印永祥，趙 華，梁 潔，張金秋，趙 敏，王家俊

細胞免疫化學p16/Ki-67雙染預測子宮頸上皮內(nèi)高級別瘤變

印永祥1，趙 華1，梁 潔1，張金秋1，趙 敏2，王家俊2

目的 探討細胞免疫化學p16/Ki-67雙染預測子宮頸上皮內(nèi)高級別瘤變及其意義。方法 隨機收集行細胞學檢查標本123例，其中不明意義的非典型鱗狀上皮細胞(atypical squamous cell of undetermined significance, ASC-US)及以上病例(合計103例)同時行高危人乳頭瘤病毒(high risk-human papillomavirus, HR-HPV)檢測且具有活檢結果，20例液基細胞學檢查未見惡性細胞和上皮內(nèi)病變細胞(negative for intraepithelial lesion or malignancy, NILM)，通過細胞免疫化學雙染檢測p16/Ki-67結果。結果 20例液基細胞學NLIM的標本中p16/Ki-67雙染結果均陰性，ASC-US病例中預測CIN2+的敏感性66.67%、特異性95.92%、陽性預測值50.00%、陰性預測值97.92%，低級別鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesions, LSIL)病例中預測CIN2+的敏感性91.67%、特異性95.00%、陽性預測值91.67%、陰性預測值95.00%，高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesions, HSIL)病例中預測CIN2+的敏感性92.86%、特異性0、陽性預測值92.86%、陰性預測值0；ASC-US及以上病例預測CIN2+的敏感性89.66%、特異性94.28%、陽性預測值86.67%、陰性預測值95.65%。結論 HR-HPV陽性的ASC-US和LSIL病例中進行p16/Ki-67雙染檢測，可以明顯提高CIN2+檢出的預測值，細胞免疫化學p16/Ki-67雙染有望成為HPV篩查的有效輔助方法。

子宮頸上皮內(nèi)瘤變；p16/Ki-67雙染；細胞免疫化學；高危型人乳頭瘤病毒

子宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，其病死率高。高危型人乳頭瘤病毒(high-risk human papillomavirus, HR-HPV)感染是子宮頸癌及其癌前病變的主要致病因子。子宮頸細胞學檢查能有效減少子宮頸癌的發(fā)生率和病死率，但細胞學只具有適度的敏感性，需要其他檢測提高子宮頸癌篩查的有效性。國內(nèi)外大量研究顯示：腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后與腫瘤抑制--------------------

基因p16及增殖細胞核抗原Ki-67活性密切相關[1-2]。組織學聯(lián)合檢測p16和Ki-67可作為子宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasis, CIN)分級診斷的輔助方法[3]，但有關子宮頸細胞學p16/Ki-67雙染的報道較少。本文現(xiàn)結合細胞免疫化學p16/Ki-67雙染、HR-HPV檢測結果和病理活檢結果，探討細胞免疫化學p16/Ki-67雙染在預測子宮頸上皮內(nèi)高級別瘤變篩查中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2015年無錫市婦幼保健院病理科行細胞學檢查的123例子宮頸病變，其中不明意義的非典型鱗狀上皮細胞(atypical squamous cell of undetermined significance, ASC-US)及以上病例(合計103例)同時行HR-HPV檢測且具有活檢結果，患者年齡28～61歲，中位年齡39.5歲。20例細胞學檢查未見惡性細胞和上皮內(nèi)病變細胞(negative for intraepithelial lesion or malignancy, NILM)，患者年齡26～58歲，中位年齡38歲。

1.2 方法

1.2.1 細胞學檢測 液基細胞學標本采用新柏氏TCT制片，改良巴氏染色。報告采用TBS分級系統(tǒng)：NILM、ASC-US、傾向高度病變的不典型鱗狀上皮細胞、低級別鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesions, LSIL)、高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesions, HSIL)、鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)。腺細胞病變不在本實驗研究范圍內(nèi)，傾向高度病變的不典型鱗狀上皮細胞歸類于HSIL，ASC-US及以上病變認為液基細胞學(liquid-based cytology test, LCT)陽性。

1.2.2 HR-HPV DNA檢測 采用雜交捕獲Ⅱ代試驗的檢測方法，檢測值<1.0 pg/mL為陰性，≥1.0 pg/mL為陽性。ASC-US及以上病例均為HR-HPV陽性。

1.2.3 病理活檢 按WHO(2012)乳腺與女性生殖系統(tǒng)腫瘤病理與遺傳學標準分級，其中子宮頸炎46例，病毒感染18例，子宮頸上皮內(nèi)低級別瘤變(CIN1級)19例，子宮頸上皮內(nèi)高級別瘤變(CIN2級和CIN3級)18例，SCC 1例。以CIN2級及以上病變稱為CIN2+，認為其組織學陽性。

1.2.4 細胞學p16/Ki-67雙染法 細胞薄片置于95%乙醇中固定30 min，流水沖洗1 min。雙染試劑盒購自福州邁新公司。對標本進行EDTA 8.0熱修復95 ℃ 20 min。滴加過氧化物酶100 μL，室溫孵育10 min。滴加組合p16抗體、Ki-67抗體的一抗100 μL，室溫孵育60 min。滴加酶標二抗100 μL，室溫孵育15 min。滴加顯色劑AP-RED 100 μL，室溫孵育20 min。滴加顯色劑DAB 100 μL，室溫孵育5 min。蘇木精襯染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.3 細胞學p16/Ki-67雙染結果判斷 陽性結果為染色片中觀察1個或1個以上的細胞質(zhì)呈紅色，且細胞核呈棕黃色或紅褐色。陰性檢測結果為無子宮頸細胞同時出現(xiàn)細胞質(zhì)呈紅色，且細胞核呈棕黃色或紅褐色，即存在僅對一種而非兩種標志物有免疫反應性的子宮頸上皮細胞(如僅存在p16的棕色染色或僅存在Ki-67的紅色染色)，或未見對兩種標志物有免疫反應性的子宮頸上皮細胞，認為其檢測結果陰性。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞學預測CIN2+ 病例 因細胞學正常未做子宮頸活檢，認為是子宮頸正常。與HSIL中病變檢出率相比，CIN2+在ASC-US和LSIL病例中檢出率明顯減少(P<0.05，表1)。

表1 細胞學與組織學結果對比

與ASC-US、LSIL組相比，*P<0.05

2.2 細胞學正常標本中p16/Ki-67雙染檢測 20例細胞學正常的標本中p16/Ki-67雙染結果全部陰性。

2.3 細胞學ASC-US標本中p16/Ki-67雙染檢測 54例ASC-US病例中有2例細胞學重新制片檢測時細胞學中無典型特征細胞故剔除；52例ASC-US病例中有4例p16/Ki-67雙染陽性，4例p16和Ki-67雙染陽性中活檢結果CIN2+者2例；敏感性66.67%、特異性95.92%、陽性預測值50.00%、陰性預測值97.92%。與TCT、HR-HPV雙陽性相比，ASC-US組LCT、HR-HPV和p16/Ki-67雙染三陽性時，陽性預測值明顯提高(P<0.05，表2)。

2.4 細胞學LSIL標本中p16/Ki-67雙染檢測 34例LSIL病例中有2例細胞學重新制片檢測時細胞學中無典型病變細胞故剔除；32例LSIL病例中有12例p16/Ki-67雙染陽性，12例p16/Ki-67雙染陽性中活檢結果CIN2+者11例；敏感性91.67%、特異性95.00%、陽性預測值91.67%、陰性預測值95.00%。與LCT、HR-HPV雙陽性相比，LSIL組LCT、HR-HPV和p16/Ki-67雙染三陽性時陽性預測值明顯提高(P<0.05，表2)。

2.5 細胞學LSIL標本中p16/Ki-67雙染檢測 15例HSIL中p16/Ki-67雙染陽性14例，子宮頸活檢結果CIN2+者13例；敏感性92.86%、特異性0、陽性預測值92.86%、陰性預測值0。HSIL組LCT、HR-HPV和p16/Ki-67雙染三陽性時陽性預測值高于LCT、HR-HPV雙陽性，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表2)。

2.6 細胞學ASC-US及以上標本中p16/Ki-67雙染檢測 ASC-US及以上標本99例中有30例p16/Ki-67雙染陽性，30例p16/Ki-67雙染陽性中活檢結果CIN2+者26例，CIN1者2例，病毒感染2例。細胞免疫化學p16/Ki-67雙染陽性的組織學標本，CIN2+的檢出率(86.67%)明顯高于CIN1的檢出率(6.67%)。p16/Ki-67雙染預測CIN2+的敏感性89.66%、特異性94.28%、陽性預測值86.67%、陰性預測值95.65%(表2，圖1～4)。

①②③④

圖1 p16/Ki-67在LCT中表達，p16/Ki-67均呈陰性，MaxVision法

圖2 p16/Ki-67在LCT中表達，Ki-67呈單陽性，MaxVision法

圖3 p16/Ki-67在LCT中表達，p16單陽性，MaxVision法

圖4 p16/Ki-67在LCT中表達，p16/Ki-67雙陽性，MaxVision法

3 討論

子宮頸細胞學檢查或子宮頸細胞學檢查聯(lián)合HR-HPV檢測是目前主流的子宮頸癌初篩方法。很多發(fā)達國家沿用的常規(guī)細胞學或巴氏檢查被證實能有效地降低子宮頸癌的發(fā)病率和病死率。超過99%的子宮頸癌與HR-HPV相關[4]。HPV檢測有較高地陰性預測值，HPV陰性的婦女在5～7年內(nèi)不會發(fā)展為子宮頸癌，因為有證據(jù)顯示從最初感染HPV到子宮頸癌至少需要8年時間[5]。有研究認為HPV檢測CIN2+優(yōu)于細胞學[6]。

表2 p16/Ki-67雙染結果與CIN2+比較

文獻報道患者6個月后復查細胞學僅發(fā)現(xiàn)少數(shù)子宮頸上皮內(nèi)高級別瘤變，其中28%的子宮頸上皮內(nèi)高級別瘤變因HPV持續(xù)感染最終診斷，認為通過重復檢查細胞學或HPV檢測在減少陰道鏡方面缺乏有效性[7]，需增加新的檢測方法提高子宮頸高級別病變檢出率。

細胞學診斷是形態(tài)學檢測，醫(yī)師需有豐富的臨床經(jīng)驗，否則敏感性較低，假陰性及假陽性率介于5%～50%[8-9]，且因形態(tài)變化缺少客觀的判斷標準，造成診斷結果重復性不好[10-11]。最近研究證實p16和Ki-67的表達均與HR-HPV感染相關[12-13]。有文獻報道測定子宮頸細胞內(nèi)Ki-67和p16蛋白，用于檢驗HR-HPV感染引起子宮頸細胞異常增生[14-15]。以往研究大多是p16單染和(或)Ki-67單染進行評估，效果欠佳。有文獻報道，p16過表達提示經(jīng)HPV E7癌蛋白激活，但p16也表達在非異常的細胞上，p16只可能作為CIN1級的預后因子[16]。也有相反的文獻報道，p16表達程度與CIN級別的升高有關[17]，使用p16染色用于裁定女性生殖道下段及肛門標本模棱兩可的CIN2級診斷為低度病變或高度瘤變，可能會更準確預測病變級別，避免不必要的切除治療[18]。本實驗也發(fā)現(xiàn)，p16也部分表達于正常子宮內(nèi)膜細胞、柱狀細胞和化生細胞中。最近文獻報道[19]在子宮頸細胞學標本檢測p16/Ki-67雙染蛋白表達，p16過表達誘導細胞周期阻滯，Ki-67作為通過HPV轉化感染介導細胞周期調(diào)控的代替標志物。在一個細胞上p16/Ki-67雙陽性可能作為通過HPV基因蛋白調(diào)控細胞周期的標志物，可能是HPV轉化感染的標志物[20]。

HPV E6/E7檢測比HPV DNA檢測具有更高的特異性，在子宮頸癌篩查中具有重要的價值[21]，但是轉化感染的重要標志物不必通過RNA或蛋白呈現(xiàn)，也可能經(jīng)HPV感染后影響細胞的產(chǎn)物表達。本實驗數(shù)據(jù)表明，p16/Ki-67聯(lián)合檢測在細胞學陽性標本中敏感性89.66%，特異性94.28%，陽性預測值86.67%。采用p16/Ki-67聯(lián)合檢測可能有重要的臨床意義，p16/Ki-67雙陽性與HR-HPV感染明顯相關，與子宮頸高級別以上瘤變明顯相關[20]。

有研究認為，細胞學ASC-US和LSIL中進行陰道鏡檢測具有較低的敏感性；盡管相比陰道鏡檢查而言，細胞學檢測具有更少的合并癥，但對ASC-US病例采取細胞學重復檢測可能對一些有高級別瘤變及以上患者相比于陰道鏡檢查過低診斷，高敏感性的HPV檢測有可能是對目前ASC-US病例中重復檢測細胞學可替代的方法[22]。Gage等[23]報道，3年發(fā)生高級別瘤變及以上的風險從細胞學陰性、ASC-US和LSIL分別為0.30%、2.6%和5.2%，HPV聯(lián)合ASC-US檢測3年發(fā)生高級別瘤變及以上病例的風險中，HPV陰性為0.72%，HPV陽性為7.7%。ASC-US可能隱藏高級別瘤變或更嚴重的病變，本組結果顯示有3.70%發(fā)生高級別瘤變，通過p16/Ki-67雙染，在ASC-US病例中明顯增加預測CIN2+陽性預測值至50.00%。Arbyn等[24]認為HPV檢測因大多數(shù)LSIL中HR-HPV陽性率高而缺乏有效性。本實驗通過p16/Ki-67雙染，在LSIL中預測CIN2+陽性預測值明顯增加至91.67%。作者認為p16/Ki-67雙染在ASC-US和LSIL病例中進行檢測有重要意義。但也有作者認為因缺少有效的證據(jù)，p16/Ki-67雙染不能在ASC-US和LSIL分類中作為推薦的方法[25]。當然，本組發(fā)現(xiàn)HSIL中增加p16/Ki-67雙染，子宮頸上皮內(nèi)高級別瘤變的陽性預測值有所提高，但意義不大。

本實驗還發(fā)現(xiàn)，細胞學陰性的標本無p16/Ki-67雙陽性細胞，與細胞學陰性的標本無p16/Ki-67雙陽性細胞[20]相符，但與Petry等[19]報道在HPV陽性而細胞學形態(tài)學正常的標本中p16/Ki-67雙染陽性率為25.4%相反，有可能與細胞學醫(yī)師診斷時的誤差有關。

如果細胞學標本制備方法滿足要求，單克隆抗體組合選擇正確，細胞免疫化學可用來提高細胞學診斷的預見性。通過p16/Ki-67雙染，陽性記數(shù)獨立于細胞形態(tài)學，細胞學形態(tài)往往比較主觀，當遇到模糊的異常病例又難以區(qū)別時可資鑒別。盡管目前在重復細胞學制片中存在少數(shù)病例中無陽性特征細胞，本實驗認為有可重復性的細胞學制片的基礎上，在HR-HPV陽性的細胞學標本上進行p16/Ki-67雙染，可以減少一過性感染造成的假陽性；在HR-HPV陽性的細胞學標本上ASC-US和LSIL病例中進行p16/Ki-67雙染，可以明顯提高子宮頸上皮內(nèi)高級別瘤變檢出的預測值，減少陰道鏡和子宮頸活檢創(chuàng)傷性檢查、不必要的患者心理壓力和經(jīng)濟負擔。細胞免疫化學p16/Ki-67雙染可明顯提高子宮頸上皮內(nèi)高級別瘤變的檢出率，有望實現(xiàn)以HPV篩查的有效輔助方法，可能成為子宮頸細胞學精準篩查的工具之一。

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Study of predictive value for detection of high-grade cervical intraepithelial neoplasia by p16/Ki-67 dual-stained liquid-based cytology

YIN Yong-xiang1, ZHAO Hua1, LIANG Jie1, ZHANG Jin-qiu1, ZHAO Min2, WANG Jia-jun2

(1DepartmentofPathology,2DepartmentofGynecology,theAffiliatedMaternityandChildHealthHospitalofNanjingMedicalUniversity,Wuxi214002,China)

Purpose To study of predictive value for detection of high-grade cervical intraepithelial neoplasia (CIN2+) by p16/Ki-67 dual-stained liquid-based cytology. Methods Random collection of 123 women including 103 samples of atypical squamous cell of undetermined significance (ASC-US) and above with results of high-risk human papillomavirus (HR-HPV) testing and cervical biopsy, 20 samples of negative for intraepithelial lesion or malignancy (NILM) by using immunocytochemical p16/Ki-67 dual-stained and the morphology assessment. Results In normal control group, the expression of p16/Ki-67 dual-stained in squamous epithelial cells were negative. Sensitivity of p16/Ki-67 dual-staind cytology for biopsy-confirmed CIN2+ was 66.67% (ASC-US), 91.67% (LSIL) and 92.86% (HSIL), specificity rates were 95.92% (ASC-US), 95.00% (LSIL) and 0 (HSIL), positive predictive value were 50.00% (ASC-US), 91.67% (LSIL) and 92.86% (HSIL), negative predictive value were 97.92% (ASC-US), 95.00% (LSIL) and 0 (HSIL), respectively. Conclusion p16/Ki-67 dual-stained cytology are improved obviously the predictive value for detection of CIN2+, p16/Ki-67 dual-stained cytology may efficiently complement HPV-based screening programs to prevent cervical cancer.

cervical intraepithelial neoplasia； p16/Ki-67 dual staining； immunocytochemistry； HR-HPV

時間：2

接受日期：2017-01-29

< class="content">基金項目：無錫市衛(wèi)計委婦幼健康成果技術推廣(FYTG2016-2)、無錫市衛(wèi)生計生科技成果和適宜技術推廣(T201645)

無錫市衛(wèi)計委婦幼健康成果技術推廣(FYTG2016-2)、無錫市衛(wèi)生計生科技成果和適宜技術推廣(T201645)< class="content">作者單位：南京醫(yī)科大學附屬無錫婦幼保健院1病理科、2婦科，無錫 214002

南京醫(yī)科大學附屬無錫婦幼保健院1病理科、2婦科，無錫 214002< class="content">作者簡介：印永祥，男，碩士，副主任技師。E-mail： yinyrh@sina.com 趙 華，女，主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail： 18921116888@189.cn

印永祥，男，碩士，副主任技師。E-mail： yinyrh@sina.com 趙 華，女，主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail： 18921116888@189.cn017-3-16 14:23

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170316.1423.011.html

R 392.3； R 737.33

A

1001-7399(2017)03-0282-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.03.011