張雨婷，張文輝，熊秀娟，況曉東，宋恩霖

NET-1活化NF-κB信號途徑促進子宮頸鱗癌微血管生成

張雨婷1，張文輝2，熊秀娟1，況曉東1，宋恩霖1

目的 探討NET-1表達與子宮頸癌微血管生成的關(guān)系及其分子機制。方法 采用免疫組化MaxVision法檢測80例子宮頸鱗癌、10例慢性子宮頸炎組織中NET-1、NF-κB p65、VEGF蛋白表達。采用CD34內(nèi)皮標記，結(jié)合Weinner計數(shù)法檢測子宮頸鱗癌組織的微血管密度(microvascular density, MVD)。通過陽離子脂質(zhì)體將真核表達質(zhì)粒pCMV6-NET-1轉(zhuǎn)染子宮頸鱗癌細胞以獲得NET-1基因過表達；利用NF-κB特異抑制劑PDTC處理子宮頸鱗癌細胞以抑制NF-κB的激活；應(yīng)用Western blot法檢測細胞蛋白的表達。結(jié)果 子宮頸鱗癌組織中NET-1呈高表達，NET-1表達與子宮頸鱗癌MVD、NF-κB p65和VEGF蛋白表達呈正相關(guān)。NET-1基因轉(zhuǎn)染引起子宮頸鱗癌SiHa細胞胞核NF-κB p65和胞質(zhì)VEGF水平上高，應(yīng)用NF-κB抑制劑PDTC預(yù)處理SiHa細胞能顯著抑制NET-1引起的VEGF表達上調(diào)。結(jié)論 NET-1促進子宮頸鱗癌微血管生成，其機制與NET-1激活子宮頸鱗癌NF-κB信號途徑上調(diào)VEGF表達有關(guān)。

子宮頸腫瘤；鱗癌；NET-1；NF-κB；VEGF；微血管生成

實體腫瘤血管形成與腫瘤細胞的生長、侵襲以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。實驗證實，微血管增生在子宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，與子宮頸癌不良預(yù)后顯著相關(guān)[1]。故研究腫瘤血管生成相關(guān)調(diào)節(jié)因子及其作用機制，對腫瘤生物的治療具有重要意義。NET-1是小G蛋白RhoA特異的鳥苷酸交換因子，通過激活RhoA信號調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、細胞周期和細胞骨架重排，具有類似原癌基因的功能。目前已發(fā)現(xiàn)，NET-1的表達與子宮頸癌、肺癌、肝癌和膠質(zhì)細胞瘤等多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，但NET-1與子宮頸癌微血管生成的關(guān)系尚未見報道。Vessichelli等[2]報道，NET-1與CARMA蛋白相互作用激活NF-κB信號途徑。NF-κB信號途徑參與缺氧情況下HIF-1的轉(zhuǎn)錄活化，最終上調(diào)與血管生成相關(guān)的下游靶基因如VEGF等的表達，從而促進腫瘤的微血管生成。本文通過檢測子宮頸鱗癌組織中NET-1、NF-κB p65、VEGF蛋白的表達，結(jié)合CD34內(nèi)皮標記檢測腫瘤微血管密度(microvascular density, MVD)，并在細胞學水平觀察NET-1對子宮頸癌細胞NF-κB的激活作用及其對下游VEGF表達的影響，分析NET-1與子宮頸癌微血管生成的關(guān)系及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集中山大學附屬第一醫(yī)院確診的浸潤性子宮頸鱗癌石蠟包埋標本80例，患者平均年齡44歲，其中低分化27例，中+高分化53例。按FIGO(2014)分期標準：Ⅰ期48例，Ⅱ期32例。腫瘤直徑≥4 cm者22例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者38例，脈管浸潤陽性者28例。所有患者術(shù)前均未行放、化療，另取10例慢性子宮頸炎標本作為對照組。

1.2 免疫組化 免疫組化采用MaxVision法染色，3～5 μm厚石蠟切片常規(guī)脫蠟，檸檬酸抗原熱修復，3%H2O2處理，PBS漂洗。一抗兔抗人多克隆NET-1抗體，購自ProteinTech公司；兔抗人NF-κB p65 抗體，購自Abnova公司；兔抗人VEGF抗體，購自Abgent公司；工作液50 μL，4 ℃過夜，PBS洗滌后50 μL MaxVision二抗工作液(KIT-5010，福州邁新公司)，室溫下孵育30 min，洗滌后DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封固。以PBS代替一抗作陰性對照。

測量平均光密度(mean optic density, MOD)進行蛋白表達半定量結(jié)果判定。在光鏡下(×400)選取腫瘤組織中陽性最強的5個高倍視野，數(shù)碼拍照，圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0準確分割陽性區(qū)域，測量MOD值。相同條件下，每張圖片測量3次，以3次測量的均值作為該視野中蛋白的表達強度。最后再以同一切片5個不同視野的MOD均數(shù)，作為該切片所代表的樣本組織中蛋白的平均表達強度。

1.3 MVD檢測 采用Weidner法檢測子宮頸癌組織中MVD。CD34免疫組化染色后(鼠抗人CD34單克隆抗體，福州邁新公司)以黃色顆粒狀標記的血管內(nèi)皮為標準，切片在光鏡下(×100)挑選MVD分布最高區(qū)域，在光鏡下(×200)計數(shù)5個不同視野中被CD34染成陽性的微血管數(shù)量，取其平均值作為MVD值。每個與鄰近微血管分離明顯的陽性染色單個血管內(nèi)皮細胞或血管內(nèi)皮細胞簇均視為1個獨立的微血管，結(jié)構(gòu)不相連的分支血管結(jié)構(gòu)也計作1個微血管。直徑>8個紅細胞的血管，帶有厚的平滑肌血管或者硬化壞死區(qū)血管不在計數(shù)范圍內(nèi)。

1.4 子宮頸癌細胞NET-1基因瞬時轉(zhuǎn)染 SiHa細胞(TCHu113，中國科學院細胞庫)用含10%胎牛血清、10%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中。2×105/mL接種于24孔板，待生長達90%～95%融合度時，更換培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基。分別用無血清培養(yǎng)基50 μL稀釋0.8 μg的pCMV6-NET-1表達質(zhì)粒(SC321265，OriGene公司)和2 μL脂質(zhì)體Lipofectamin 2000(Invitrogen公司)，室溫靜止5 min，兩者混合制備轉(zhuǎn)染復合物，室溫靜止25 min，加入對應(yīng)孔板中。利用空質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染作為陰性對照，利用未轉(zhuǎn)染組為空白對照。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)6 h，更換培養(yǎng)基為不含雙抗含10%血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，通過Western blot法檢測轉(zhuǎn)染效果。

1.5 Western blot法 利用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，用以檢測NET-1和VEGF蛋白表達；利用細胞核蛋白提取試劑盒(Cwbiotech公司)提取細胞核蛋白，用于檢測細胞核NF-κB p65蛋白表達。蛋白濃度測定后，按每孔20 μL上樣量用Loading Buffer配平，沸水加熱后上樣，行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜。經(jīng)洗滌后，加入一抗(工作濃度1 ∶1 000，內(nèi)參β-actin為1 ∶5 000，β-actin鼠單克隆抗體，購自ProteinTech公司)，37 ℃孵育1 h后4 ℃過夜；PBST洗滌后加入二抗(工作濃度1 ∶5 000)。洗滌膜后，利用Easy See化學發(fā)光試劑盒孵育發(fā)光，顯影。利用Image Tool測量目的蛋白條帶和內(nèi)存條帶的灰度值，以目的條帶灰度值與內(nèi)存灰度值的比值作為蛋白的相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1 子宮頸鱗癌組織中NET-1表達及其與NF-κB p65和VEGF表達的關(guān)系 腫瘤組織HE染色顯示，瘤細胞呈巢、團狀分布，與纖維性間質(zhì)分界清楚，部分瘤組織中可見角化現(xiàn)象，為浸潤性子宮頸鱗癌。子宮頸炎組織中，NET-1弱表達于鱗狀上皮顆粒細胞層和棘細胞層細胞胞核，且呈散在分布。NET-1表達于癌巢中腫瘤細胞胞質(zhì)和胞核，呈棕褐色顆粒，癌巢周圍纖維性間質(zhì)偶見少量表達(圖1)。NF-κB p65主要表達于腫瘤細胞胞核，呈棕黃色顆粒，部分瘤細胞呈胞質(zhì)和胞核陽性(圖2)。VEGF表達于腫瘤細胞胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒，癌巢周血管組織和少量纖維間質(zhì)可見表達(圖3)。光密度檢測分析發(fā)現(xiàn)，子宮頸鱗癌組織中NET-1的平均表達強度顯著高于慢性子宮頸炎組織(表1)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，NET-1表達分別與NF-κB和VEGF表達呈正相關(guān)(rs=0.272，P=0.015；rs=0.325，P=0.003)。

表1 慢性子宮頸炎和子宮頸鱗癌組織中NET-1的表達(±s)

2.2 子宮頸鱗癌組織中NET-1的表達與MVD的關(guān)系 CD34內(nèi)皮標記顯示，子宮頸鱗癌微血管分布于癌巢之間和癌巢內(nèi)瘤細胞之間(圖4)，平均MVD為21.1。t檢驗結(jié)果顯示，NET-1表達水平較高組(以NET-1的總體平均表達強度0.182±0.036為分組臨界值)的子宮頸鱗癌組織中MVD顯著高于NET-1表達水平較低組(t=-2.113，P=0.038)。進一步相關(guān)性分析顯示，NET-1的表達與子宮頸鱗癌MVD呈正相關(guān)(rs=0.291，P=0.009)。

2.3 NET-1通過活化NF-κB信號途徑上調(diào)VEGF表達 NET-1基因轉(zhuǎn)染組、陰性轉(zhuǎn)染組和空白未轉(zhuǎn)染組SiHa細胞NET-1蛋白表達強度分別為0.986±0.021、0.523±0.015和0.508±0.018(圖5)。轉(zhuǎn)染組細胞NET-1的表達顯著高于陰性轉(zhuǎn)染組(t=1.08，P<0.001)和空白未轉(zhuǎn)染組(t=29.45，P<0.001)，而陰性轉(zhuǎn)染組和空白未轉(zhuǎn)染組之間差異無顯著性，提示NET-1基因轉(zhuǎn)染顯著提高SiHa細胞NET-1蛋白的表達水平。與此同時，在陽性轉(zhuǎn)染組胞核NF-κB p65和細胞VEGF的表達水平(1.27±0.085、0.87±0.032)均分別顯著高于陰性轉(zhuǎn)染組(0.55±0.010，t=14.50，P<0.001；0.37±0.011，t=25.89，P<0.001)和空白未轉(zhuǎn)染組(0.52±0.035，t=13.99，P<0.001；0.035±0.029，t=21.1，P<0.001)。利用NF-κB激活的特異抑制劑PDTC(本實驗室儲存)預(yù)處理SiHa細胞，再對該組細胞和另一組未處理的正常SiHa細胞同時進行NET-1基因瞬時轉(zhuǎn)染，應(yīng)用Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)，在預(yù)處理組細胞NF-κB信號激活受抑制的情況下，該組VEGF的表達水平(0.39±0.036)顯著低于未處理組(0.86 ± 0.032，t=16.9，P<0.001，圖6)。

①②③④

圖1 子宮頸鱗癌組織中NET-1的表達，呈胞質(zhì)和胞核陽性，MaxVision法 圖2 子宮頸鱗癌組織中NF-κB p65的表達，呈胞核陽性，部分呈胞核和胞質(zhì)陽性，MaxVision 法 圖3 子宮頸鱗癌組織中VEGF的表達，呈胞質(zhì)陽性，MaxVision 法 圖4 子宮頸鱗癌組織中CD34內(nèi)皮標記的微血管，MaxVision法

圖5 NET-1基因瞬時轉(zhuǎn)染組、陰性轉(zhuǎn)染組和空白未轉(zhuǎn)染組SiHa細胞中NET-1、胞核NF-κB p65和細胞VEGF的表達

3

圖6 PDTC對NET-1基因轉(zhuǎn)染后SiHa細胞中胞核NF-κB p65和細胞VEGF表達水平的影響

3 討論

NET-1最初通過基因克隆技術(shù)在神經(jīng)上皮瘤細胞中發(fā)現(xiàn)，后經(jīng)研究證實其為小G蛋白家族RhoA特異的鳥苷酸交換因子，能激活RhoA信號途徑，因而認為NET-1能參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、凋亡、分化和骨架重排等一系列重要生物學過程。相繼有較多文獻發(fā)現(xiàn)，NET-1與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，如NET-1的表達能促進胃癌[3]、皮膚癌[4]、乳腺癌[5]、食管癌[6]和肝癌[7]的增殖和浸潤能力，且NET-1的高表達與非小細胞肺癌[8]預(yù)后不良有關(guān)。NET-1促進腫瘤進展的分子機制主要與其激活RhoA有關(guān)，如NET-1通過激活RhoA調(diào)節(jié)胃癌細胞骨架重排從而促進胃癌細胞的遷移浸潤能力[3]，而NET-1活化的RhoA對于TGFβ介導的乳癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是必須的[9]。NET-1分子結(jié)構(gòu)上隸屬于含4個跨膜區(qū)域蛋白超家族(transmembrane 4 superfamily, TM4SF)，其功能是作為分子的服務(wù)性蛋白，通過結(jié)合特異的細胞表面蛋白，增強功能性信號復合物的形成和穩(wěn)定，從而參與細胞的活化與增殖、黏附與遷移等。Carr等[10]研究證實，NET-1與FAK相互作用并激活FAK參與調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的運動遷移能力。最近文獻報道[2]，NET-1能與CARMA家族蛋白結(jié)合，從而介導NF-κB信號通路的激活。Panahi等[11]實驗表明，NF-κB信號途徑的激活是實體腫瘤微血管生成重要機制之一，故NET-1可能通過激活NF-κB信號途徑促進腫瘤微血管生成。然而，目前關(guān)于NET-1與腫瘤血管生成的關(guān)系報道較少。評價腫瘤血管形成程度的最客觀標準是MVD，而CD34是目前較敏感的血管標志物，對腫瘤組織內(nèi)微小血管及新生的不完整血管較為敏感[12]。本課題通過CD34標記微血管內(nèi)皮檢測子宮頸癌MVD，免疫組化檢測子宮頸癌組織中NET-1、NF-κB p65和VEGF的表達，并進一步結(jié)合細胞水平實驗，分析NET-1與子宮頸癌細胞血管誘生能力的關(guān)系。

本實驗結(jié)果顯示，與慢性子宮頸炎組織相比，NET-1在子宮頸鱗癌組織中高表達，提示NET-1可能參與子宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，NET-1的表達與子宮頸癌MVD、NF-κB p65和VEGF分別呈正相關(guān)，提示NET-1促進子宮頸癌微血管增生可能與激活NF-κB信號途徑進而上調(diào)子宮頸癌VEGF表達有關(guān)。NF-κB受上游信號因子激活后，p65亞單位易位至細胞核，通過其DNA結(jié)合位點發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。本實驗利用NET-1表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染子宮頸鱗癌SiHa細胞，并檢測胞核p65和胞質(zhì)VEGF的表達，分析NET-1的表達對NF-κB信號的活化及其對VEGF表達的影響。實驗結(jié)果顯示，陽性轉(zhuǎn)染組細胞中NET-1表達水平顯著高于陰性轉(zhuǎn)染組和空白未轉(zhuǎn)染組，說明基因轉(zhuǎn)染成功；且細胞中NF-κB p65和VEGF的表達水平也分別顯著提高，提示NET-1激活子宮頸癌細胞NF-κB信號且上調(diào)VEGF的表達。為進一步闡明NF-κB的激活與VEGF上調(diào)的關(guān)系，本實驗利用NF-κB特異的激活抑制劑PDTC預(yù)處理SiHa細胞，觀察在NF-κB信號受抑的情況NET-1對VEGF表達的影響。實驗結(jié)果顯示，在NET-1轉(zhuǎn)染的SiHa細胞中，PDTC顯著抑制NF-κB p65的細胞核水平，同時VEGF的表達水平也顯著下降，提示NET-1能通過活化NF-κB信號上調(diào)子宮頸癌VEGF的表達。H?lters等[13]證實NET-1能促進子宮頸癌SiHa細胞體外浸潤能力，且排除NET-1對子宮頸癌FAK和PI3K信號的激活作用，但并未分析NET-1對NF-κB的激活作用。NET-1促進子宮頸癌細胞浸潤能力是否也與NF-κB的活化有關(guān)，尚待進一步實驗分析。

綜上所述，本組實驗結(jié)果認為NET-1表達能促進子宮頸癌微血管生成，且其分子機制與NET-1活化NF-κB信號途徑，進而上調(diào)VEGF表達以增強子宮頸癌血管誘生能力有關(guān)。

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NET-1 promote the angiogenesis of cervical squamous cell carcinoma by activating NF-kappa B signaling pathway

ZHANG Yu-ting1, ZHANG Wen-hui2, XIONG Xiu-juan1, KUANG Xiao-dong1, SONG En-lin1

(1DepartmentofPathology,MedicalCollegeofNanchangUniversity,Nanchang330006,China;2DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China)

Purpose To explore the association of NET-1 expression with the angiogenesis of cervical squamous cell carcinoma and the related molecular mechanism. Methods Immunohistochemistry MaxVision was used to detect the expression of NET-1, NF-κB p65 and VEGF in 80 cases of cervical squamous cancer tissue and 10 cases of chronic cervicitis tissue. The microvascular density (MVD) was assessed by labeling endothelia with CD34- antibody and counted according to Weinner’s standard. The eukaryotic expression plasmid pCMV6-NET-1 was transfected into cervical squamous cancer cells by cationic liposome in order to obtain over expression of NET-1 gene.In order to inhibit the activation of NF-kappa B, cervical squamous carcinoma cells were treated with NF-kappa B specific inhibitor PDTC. The protein expression in SiHa cells was assessed by Western blotting. Results The expression level of NET-1 in the cervical squamous carcinoma tissue was significantly higher than that in the tissue of control group. NET-1 expression was positively correlated to the MVD, NF-κB p65 and VEGF expression, respectively. Transient transfection of NET-1 gene significantly increased the nuclear expression of NF-κB p65 and cytoplasm expression of VEGF in the SiHa cells. However, pretreatment of SiHa cells with NF- inhibitor PDTC significantly inhibited NET-1 induced upregulation of VEGF expression. Conclusion NET-1 promotes the angiogenesis of cervical squamous carcinoma through the activation of the NF-κB signaling which upregulate the expression of VEGF in the cancer cells.

cervical neoplasm； squamous carcinoma； NET-1； NF-κB； VEGF； angiogenesis

時間：2017-3-16 14:23

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170316.1423.008.html

江西省教育廳科技項目(GJJ14087)、江西省科技廳科技支撐計劃(2014BBG70066)

1南昌大學醫(yī)學院病理學教研室，南昌 3300062中山大學附屬第一醫(yī)院病理科，廣州 510080

張雨婷，女，碩士研究生。E-mail: 1977363165@qq.com 宋恩霖，男，博士，副教授，通訊作者。E-mail: songenling@126.com

R 737.33

A

1001-7399(2017)03-0268-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.03.008

接受日期：2017-01-07