龐逸敏+++甘露+++王獻哲++蘇棋+++郭哲+++何萍

[摘要]目的 建立脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細胞炎癥模型，探討塞來昔布對其分泌炎癥因子的影響。方法 培養(yǎng)小鼠RAW 264.7巨噬細胞，采用1 μg/ml的LPS刺激小鼠RAW 264.7巨噬細胞24 h后，收集細胞培養(yǎng)基，采用Griess法測定一氧化氮（NO）及ELISA法測定腫瘤壞死因子α（TNF-α）、前列腺素E2（PGE2）的含量，從而建立LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細胞炎癥模型。采用MTT法檢測塞來昔布對LPS刺激的RAW 264.7巨噬細胞的毒性作用后，選用8.00 μmol/L塞來昔布預(yù)處理細胞1 h，再加入1 μg/ml LPS刺激細胞24 h，收集細胞培養(yǎng)基，測定培養(yǎng)基中炎癥因子NO、TNF-α及PGE2的含量。結(jié)果 1 μg/ml的LPS刺激RAW 264.7巨噬細胞24 h后，細胞形態(tài)出現(xiàn)明顯變形，細胞培養(yǎng)基中炎癥因子NO及TNF-α、PGE2含量均較正常對照組明顯增高（P<0.01）。與DMSO溶劑對照組相比，8.00 μmol/L塞來昔布組能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細胞炎性因子NO、TNF-α及PGE2的釋放（均P<0.01）。結(jié)論 成功建立LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細胞炎癥模型，塞來昔布可明顯抑制其炎癥因子NO、TNF-α及PGE2的分泌。

[關(guān)鍵詞]塞來昔布；RAW 264.7巨噬細胞；脂多糖；一氧化氮；腫瘤壞死因子α；前列腺素E2

[中圖分類號] R-332 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）04（a）-0004-04

Influence of Celecoxib on inflammatory cytokines of inflammation model in RAW 264.7 macrophages induced by lipopolysaccharide

PANG Yi-min1 GAN Lu1 WANG Xian-zhe1 SU Qi1

1.Department of Pharmacology，School of Pharmacy，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China；2.Department of Emergency，the Third Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China；3.Laboratory Animal Center，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China

[Abstract]Objective To investigate the influence of Celecoxib on the secretion of inflammatory cytokines in RAW 264.7 macrophages model induced by lipopolysaccharide （LPS）.Methods Mouse RAW 264.7 macrophage was cultured.24 h after mouse RAW 264.7 macrophage was stimulated by LPS 1 μg/ml，then cell culture medium was collected.NO was tested by using Griess and the content of TNF-α and PGE2 was tested by ELISA.Then the RAW 264.7 macrophage inflammation model was established.The toxic effect of celecoxib on LPS stimulated RAW 264.7 macrophages assayed by MTT.8.00 μmol/L Celecoxib was used to pretreat cell for 1 h，following of 1 μg/ml LPS added to stimulate cell for 24 h.Cell culture medium was collected to test the content of inflammatory factors NO，TNF-α and PGE2 in culture medium.Results After 1 μg/ml of LPS stimulated RAW macrophages for 24 h，cell morphology changed obviously，the content of inflammatory factors NO，TNF-α and PGE2 in culture medium were obvious higher than those of the control group （P<0.01）.Compared with DMSO control group，8.00 μmol/L Celecoxib group could significantly inhibit the release of inflammatory cytokines NO，TNF-α and PGE2 induced by LPS in RAW 264.7 cells （P<0.01）.Conclusion Establishment of LPS induced macrophage model of RAW 264.7 and celecoxib can obvious inhibit the release of inflammatory cytokines NO，TNF-α and PGE2.

[Key words]Celecoxib；RAW 264.7 macrophage；Lipopoly-saccharide；NO；TNF-α；PGE2

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是嚴(yán)重危害人類健康的常見病與多發(fā)病，也是冠心病、腦梗死、外周血管病的主要原因。近年來，AS被普遍理解為一種發(fā)生在血管壁的慢性炎癥[1]。巨噬細胞是AS炎癥病理過程中的代表性細胞，巨噬細胞及巨噬細胞相關(guān)的主要生物大分子在AS的發(fā)生、發(fā)展全過程中起重要作用[2]。RAW 264.7細胞是小鼠腫瘤來源的單核/巨噬細胞系株，被細菌內(nèi)毒素的主要成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激后會釋放多種過量的炎癥因子，是AS研究中常用的炎癥細胞模型。

環(huán)氧合酶-2（COX-2）選擇性抑制劑是目前廣泛使用的非甾體類抗炎藥（NSAIDs）。與傳統(tǒng)的NSAIDs相比，COX-2選擇性抑制劑在具有鎮(zhèn)痛、抗炎作用的同時，也具有良好的胃腸道安全性[3]。但自21世紀(jì)初以來，默克公司宣布全球主動撤回高選擇性COX-2抑制劑羅非昔布的舉動，引起了全球?qū)τ贑OX-2選擇性抑制劑心血管危險的關(guān)注。大量研究顯示，對于原有心血管病疾病的患者，COX-2選擇性抑制劑可能增加心肌梗死、腦卒中等嚴(yán)重心腦血管方面的危險[4-6]，而COX-2選擇性抑制劑對AS的作用也始終存在爭議[7]。

本研究以小鼠RAW 264.7巨噬細胞為研究對象，采用LPS誘導(dǎo)其活化建立巨噬細胞炎癥模型，同時觀察COX-2選擇性抑制劑塞來昔布（Celecoxib）對LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞炎癥因子分泌的影響，以初步探討COX-2選擇性抑制劑對AS及相關(guān)心腦血管疾病的影響及其可能機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株與試劑 塞來昔布（純度≥98%，Sigma公司），二甲基亞砜（DMSO）（Sigma公司）；小鼠RAW264.7巨噬細胞（中國科學(xué)院上海細胞庫）；DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone公司）；胎牛血清（GemCell公司）；青鏈霉素混合液（100×）（北京索萊寶科技有限公司）；脂多糖（LPS L2880，Sigma公司）；MTT（Biosharp生物科技）；一氧化氮（NO）試劑盒（碧云天生物公司）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒（武漢博士德公司）；前列腺素E2（PGE2）ELISA試劑盒（美國Cayman公司）。

1.1.2儀器 酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）。

1.2方法

1.2.1小鼠RAW 264.7巨噬細胞的培養(yǎng) 將RAW 264.7巨噬細胞接種在含10%胎牛血清（<0.5 EU/ml）、1%青霉素和鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)細胞覆蓋率達到約90%時，棄掉上清，直接加入37℃培養(yǎng)基吹打傳代。取對數(shù)期細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細胞炎癥模型的建立 取對數(shù)期生長的RAW 264.7細胞以每孔20×103個細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，待24 h細胞貼壁后，設(shè)置正常對照組和LPS模型組，每組6個復(fù)孔。正常對照組以無血清DMEM培養(yǎng)基孵育細胞，LPS模型組則以含1 μg/ml LPS的無血清DMEM培養(yǎng)基孵育細胞，孵育24 h后，觀察細胞形態(tài)變化，并收集細胞培養(yǎng)基測定炎癥因子NO及TNF-α、PGE2含量[8]。

1.2.3 MTT法檢測塞來昔布對LPS刺激的RAW 264.7巨噬細胞的細胞毒性試驗 取對數(shù)期生長的RAW 264.7細胞以每孔3×103個細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，待24 h細胞貼壁后，設(shè)置正常對照組、LPS模型組、塞來昔布組（塞來昔布+LPS）及DMSO溶劑對照組（DMSO+LPS），每組6個復(fù)孔。正常對照組和LPS模型組先以無血清DMEM培養(yǎng)基孵育細胞，塞來昔布組分別以含終濃度為40.00、30.00、10.00、8.00、3.00、1.00、0.30、0.10、0.03 μmol/L塞來昔布的無血清DMEM孵育細胞，DMSO溶劑對照組則在無血清DMEM中加入等體積DMSO孵育細胞。按上述處理方式孵育細胞1 h后，除正常對照組采用無血清DMEM繼續(xù)孵育外，其余各組再加入終濃度為1 μg/ml LPS刺激細胞，24 h后收集各孔培養(yǎng)基，在每孔中加入5 g/L MTT 10 μl，補足DMEM至100 μl（MTT終濃度為0.5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入150 μl DMSO，震蕩10 min，在570 nm處測量各孔的吸光度。

1.2.4塞來昔布對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細胞炎癥因子分泌的影響 取對數(shù)期生長的細胞以每孔20×103個細胞接種于96孔的細胞培養(yǎng)板中，待24 h細胞貼壁后，設(shè)置正常對照組、塞來昔布組（塞來昔布+LPS）及DMSO溶劑對照組（DMSO+LPS），每組6個復(fù)孔。各組處理方式同“1.2.3”，塞來昔布組僅采用8 μmol/L塞來昔布孵育細胞。以上三組分別處理完畢后，收集細胞培養(yǎng)基測定炎癥因子NO及TNF-α、PGE2的含量。

1.2.5 NO、TNF-α和PGE2的含量測定 按上述處理方式收集各孔細胞培養(yǎng)基后，分別采用Griess法測定NO及ELISA法測定TNF-α、PGE2含量，操作參照試劑盒說明書進行。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以x±s表示，兩樣本均數(shù)的比較采用Student T-Test檢驗，多樣本組間均數(shù)的比較采用One-way ANOVA檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細胞炎癥細胞模型的建立

作用24 h后在顯微鏡下進行形態(tài)學(xué)觀察，正常對照組RAW 264.7巨噬細胞體積較小，呈邊緣明亮的類圓形，偶有細長觸角，符合巨噬細胞形態(tài)；經(jīng)1 μg/ml LPS刺激24 h后，細胞體積明顯增大并伸出大量偽足，呈菱形、梭形、長條形等不規(guī)則形狀，且細胞內(nèi)有大量空泡。與正常對照組相比，LPS模型組NO及TNF-α、PGE2含量均明顯增高（P<0.01）（圖1、圖2）。

2.2 MTT法測定塞來昔布對LPS刺激的RAW 264.7巨噬細胞的細胞毒性試驗

經(jīng)MTT法檢測，LPS模型組及DMSO溶劑對照組的細胞存活率與正常對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。40、30 μmol/L塞來昔布組的細胞存活率較正常對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；10.00、8.00、3.00、1.00、0.30、0.10、0.03 μmol/L塞來昔布組的細胞存活率則與正常對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），且8.00 μmol/L塞來昔布組的細胞存活率接近100%，故選用8 μmol/L塞來昔布進行后續(xù)實驗。

2.3塞來昔布對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細胞炎癥因子分泌的影響

與正常對照組相比，DMSO溶劑對照組炎癥因子NO、TNF-α及PGE2的含量均明顯增高（P<0.01）；與DMSO溶劑對照組相比，8 μmol/L塞來昔布組能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細胞炎性因子NO、TNF-α及PGE2的分泌（均P<0.01）。

3討論

炎癥反應(yīng)是多細胞因子通過調(diào)節(jié)促炎和抗炎系統(tǒng)之間的平衡而參與炎癥發(fā)生、發(fā)展的過程。目前，在體外細胞炎癥模型制作中，LPS是最主要、作用最強的促炎手段。LPS是革蘭陰性桿菌細胞壁外膜的主要組分，能誘導(dǎo)活化炎癥細胞引起炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致多種促炎性細胞因子的產(chǎn)生，促炎性細胞因子的分泌可誘導(dǎo)炎性細胞的進一步激活，從而導(dǎo)致過度或失控的炎癥反應(yīng)，最終引起組織器官的炎性病理損傷。

AS具有慢性炎癥反應(yīng)特征的病理過程，其發(fā)展始終伴隨炎癥反應(yīng)。單核/巨噬細胞是AS炎癥反應(yīng)的重要效應(yīng)細胞，一方面，巨噬細胞產(chǎn)生多種炎性細胞因子，促進血栓形成，擴大斑塊面積，增加斑塊的不穩(wěn)定性，在AS病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用；另一方面，巨噬細胞也可產(chǎn)生如白細胞介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等抗炎因子，增加AS斑塊的穩(wěn)定性，進而起保護作用[9]。

炎癥因子TNF-α、NO及PGE2作為經(jīng)典的急性炎癥早期細胞因子，常用于衡量炎癥模型成功與否的標(biāo)準(zhǔn)[10-11]。其中，TNF-α是巨噬細胞在炎癥反應(yīng)中產(chǎn)生的主要促炎細胞因子，在機體中可影響包括細胞增殖、分化及凋亡等一系列細胞功能的調(diào)節(jié)，其表達增加還可促進氧自由基的產(chǎn)生導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂，是AS進程中非常重要炎性因子[12]。NO是一種有重要生物學(xué)意義的無機小分子，具有殺滅細菌等病原體微生物活化巨噬細胞的作用[13]，能夠介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。NO由一氧化氮合酶（NOS）經(jīng)一系列氧化還原反應(yīng)生成，在動脈粥樣硬化浸潤的巨噬細胞中，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）表達增高，由iNOS衍生的過量NO誘導(dǎo)的硝化應(yīng)激會引起過度炎癥反應(yīng)，加重動脈粥樣硬化[14]。PGE2是COX-2的主要代謝產(chǎn)物，COX是催化花生四烯酸（AA）合成各種內(nèi)源性前列腺素（PGs）和血栓素（TXs）的限速酶。COX主要分為COX-1和COX-2，其中COX-2酶為誘導(dǎo)型酶。COX-2通常被認為主要與炎癥等過程中PGs的生成相關(guān)，與AS的發(fā)生發(fā)展成正相關(guān)。COX-2表達局限在粥樣斑塊的巨噬細胞/泡沫細胞、平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞中，在炎性因素影響下COX-2及其產(chǎn)物PGE2可被迅速誘導(dǎo)表達，促進AS炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展[15]。本實驗結(jié)果顯示，1 μg/ml LPS誘導(dǎo)24 h后，RAW 264.7巨噬細胞發(fā)生了明顯的活化的形態(tài)學(xué)改變，炎癥因子NO、TNF-α及PGE2分泌水平亦較正常對照組顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），提示已成功建立LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細胞炎癥模型。

雖然較多實驗發(fā)現(xiàn)COX-2抑制劑能減輕血管炎癥、減少單核細胞浸潤、改善血管壁細胞功能而延緩AS進程、增加斑塊穩(wěn)定性，從而減少AS血栓事件[16]，但也有COX-2抑制劑加重AS[17]或?qū)S無影響[18]的報道。為探討COX-2選擇性抑制劑對AS及相關(guān)心腦血管疾病的影響及可能機制，在成功建立LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細胞炎癥模型基礎(chǔ)上，本實驗初步觀察了COX-2選擇性抑制劑塞來昔布對LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞部分炎癥因子分泌的影響。MTT結(jié)果顯示，0.03～10.00 μmol/L的塞來昔布對LPS刺激的RAW 264.7巨噬細胞無明顯細胞毒性（與正常對照組比較，P<0.05）。以細胞存活率接近100%的8.00 μmol/L塞來昔布作用于LPS刺激的RAW 264.7巨噬細胞后，可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 246.7巨噬細胞炎癥因子NO、TNF-α及PGE2的分泌。塞來昔布通過選擇性抑制COX-2酶可抑制炎癥因子PGE2的生成，但塞來昔布通過何種機制抑制炎癥因子NO及TNF-α的生成？此外，塞來昔布在抑制NO、TNF-α及PGE2等炎癥因子分泌的同時，為何卻可增加AS及相關(guān)心血管事件的發(fā)生？因此，有必要在此炎癥細胞模型基礎(chǔ)上展開進一步研究。

[參考文獻]

[1]劉俊田.動脈粥樣硬化發(fā)病的炎癥機制的研究進展[J].西安交通大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2015，36（2）：141-152.

[2]Galkina E，Ley K.Leukocyte influx in atherosclerosis[J].Curr Drug Targets，2007，8（12）：1239-1248.

[3]呂田，葉海，張燦.安全性高的非甾體抗炎藥的研究進展[J].中國新藥雜志，2016，25（11）：1258-1265.

[4]王寧，秦明照.選擇性環(huán)氧化酶-2抑制劑與心血管事件風(fēng)險[J].心血管病學(xué)進展，2013，34（2）：170-173.

[5]Cannon CP，Cannon PJ.Physiology：COX-2 inhibitors and cardiovascular risk[J].Science，2012，336（6087）：1386-1387.

[6]Warner TD，Mitchell JA.COX-2 selectivity alone does not define the cardiovascular risks associated with non-steroidal anti-inflammatory drugs[J].Lancet，2008，371（9608）：270-273.

[7]毛近隆，李曉宇，孫蓉.環(huán)氧合酶（COX-2）抑制劑提高心血管安全性的抗炎機制探討[J].中國中藥雜志，2014，39（20）：4054-4059.

[8]余功旺，黃文浩，劉愛梅，等.小鼠腹腔巨噬細胞炎癥模型的建立[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報，2014，30（6）：766-770.

[9]閻雨，何陽陽，方蓮花，等.巨噬細胞在動脈粥樣硬化中的研究進展[J].中國藥學(xué)雜志，2014，49（1）：7-10.

[10]李玉秀，李覃，姬文婕，等.土荊皮乙酸對脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細胞炎癥反應(yīng)及M1表型偏移的抑制作用[J].細胞與分子免疫學(xué)雜志，2016，32（5）：625-629.

[11]Brune K，Patrignani P.New insights into the use of currently available non-steroidal anti-inflammatory drugs[J].J Pain Res，2015，8：105-118.

[12]郭雨龍，劉爽.動脈粥樣硬化的炎癥因素：感染及自身免疫病[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2016，32（10）：1713-1716.

[13]黃波，陳暢.一氧化氮的功能及其作用機制（Ⅰ）——性質(zhì)與功能[J].生物物理學(xué)報，2012，28（3）：173-184.

[14]邊寧，龔博君，郭軍，等.一氧化氮/誘導(dǎo)型一氧化氮合酶在動脈粥樣硬化過程中的作用[J].中國病理生理雜志，2014，30（3）：414-418.

[15]郭遠林，陳紀(jì)林.環(huán)氧化酶2與動脈粥樣硬化：爭議與前景[J].中華心血管病雜志，2006，34（1）：85-87.

[16]Romero FI，Martínez-Calatrava MJ，Sánchez-Pernaute O，et al.Pharmacological modulation by celecoxib of cachexia associated with experimental arthritis and atherosclerosis in rabbits[J].Br J Pharmacol，2010，161（5）：1012-1022.

[17]Raval M，F(xiàn)rank PG，Laury-Kleintop L，et al.Celecoxib combined with atorvastatin prevents progression of atherosclerosis[J].J Surg Res，2010，163（2）：113-122.

[18]Gitlin JM，Loftin CD.Cyclooxygenase-2 inhibition increases lipopolysaccharide-induced atherosclerosis in mice[J].Car-diovasc Res，2009，81（2）：400-407.

（收稿日期：2017-02-24 本文編輯：祁海文）