汪庚明，周 燕，孫 謙，徐洪波，查從亮，江 浩，項 平，陳振東

內(nèi)皮祖細胞攜帶KAI1/CD82基因對人鼻咽癌細胞裸鼠模型肺轉移的影響

汪庚明1，周 燕1，孫 謙1，徐洪波1，查從亮2，江 浩1，項 平3，陳振東4

目的 探討KAI1/CD82基因在鼻咽癌侵襲轉移中的作用，分析轉染KAI1/CD82基因的內(nèi)皮祖細胞在鼻咽癌防治中的應用價值。方法 應用過表達KAI1/CD82基因的慢病毒轉染血管內(nèi)皮祖細胞，獲得高表達KAI1/CD82基因的穩(wěn)轉細胞(KAI1/CD82-EPCs)；構建荷人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型，通過裸鼠尾靜脈注入KAI1/CD82-EPCs；觀察KAI1/CD82-EPCs對裸鼠腋下移植瘤及其轉移灶的影響。結果 EPCs組、空白組和KAI1/CD82-EPCs組成瘤時間(天)分別為14.70±3.81、15.05±3.85、14.20±3.55，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.771)；EPCs組、空白組和KAI1/CD82-EPCs組移植瘤的重量(g)分別為1.388±0.204、1.487±0.223、1.485±0.234，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.274)；EPCs組、空白組和KAI1/CD82-EPCs組肺轉移灶生成率分別為55%、45%和10%，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.005)，三組肺臟的轉移灶數(shù)目分別為34.27±5.35、38.44±9.63、17.50±3.54，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.007)；注射KAI1/CD82-EPCs的實驗組肺轉移灶KAI1/CD82呈陽性，EPCs組和空白組肺轉移灶KAI1/CD82呈陰性。結論 轉染KAI1/CD82基因的EPCs對鼻咽癌裸鼠模型的肺轉移具有抑制作用。

鼻咽腫瘤；轉移抑制基因；KAI1/CD82；血管內(nèi)皮祖細胞

轉移是鼻咽癌治療失敗主要原因之一，在精確放療時代尤為突出。腫瘤細胞基因組是決定鼻咽癌轉移習性的根本因素，故探討轉移相關基因在鼻咽癌轉移中的作用顯得極為重要。內(nèi)皮祖細胞是一類能夠分化為成熟的血管內(nèi)皮細胞的前體細胞。臨床研究顯示內(nèi)皮祖細胞能夠定向歸巢于腫瘤組織[1]，利用此特性可將內(nèi)皮祖細胞作為靶向運輸至腫瘤組織的基因載體[2]。本實驗擬建立荷人鼻咽癌細胞株裸鼠模型，構建高表達KAI1/CD82基因的穩(wěn)轉細胞(KAI1/CD82-EPCs)，鼻咽癌荷瘤小鼠尾靜脈注射KAI1/CD82-EPCs，分析KAI1/CD82基因對該模型轉移能力的影響；從而推斷KAI1/CD82基因在鼻咽癌轉移過程中的作用和價值，為臨床預測鼻咽癌患者是否發(fā)生轉移、個體化治療以及應用腫瘤轉移抑制基因進行早期干預治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 CNE-2Z人鼻咽癌細胞株購自上海優(yōu)選公司；內(nèi)皮祖細胞在本課題組前期研究中獲得，經(jīng)形態(tài)學觀察、流式細胞儀表型鑒定及雙熒光染色鑒定；BALB/c-nu雌性裸鼠60只，限齡4～6周，購自南京斯科瑞公司；過表達KAI1/CD82基因的慢病毒，購自上海吉滿基因公司。

1.2 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基購自上海生工公司，凝聚胺(Polybrene)購自上海博普公司，四甲基乙二胺(TEMED)購自美國Sigma公司，KAI1/CD82抗體購自美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 過表達KAI1/CD82基因的慢病毒轉染內(nèi)皮祖細胞 在進行慢病毒轉染前18～24 h，將貼壁的內(nèi)皮祖細胞以每孔1×105鋪到24孔板中，使細胞在慢病毒轉染時的數(shù)量每孔約2×105。第2天用2 mL含6 μg/mL的Polybrene新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，并根據(jù)預實驗得到最適MOI值(50)作為標準，加入對應的病毒懸液，37 ℃孵育。4 h后加入2 mL新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使用新鮮培養(yǎng)基替換原含病毒的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后在熒光顯微鏡下觀察轉染效率，可見熒光表達明顯，72 h后顯示熒光表達率更高。在轉染3天后，使用嘌呤霉素(2.5 μg/μL)進行篩選，在篩選6天后細胞轉染陽性率可達90%以上。

1.3.2 過表達KAI1/CD82基因的慢病毒轉染內(nèi)皮祖細胞后行Western blot檢測 根據(jù)KAI1/CD82基因的分子量配制5%濃縮膠和10%分離膠；將1×電泳緩沖液加入電泳池，取10 μL已煮過的蛋白，向泳道加入。將濃縮膠電壓設置為70 V，分離膠電壓設置為100 V，電泳，至溴酚藍達凝膠底邊緣處時停止，于凝膠下緣切角處做標記，使用超純水沖洗，再在常溫下用考馬斯亮藍緩慢振蕩染色，2 h后用超純水清洗，再用脫色液浸泡凝膠，更換3～5次脫色液后蛋白條帶變清晰。轉膜：電泳結束后根據(jù)預染Marker的位置，裁取目的蛋白及內(nèi)參，并放轉膜緩沖液中浸泡。使用轉膜緩沖液浸泡剪好的硝酸纖維素膜(NC膜)，約10 min，再由陰極到陽極的順序放纖維墊-濾紙-凝膠-NC膜-濾紙-纖維墊，將電泳槽放在冰浴中，開始電泳，設置80 mA的恒流，時間110 min。封閉：取膜，并用5%脫脂牛奶浸潤NC膜，并置搖床上緩慢搖晃約1 h。孵育一抗：用TBST稀釋KAI1/CD82一抗后將NC膜封閉于塑料袋中，并于37 ℃水浴箱1 h后4 ℃冰箱過夜，次日再置于37 ℃水浴箱中，經(jīng)40 min孵育，再置搖床搖晃20 min。經(jīng)4次TBST液洗膜后孵育二抗：按1 ∶3 000的比例用TBST液稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗，P膜封閉于塑料袋中，置于水浴箱孵育，37 ℃ 30 min，搖晃30 min。將底物顯色劑滴與P膜上，在經(jīng)曝光、顯影、掃描后得所需蛋白質條帶。用同樣的方法孵育內(nèi)參抗體并得到所需的蛋白質條帶。

1.3.3 構建荷人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型 將裸鼠用隨機數(shù)字法分成3組(A、B、C)，每組20只，使用0.2 mL的CNE-2Z細胞株腋下注射預養(yǎng)的60只裸鼠。接種后，密切觀察裸鼠變化，記錄成瘤時間。在裸鼠接種腫瘤后一周，采用裸鼠尾靜脈直接注射法給予干預。具體分組如下：A組為EPCs組；B組為空白組；C組為KAI1/CD82-EPCs組。

當裸鼠出現(xiàn)反應遲緩、進食量下降、消瘦等情況后，以頸椎脫臼方式處死。處死裸鼠后，應立即解剖，完整取其腋下移植瘤、肝臟及肺組織，并將移植瘤稱重記錄。同時將肺及肝組織取出后先放置Bouin液中固定，待2天后觀察肺部轉移灶已顯示為白色，而肝組織未見明顯轉移灶。顯微鏡下觀察肺組織轉移灶的大小，并同時記錄數(shù)目。將浸泡于Bouin液中的肺組織制成石蠟切片后，經(jīng)HE染色，顯微鏡下觀察，并對各組裸鼠肺轉移結節(jié)的數(shù)目進行統(tǒng)計學分析。

1.3.4 免疫組化 取KAI1/CD82-EPCs組裸鼠移植瘤肺轉移灶，行免疫組化SP法染色。所有標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，常規(guī)4 μm厚連續(xù)切片，分別行HE及免疫組化染色。以PBS代替一抗作陰性對照。陽性染色為細胞質和(或)細胞膜被染成棕黃色。采取二次計分法，具體如下：每張切片選擇5個高倍視野，首先陽性細胞著色強度由強至弱分別計分，深棕黃色或棕褐色計為3分、棕黃色計為2分、淡黃色計為1分、無著色計為0分；再將陽性細胞百分比計分，采用高倍視野隨機計數(shù)500個腫瘤細胞中的陽性細胞所占比例，無陽性細胞為0分，≤10%陽性細胞為1分，11%～50%陽性細胞為2分，51%～75%陽性細胞為3分，>75%陽性細胞為4分。以陽性細胞著色強度和陽性細胞百分數(shù)得分的乘積作為結果判定標準，其中≤1分為陰性，>1分則為陽性。

2 結果

2.1 轉染KAI1/CD82基因的人臍血內(nèi)皮祖細胞及行Western blot檢測

2.1.1 慢病毒轉染進人臍血內(nèi)皮祖細胞后形態(tài)學觀察 將過表達KAI1/CD82基因的慢病毒轉染進人臍血內(nèi)皮祖細胞后，在熒光顯微鏡下可見其攜帶的綠色熒光蛋白的內(nèi)皮祖細胞(圖1)。

圖1 轉染KAI1/CD82基因的內(nèi)皮祖細胞

2.1.2 過表達KAI1/CD82基因的慢病毒轉染內(nèi)皮祖細胞后Western blot檢測結果 應用Western blot檢測內(nèi)皮祖細胞內(nèi)KAI1/CD82蛋白含量，同時以β-actin作為內(nèi)參，經(jīng)凝膠圖象處理系統(tǒng)分析后進行比較，可見KAI1/CD82蛋白在KAI1/CD82-EPCs組中表達最高(圖2)。

圖2 Western blot法檢測內(nèi)皮祖細胞內(nèi)KAI1/CD82的表達

2.2 人鼻咽癌裸鼠移植瘤腋下成瘤時間及成瘤重量 裸鼠腋下接種人鼻咽癌CNE-2Z細胞株后均成瘤，成瘤率為100%。A、B、C組成瘤時間(天)分別為14.70±3.81、15.05±3.85、14.20±3.55，三組數(shù)據(jù)行方差分析，差異無統(tǒng)計學意義(F=0.261，P=0.771)；A、B、C組移植瘤的重量(g)分別為1.388±0.204、1.487±0.223、1.485±0.234，三組間差異無統(tǒng)計學意義(F=1.325，P=0.274，圖3)。

2.4 鏡下觀察

2.4.1 裸鼠腋下移植瘤HE染色 裸鼠腋下移植瘤HE染色切片在鏡下顯示為腫瘤細胞核大而深染，排列紊亂，核仁清晰，可見病理核分裂象(圖4)。

2.4.2 裸鼠肺轉移灶HE染色 裸鼠肺轉移灶經(jīng)HE染色，在鏡下可見腫瘤細胞核大深染，且排列紊亂，核仁清晰，見病理核分裂象(圖5)。

2.4.3 KAI1/CD82-EPCs組、EPCs組和空白組肺轉移灶免疫表型 取KAI1/CD82-EPCs組裸鼠移植瘤肺轉移灶，行免疫組化染色，結果顯示KAI1/CD82呈陽性(圖6)。EPCs組和空白組肺轉移灶行免疫組化染色，結果顯示KAI1/CD82呈陰性。

③④⑤⑥

圖3 裸鼠腋下移植瘤 圖4 裸鼠腋下移植瘤HE染色 圖5 裸鼠肺轉移灶HE染色 圖6 KAI1/CD82-EPCs組肺轉移灶KAI1/CD82呈陽性，SP法

3 討論

腫瘤的侵襲和轉移是臨床治療中的較大阻礙，鼻咽癌治療失敗的患者中絕大多數(shù)伴轉移，然而目前臨床應對鼻咽癌轉移的有效方法仍十分匱乏。因此，分析如何降低進而控制轉移的發(fā)生率是當今探求鼻咽癌療效提升的關鍵。

KAI1基因是1995年由Dong等[3]克隆的特異性腫瘤轉移抑制基因。由于KAI1編碼的產(chǎn)物與CD82完全相同，故將其并稱為KAI1/CD82基因。人類KAI1/CD82基因位于染色體11p11.2上，該基因全長約80 kb，KAI1/CD82基因編碼蛋白由267氨基酸殘基組成[3]，屬于跨膜四超蛋白家族成員之一。研究表明，KAI1/CD8基因表達下調或缺失與腫瘤轉移相關[4-6]。

內(nèi)皮祖細胞又稱為成血管細胞，參與絕大多數(shù)的血管新生。最近也有不少臨床研究證實內(nèi)皮祖細胞在人類惡性腫瘤血管形成中的作用。內(nèi)皮祖細胞在細胞因子及相關受體的刺激下，向腫瘤組織特異性錨定、進入腫瘤組織并參與腫瘤血管形成，這一特性為定位腫瘤病灶及發(fā)現(xiàn)治療物質的新載體提供了一定的方向。

基于腫瘤的歸巢性，作為靶向載體的內(nèi)皮祖細胞可為腫瘤治療提供藥物。內(nèi)皮祖細胞能促進血管生成，其作為載體治療腫瘤，很多質疑也就隨之而來：注入內(nèi)皮祖細胞，它是否會促進腫瘤生長？該作用是否會超越它的治療作用？Muta等[7]在空白組注射Walker256腫瘤的小鼠，由于內(nèi)皮祖細胞促進腫瘤血管生產(chǎn)，腫瘤血液供應增加導致腫瘤進展。隨后轉染IL-12-EPCs注射同樣的小鼠模型，由于其分泌的IL-12強烈地激活NK細胞和TC細胞，扼制腫瘤的發(fā)展，抵消內(nèi)皮祖細胞的促進腫瘤作用。因此，研究者認為轉染基因的內(nèi)皮祖細胞可作為一種腫瘤特異性藥物傳遞系統(tǒng)。使用血管內(nèi)皮祖細胞作為基因治療的載體將成為腫瘤一種新的療法。

很多文獻報道內(nèi)皮祖細胞可作為腫瘤的靶向治療中的生物基因載體[8-11]，并且選用靜脈注入的方式，藥物可以準確快速地到達腫瘤區(qū)。由于血液循環(huán)過程損耗量少，局部藥物濃度高，從而達到較好地控制腫瘤的效果。

本實驗中構建高表達KAI1/CD82-EPCs組，注入鼻咽癌裸鼠尾靜脈，觀察KAI1/CD82-EPCs組顯著影響人鼻咽癌裸鼠移植瘤肺轉移灶的生成率，其肺轉移率僅為10%，顯著低于EPCs組和空白組；KAI1/CD82-EPCs組裸鼠移植瘤肺轉移灶免疫組化標記KAI1/CD82呈陽性；在EPCs和空白組中，KAI1/CD82呈陰性。本實驗結果顯示內(nèi)皮祖細胞可作為基因的有效載體趨向腫瘤區(qū)，并發(fā)揮抑制腫瘤轉移的重要作用，攜帶KAI1/CD82基因的EPCs有望成為鼻咽癌治療的新方法。

[1] Su Y, Zheng L, Wang Q,etal. Quantity and clinical relevance of circulating endothelial progenitor cells in human ovarian cancer[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2010,29(1):27-34.

[2] Janic B, Arbab A S. The role and therapeutic potential of endothelial progenitor cells in tumor neovascularization[J]. Scientific World Journal, 2010,10(1100):1088-1099.

[3] Dong J T, Lamb P W, Rinker-Schaeffer C W,etal. KAI1, a metastasis suppressor gene for prostate cancer on human chromosome 11p11.2[J]. Science, 1995,268(5212):884-886.

[4] Liu X, Guo X, Li H,etal. Src/STAT3 signaling pathways are involved in KAI1-induced downregulation of VEGF-C expression in pancreatic cancer[J]. Mol Med Rep, 2016,13(6):4774-4778.

[5] Singh R, Bhatt M L, Singh S P,etal. Expression levels of tetraspanin KAI1/CD82 in breast cancers in North Indian females[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2016,17(7):3431-3436.

[6] Gong X, Tao Y, Zhou L,etal. Expressions of Snail, Slug and KAI1 proteins in cervical carcinoma and their clinicopathological significance[J]. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao, 2015,35(12):1733-1738.

[7] Muta M, Matsumoto G, Hiruma K,etal. Study of cancer gene therapy using IL-12-secreting endothelial progenitor cells in a rat solid tumor model[J]. Oncol Rep, 2003,10(6):1765-1769.

[8] Wang X Y, Ju S, Li C,etal. Non-invasive imaging of endothelial progenitor cells in tumor neovascularization using a novel dual-modality paramagnetic/near-infrared fluorescence probe[J]. PLoS One, 2012,7(11):e50575-e50587.

[9] 王 鈜，王春平，畢京峰，等. 攜帶干擾素基因的內(nèi)皮祖細胞靶向抑制腫瘤的實驗研究[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學, 2013,21(3):495-498.

[10] Varma N R, Janic B, Iskander A S,etal. Endothelial progenitor cells (EPCs) as gene carrier system for rat model of human glioma[J]. PLoS One, 2012,7(1):e30310-e30321.

[11] Ammendola M, Leporini C, Luposella M,etal. Targeting endothelial progenitor cells in cancer as a novel biomarker and anti-angiogenic therapy[J]. Curr Stem Cell Res Ther, 2015,10(2):181-187.

Effect of KAI1/CD82-expressing EPCs on lung metastasis of a xenograft mouse model of human nasopharyngeal carcinoma

WANG Geng-ming1, ZHOU Yan1, SUN Qian1, XU Hong-bo1, ZHA Cong-liang2, JIANG Hao1, XIANG Ping3, CHEN Zhen-dong4

(1DepartmentofRadiotherapy,3CentralLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233000,China;2DepartmentofRadiotherapy,TonglingPeople’sHospital,Tongling244000,China;4DepartmentofOncology,theSecondAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230601,China)

Purpose To clarify the role of KAI1/CD82 in metastasis of nasopharyngeal carcinom and to evaluate the clinical efficacy of KAI1/CD82-expressing EPCs in the prevention of nasopharyngeal carcinoma. Method Umbilical vein-derived EPCs were infected with KAI1/CD82-expressing lenti-virus to get a KAI1/CD82-overexpressing EPC cell line (KAI1/CD82-EPCs). A xenograft mouse model of human nasopharyngeal carcinoma was established, and KAI1/CD82-EPCs were injected through the tail vein. The effect of the KAI1/CD82-EPCs on growth and metastasis of the xenograft was observed. Results Time required for tumor formation was 14.70±3.81, 15.05±3.85, 14.20±3.55 days respectively for the EPCs, EPCs-NC, and KAI1/CD82-EPCs groups, with no significant difference among the three groups (P=0.771). Weight of the xenograft was (1.388±0.204) g, (1.487±0.223) g, (1.485±0.234) g respectively for the EPCs, EPCs-NC, and KAI1/CD82-EPCs groups, with no significant difference (P=0.274). Rate of lung metastasis was 55%, 45% and 10% for the EPCs, EPCs-NC, and KAI1/CD82-EPC groups, and the difference was significant (P=0.005). Number of metastatic lesions was 34.27 ± 5.35, 38.44 ± 9.63, 17.50 ± 3.54 for the three groups, and the difference was also significant (P=0.007). Immunohistochemistry indicated positive KAI1/CD82 expression in metastatic lesion of the KAI1/CD82-EPCs group, but no KAI1/CD82 expression in the EPCs group or EPCs-NC group. Conclusion KAI1/CD82-expressing EPCs inhibits lung metastasis of the xenograft mouse model of human nasopharyngeal carcinoma.

nasopharyngeal neoplasm；metastasis suppressor gene； KAI1/CD82； endothelial progenitor cell

時間：2017-3-16 14:23

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170316.1423.012.html

安徽省高等學校自然科學研究(KJ2015B091by)、蚌埠醫(yī)學院院級科研課題(BY0925)

1蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤放療科、3中心試驗室，蚌埠 233000

2銅陵市人民醫(yī)院放療科，銅陵 244000

汪庚明，女，博士，主治醫(yī)師。E-mail: lansefeidian777@163.com

R 739.62

A

1001-7399(2017)03-0287-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.03.012

接受日期：2017-01-18

4安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院腫瘤科，合肥 230601