物學習記憶功能的經(jīng)典方法，實驗結(jié)果顯示通過塞來昔布治療后AEL時間、探索原始平臺以及游泳軌跡較損傷組均有明顯改善，且差異均有統(tǒng)計學意義，這表明塞來昔布能夠顯著提高顱腦損傷后對大鼠的認知能力和記憶能力。

另外COX-2作用下產(chǎn)生PG類產(chǎn)物可以通過誘導bcl-2和Bax 基因突變，抑制Bcl-2蛋白表達，并能逆向降低Bax蛋白的表達，進一步促進了細胞凋亡[16]，而且增多的Bax蛋白還可以通過以下原因加速細胞的凋亡：(1)線粒體滲透性轉(zhuǎn)換、氧化磷酸化和三磷酸腺苷的合成功能被破壞；(2)細胞氧化還原作用改變；(3)促進線粒體中的凋亡相關分子Apaf-1釋放，與細胞色素C相互作用，激活Caspase信號轉(zhuǎn)導途徑[11]。

COX-2 在炎癥組織中可被IL-1、TNF-α等多種炎性因子所誘導，表達水平迅速升高，引起炎癥部位的PGE、PGI的快速增加，加劇炎性反應和組織損傷。顱腦損傷后腦膠質(zhì)細胞以及神經(jīng)元中均有TNF-α、IL-1、IL-6和NO的表達增加，臨床檢驗也證實，患者的腦脊液及血漿中上述炎癥因子檢測值遠遠高于正常值水平，而上述炎癥因進一步通過誘導COX-2表達，加速了由其介導的炎性反應[17]。推斷COX-2可能通過以下途徑加重繼發(fā)性腦損傷：(1)打破PGI2和TXA2保持動態(tài)平衡，導致TXA2增多，引發(fā)了血管的收縮以及微血栓的形成，導致腦缺血的發(fā)生；(2)使血-腦屏障通透性增加，加速了炎癥因子進入腦組織，引發(fā)了神經(jīng)元的損傷；(3)COX-2增強興奮性氨基酸的毒性作用，特別是增加了N甲基-D天冬氨酸介導的神經(jīng)毒性作用，引發(fā)神經(jīng)元直接損傷。上述諸多因素均導致神經(jīng)細胞凋亡壞死，引發(fā)相應的神經(jīng)功能障礙[18]。

學習記憶功能是大腦最重要的高級神經(jīng)功能之一，同時也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的整合。創(chuàng)傷后遺留的記憶障礙嚴重影響患者的康復，探尋創(chuàng)傷后改善學習記憶障礙的藥物具有極其重要的意義。塞來昔布作為經(jīng)典的COX-2高選擇性特異性抑制劑，已廣泛應用于臨床的鎮(zhèn)痛治療，筆者研究發(fā)現(xiàn)該藥能顯著改善傷后大鼠的認知功能障礙。本實驗證實，顱腦損傷后塞來昔布能通過抑制由COX-2介導的一系列炎性反應，來減少由Apaf-1 作為“扳機點”引發(fā)的神經(jīng)元的凋亡，既減少由炎性反應帶來的繼發(fā)性腦損傷，能減少神經(jīng)元的凋亡，為改善顱腦損傷后學習記憶功能障礙提供了新的思路。

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Celecoxib down-regulates Apaf-1 protein expression for promoting learning and mem craniocerebral traumaory function recovery after in rats*

Zhang Tao1,Guo Jianfei1,Xing Linlin1,Zhang Jinling2,Zhang Yuxin3

(1.Hebei Medical University Afficiated Xingtai People′s Hospital,Xingtai,Hebei 054031,China;2.Xingtai Medical College,Xingtai,hebei 054001,China;3.Medical College,North China Institute of Technology,Tangshan,Hebei 063000,China)

[Abstract] Objective To study the effect of celecoxib on learning and memory function,cyclooxygenase(COX-2) and the apoptotic protease-activating factor -1(Apaf-1) protein expression after traumatic brain injury in rat.Methods A total of 72 adult male Wistar rats were equally and randomly divided into the normal control group,sham operation group,trauma group and Celecoxib treatment group.Postoperative 72 h-reperfusion was performed for taking brain specimens.The immunohistochemical method and Western blot were used to respectively detect COX-2 and Apaf-1 protein expression change;the Morris water maze test was adopted to detect the learning and memory function on preoperative 5 d and at postoperative 72 h.Results The COX-2 and Apaf-1 protein expression in the trauma group was significantly higher than that in other groups (P<0.05),and the protein expression in the treatment group and trauma group was decreased,but still higher than that in the sham operation group and normal group(P<0.05);in the Morris water maze test,the prolongation of escape latency time in the trauma group was maximal among 4 groups (P<0.05),but the treatment group had a shorter time compared with the trauma group (P<0.05).Conclusion Craniocerebral trauma can cause different degrees of learning and memory dysfunction,and COX-2 inhibitor celecoxib can downregulate the expression of COX-2 and Apaf-1 protein,inhibit inflammation reaction and cellular apoptosis,and improve the learning and memory dysfunction after traumatic brain injury.

brain injuries;cyclooxygenase-2;apoptotic protease-activating factor-1;learning;memory

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.13.002

河北省自然科學基金資助項目(C2004000689)；河北省博士基金資助項目(05547008D-4)；河北省科學技術(shù)與社會發(fā)展計劃項目(04276135)。 作者簡介：張濤(1980-)，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事顱腦損傷治療研究。

R651.1+5

A

1671-8348(2017)13-1732-04

2016-11-19

2017-01-07)