高麗麗，朱長樂

不同免疫組化法檢測PHH3蛋白染色的比較

高麗麗，朱長樂

PHH3；免疫組織化學(xué)；抗原修復(fù)

組蛋白H3是細胞核染色質(zhì)的重要組成成分，也是核心組蛋白之一[1-2]。PHH3是磷酸化的組蛋白H3，其只存在細胞有絲分裂期而不出現(xiàn)于分裂間期和凋亡細胞中，從而有利于有絲分裂細胞的計數(shù)[1-4]。Ribalta等[4]報道PHH3蛋白可以幫助腦膜瘤的腫瘤分級以及區(qū)分凋亡細胞；在皮膚的平滑肌腫瘤中簡單計數(shù)核分裂細胞[5]；Tsuta等[6]認為，PHH3同樣可以在肺神經(jīng)內(nèi)分泌癌中計數(shù)核分裂細胞；除此之外，PHH3還可以預(yù)測星形細胞瘤患者的生存期[7]，協(xié)助子宮內(nèi)膜癌的病理分級等[8]。因此采用免疫組化(immunohistochemistry, IHC)檢測PHH3蛋白表達具有重要意義，本文現(xiàn)采用不同IHC法檢測PHH3，探討最佳染色方案。

1 材料與方法

1.1 材料 收集江蘇省中醫(yī)院病理科不同腫瘤組織石蠟標(biāo)本50例(胃腸道間質(zhì)瘤19例、乳腺浸潤性導(dǎo)管癌2例、節(jié)細胞神經(jīng)瘤1例、子宮平滑肌瘤11例、神經(jīng)鞘瘤3例、腎上腺皮質(zhì)腺瘤6例、脂肪肉瘤3例、膠質(zhì)母細胞瘤4例、腦膜瘤1例)，其中19例有核分裂象的腫瘤組織采用IHC法檢測PHH3蛋白表達。一抗PHH3分別為RAB-0693(福州邁新公司)、ZA-0477(北京中杉金橋公司)產(chǎn)品，二抗EliVision購自福州邁新公司，修復(fù)液分別購自福州邁新、DAKO、羅氏公司，其余試劑均購自福州邁新公司。

1.2 方法 (1)石蠟切片(3 μm)，烤片(65 ℃ 1 h)，二甲苯脫蠟，梯度乙醇至水化，自來水沖洗；(2)3種抗原修復(fù)方法分別為：檸檬酸鹽(pH 6.0)高壓100 ℃修復(fù)2 min；DAKO公司的EnVision FLEX修復(fù)液(pH 9.0)96 ℃，20 min；Ventana的CC1修復(fù)液(pH 8.0)，95～100 ℃ 30 min；(3)PBS(pH 7.2～7.4)洗滌，每次3 min；(4)非免疫羊血清孵育，RT，10 min；(5)一抗孵育，4 ℃過夜；(6)室溫放置30 min使切片恢復(fù)至常溫，PBS洗滌，每次3 min；(7)二抗孵育，RT，A、B液分別15 min，PBS洗滌，每次3 min；(8)DAB顯色，RT，3 min；(9)自來水沖洗，蘇木精復(fù)染1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 PHH3蛋白在腫瘤組織中的表達 PHH3蛋白在腫瘤組織中定位于細胞核(圖1)。

2.2 不同IHC法檢測PHH3蛋白染色比較 50例腫瘤組織HE染色，選取有核分裂象的組織19例進行IHC染色，當(dāng)抗原修復(fù)采用檸檬酸鹽(pH 6.0)高壓100 ℃修復(fù)2 min，分別標(biāo)記兩種PHH3一抗，染色結(jié)果為：PHH3(RAB-0693)標(biāo)記的組織背景染色深，出現(xiàn)大量假陽性，4例表達較弱；PHH3(ZA-0477)標(biāo)記的組織有非特異性著色，15例出現(xiàn)假陰性(圖2)。當(dāng)抗原修復(fù)方法采用DAKO公司的EnVision FLEX修復(fù)液(pH 9.0)經(jīng)96 ℃修復(fù)20 min，分別標(biāo)記一抗PHH3后染色結(jié)果與檸檬酸鹽修復(fù)方法相比，PHH3(RAB-0693)標(biāo)記的組織背景染色加深，陽性強度提高，但仍出現(xiàn)大量假陽性結(jié)果；PHH3(ZA-0477)標(biāo)記的組織仍存在非特異性著色和假陰性表達(圖3)。當(dāng)采用Ventana的CC1修復(fù)液(pH 8.0)經(jīng)95～100 ℃修復(fù)30 min，分別標(biāo)記一抗后染色結(jié)果相比，前兩種修復(fù)方法：PHH3(RAB-0693)標(biāo)記的組織無背景染色，陽性表達提高，定位明確；PHH3(ZA-0477)標(biāo)記的組織非特異性著色減弱，陽性表達定位仍不明確，存在假陰性(圖4)。

3 討論

PHH3蛋白與真核細胞中染色質(zhì)凝集狀態(tài)密切相關(guān)。用IHC法檢測不同腫瘤組織中PHH3蛋白，觀察核分裂象可有效評價核分裂能力。本實驗共選取腫瘤組織石蠟標(biāo)本50例，HE染色中13例胃腸道間質(zhì)瘤有核分裂象，1例浸潤性乳腺癌，3例腎上腺皮質(zhì)腺瘤，1例脂肪肉瘤，1例膠質(zhì)母細胞瘤。IHC染色結(jié)果受多種因素影響，其中組織固定影響最大[9]，但本實驗主要從IHC流程本身分析影響因素。其要點概括：(1)抗原修復(fù)，目的是為了暴露組織抗原決定簇，有利于與抗體的結(jié)合，當(dāng)抗原暴露不足時，染色結(jié)果減弱。影響抗原修復(fù)的因素有pH和溫度，不同的抗原決定簇所需的pH不同；目前大多采用熱修復(fù)方法，溫度過低也會使抗原暴露不充分。本實驗中pH 8.0的CC1修復(fù)液抗原修復(fù)效果最佳。(2)一抗的選擇，一抗是影響IHC染色結(jié)果的關(guān)鍵因素。本實驗中PHH3(RAB-0693)的染色效果佳。(3)一抗孵育條件，一般采用4 ℃過夜、室溫或37 ℃ 1 h，本實驗條件為4 ℃過夜孵育。(4)放大系統(tǒng)，也就是二抗的選擇，本實驗使用EliVision系統(tǒng)。

圖1 胃腸道間質(zhì)瘤組織PHH3蛋白表達,EliVision法 圖2 檸檬酸鹽修復(fù),EliVision法:A.一抗為PHH3(ZA-0477);B.一抗為PHH3(RAB-0693) 圖3 EnVisionFLEX修復(fù),EliVision法:A.一抗為PHH3(ZA-0477);B.一抗為PHH3(RAB-0693) 圖4 Ventana的CC1修復(fù)液修復(fù)，EliVision法：A.一抗為PHH3(ZA-0477)；B.一抗為PHH3(RAB-0693)

總之，IHC檢測是細致耐心的工作，需要病理醫(yī)師在日常工作中不斷總結(jié)經(jīng)驗，優(yōu)化實驗流程，制定適合自己實驗室的標(biāo)準(zhǔn)流程，最終做出優(yōu)質(zhì)的免疫組化切片。

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時間：2017-3-16 14:23

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170316.1423.031.html

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)院病理科，南京 210029

高麗麗，女，碩士，技師。E-mail： 278304371@qq.com 朱長樂，男，副主任技師，通訊作者。Tel: (025)86553357，E-mail： zhuchangle2008@163.com

R 329.33

B

1001-7399(2017)03-0344-02

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.03.031

接受日期：2017-01-29