姜桔紅，劉 靜，李 智，顧瑩瑩

腫瘤BRCA1亞細胞定位對細胞放射線及PARP抑制劑敏感性的影響

姜桔紅1，劉 靜1，李 智2，顧瑩瑩1

目的 探討腫瘤BRCA1細胞內(nèi)定位對放射線和PARP抑制劑敏感性的影響。方法 采用siRNA干擾抑制乳腺癌細胞株MCF7內(nèi)源性BRCA1表達，轉(zhuǎn)染BRCA1細胞內(nèi)定位不同的載體：pCMV-3xFlag-WT-BRCA1、pCMV-3xFlag-NES-BRCA1、pCMV-3xFlag-NLS-BRCA1。采用免疫熒光法檢測BRCA1的細胞定位及細胞核γ-H2AX和Rad51核焦點形成，應用流式細胞技術檢測細胞凋亡，克隆形成實驗檢測體外細胞存活。結果 轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-BRCA1有47%細胞核表達，23%細胞質(zhì)表達，30%細胞質(zhì)和細胞核均表達，NES-BRCA1 mutant表達主要定位于細胞核(87%)；NLS-BRCA1 mutant定位于細胞質(zhì)(82%)。WT-BRCA1、NES-BRCA1 mutant和NLS-BRCA1 mutant三種載體轉(zhuǎn)染的細胞4 Gy放射處理后2 h，Rad51核焦點陽性細胞數(shù)分別為87%、84%及13%；放射后24 h，γ-H2AX核焦點陽性細胞分別為22%、25%及59%。NLS-BRCA1 mutant轉(zhuǎn)染細胞較WT-BRCA1和NES-BRCA1 mutant轉(zhuǎn)染細胞ABT-888和放射處理后誘導的凋亡細胞增加，克隆存活減少。結論 BRCA1的細胞內(nèi)定位影響DNA雙鏈斷裂同源重組修復，并可預測腫瘤對放射和PARP抑制劑的敏感性。

BRCA1亞細胞定位；同源重組修復；放射；PARP抑制劑

聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶(poly ADP-ribose polymerase, PARP)是DNA單鏈斷裂修復途徑的重要酶[1-2]。PARP抑制劑如Olaparib抑制單鏈斷裂的堿基切除修復途徑，未修復的單鏈斷裂在復制叉形成位點將形成DNA雙鏈斷裂，PARP抑制劑是雙鏈斷裂修復功能缺陷細胞的靶向藥物，該藥對攜帶BRCA1或BRCA2基因突變的腫瘤細胞表現(xiàn)出1 000倍以上的殺傷活性，可治療與BRCA1或BRCA2基因突變相關的家族性乳腺癌、卵巢癌等[3-6]疾病。然而，90%以上的乳腺癌患者屬于散發(fā)性，不存在BRCA1或BRCA2基因突變，無雙鏈斷裂修復功能缺陷，因此不能從該藥物中獲益。文獻報道[7-9]BRCA1為穿梭蛋白，通過在細胞各部分間的穿梭來調(diào)節(jié)其功能，胞核BRCA1主要參與DNA修復和細胞周期檢測點調(diào)節(jié)，而胞質(zhì)BRCA1有調(diào)節(jié)中心粒功能和不依賴p53的凋亡途徑。本文著重探討pCMV-3xFlag-WT-BRCA1、pCMV-3xFlag-NES-BRCA1、pCMV-3xFlag-NLS-BRCA1三種穿梭功能不同的BRCA1表達載體，分別轉(zhuǎn)染MCF7細胞后的BRCA1定位情況、同源重組修復能力以及放射和PARP抑制劑敏感性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青鏈霉素購自廣州Life公司。抗體及其它試劑盒：anti-BRCA1 mouse mAb、phospho-Histone H2AX、Rad51、 anti-rabbit IgG、ab2 Fragment Alexa Flour 488 conjugated、FuGENE HD、Annexin V-FITC Apoptosis Detection kit、ABT-888。

1.2 質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染 表達載體pCMV-3xFlag-WT-BRCA1、pCMV-3xFlag-NES-BRCA1、pCMV-3xFlag-NLS-BRCA1,由Fen Xia教授惠贈。BRCA1 siRNA干擾序列為Brca1-6176 CCCTAAGTTTACTTCTCTA、Brca1-5787 GCTCCTCTCACTCTTCAGT，siRNA由上海生工公司合成。

1.3 細胞培養(yǎng) MCF7細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，培養(yǎng)基采用含10%胎牛血清、100 U/mL的青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2飽和濕度的條件下培養(yǎng)。

1.4 照射條件 照射采用西門子直線加速器ONCOR(6MV)X-ray，劑量率為2 Gy/min。假照處理為放置細胞培養(yǎng)板在儀器的載物臺上同等時間，但不啟動機器照射。

1.5 siRNA干擾和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 siRNA轉(zhuǎn)染采用上海生工公司的RNAi-Mate，并根據(jù)試劑盒說明書轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染采用FuGene HD，并根據(jù)試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染。

1.6 免疫熒光 細胞接種至已放有圓形蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中進行處理，PBS洗滌5 min，10%中性福爾馬林固定15 min，PBS洗滌5 min×2次；含0.2% Triton-X100的PBS(PBS W/0.2%TX)破膜15 min；羊血清工作液封閉45 min；抗Rad51、γ-H2AX或BRCA1一抗4 ℃孵育過夜，PBS(W/0.1%TX)洗滌5 min×3次；二抗室溫作用1 h，PBS(W/0.1%TX)洗滌5 min×3次；1 μg/mL DAPI染細胞核2 min，PBS(W/0.1%TX)洗滌5 min×3次；甘油封固，熒光顯微鏡下觀察。

1.7 凋亡分析 采用Annexin V-FITC Apoptosis Detection kit試劑盒及流式細胞儀分析細胞凋亡。細胞進行處理后，先收集上清中的懸浮細胞，然后0.25%胰蛋白酶液消化貼壁細胞，置于10%FBS培養(yǎng)基中和胰酶后離心沉淀細胞，PBS洗滌細胞2次，用1×結合緩沖液重懸細胞并調(diào)整細胞濃度為每毫升106個細胞。將100 μL細胞懸液移至流式細胞分析試管，加5 μL FITC Annexin V，5 μL PI(50 μg/mL)，輕搖混勻細胞，室溫避光放置15 min，然后加1×結合緩沖液400 μL，在1 h內(nèi)進行流式細胞分析。除實驗組、陰性對照組、陽性對照組，還需準備3管細胞作為設定流式的參數(shù)，包括無染色細胞、FITC Annexin V染色細胞、PI染色細胞。

2 結果

2.1 BRCA1的細胞內(nèi)定位影響DNA雙鏈斷裂同源重組修復 無BRCA1突變的MCF7細胞4 Gy放射后2 h，95%的BRCA1表達于胞核的細胞可見Rad51核焦點形成，而僅有15%的BRCA1表達于胞質(zhì)細胞可見Rad51核焦點形成。放射后24 h，37%的BRCA1定位在胞質(zhì)細胞γ-H2AX核焦點陽性，14%的BRCA1定位在胞核的細胞γ-H2AX核焦點陽性(表1，圖1)。Rad51核焦點的形成是細胞DNA損傷后同源重組修復途徑活化的標志物。γ-H2AX核焦點主要形成于未修復的雙鏈斷裂斷端，是雙鏈斷裂的原位標記，γ-H2AX核焦點的持續(xù)存在表明雙鏈斷裂未能被修復，提示BRCA1的細胞內(nèi)定位影響放射后的雙鏈斷裂同源重組修復。

AB

圖1 A.Rad51核焦點形成；B.γ-H2AX核焦點形成

與BRCA1定位胞核細胞比較，**P<0.01

2.2 BRCA1出核序列變異影響B(tài)RCA1在細胞內(nèi)的定位及DNA雙鏈斷裂重組修復 為進一步證明BRCA1的細胞內(nèi)定位影響DNA雙鏈斷裂重組修復，我們用針對內(nèi)源性BRCA1 mRNA的5′非翻譯區(qū)序列的siRNA抑制MCF7細胞內(nèi)源性野生型BRCA1的表達，再轉(zhuǎn)染不受siRNA干擾作用的穿梭功能不同的外源性BRCA1表達載體，包括WT-BRCA1、NES-BRCA1 mutant、NLS-BRCA1 mutant。免疫熒光檢測三種BRCA1表達載體在細胞內(nèi)的定位情況，WT-BRCA1有47%細胞呈胞核表達，23%細胞呈胞質(zhì)表達，30%細胞呈胞質(zhì)和胞核均表達(表2)。與WT-BRCA1相比，NLS-BRCA1 mutant表達主要定位在細胞質(zhì)(82%)；NES-BRCA1 mutant表達主要在胞核(87%)。

表2 3種表達載體轉(zhuǎn)染MCF7細胞的細胞內(nèi)定位

與WT-BRCA1轉(zhuǎn)染細胞比較，**P<0.01

3種載體轉(zhuǎn)染細胞4 Gy放射處理后2 h，轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-BRCA1、NES-BRCA1 mutant和NLS-BRCA1 mutant細胞Rad51核焦點陽性細胞分別為87%、84%及13%；放射處理后24 h，轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-BRCA1、NES-BRCA1 mutant和NLS-BRCA1 mutant細胞γ-H2AX核焦點陽性細胞分別為22%、 25%及59%。 以上結果表明：BRCA1定位在胞核細胞比BRCA1定位在胞質(zhì)細胞的同源重組修復雙鏈斷裂能力強，未修復雙鏈斷裂量少(表3)。

表3 3種表達載體轉(zhuǎn)染MCF7細胞放射后

與WT-BRCA1及NES-BRCA1 mutant轉(zhuǎn)染細胞比較，**P<0.01

2.3 BRCA1的細胞內(nèi)定位影響細胞的放射敏感性和PARP抑制劑敏感性 3種載體轉(zhuǎn)染細胞給予4 Gy放射處理或ABT-888(10 μmol/L)處理，48 h后收集細胞，Annexin V-FITC和PI染色后進行流式細胞儀檢測細胞凋亡量。轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-BRCA1、NES-BRCA1 mutant和NLS-BRCA1 mutant細胞ABT-888(10 μmol/L)誘導的細胞凋亡分別為4%、5%及14.5%；轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-BRCA1、NES-BRCA1 mutant和NLS-BRCA1 mutant細胞，4 Gy放射處理誘導的細胞凋亡分別為6.7%、7.5%及19%(表4)。

表4 3種表達載體轉(zhuǎn)染MCF7細胞放射和

與WT-BRCA1及NES-BRCA1 mutant轉(zhuǎn)染細胞比較，**P<0.01

克隆形成實驗進一步驗證3種載體轉(zhuǎn)染細胞的PARP抑制劑和放射敏感性。轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-BRCA1和NES-BRCA1 mutant細胞對ABT-888各濃度均不敏感，但轉(zhuǎn)染NLS-BRCA1 mutant細胞隨著ABT-888濃度增加克隆存活明顯減少(圖2)。轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-BRCA1和NES-BRCA1 mutant隨放射劑量增加克隆存活逐漸減少，但轉(zhuǎn)染NLS-BRCA1 mutant細胞隨著放射劑量增加克隆存活減少更為顯著。

3 討論

PARP抑制劑是正在廣泛研究的潛在治療乳腺癌和卵巢癌的口服化療藥物，主要用于治療BRCA1或BRCA2突變相關的腫瘤。在Ⅱ期臨床實驗中41%(11/27)的攜帶有BRCA1或BRCA2基因遺傳性突變的乳腺癌患者對PARP抑制劑治療有反應[6]。但只有10%乳腺癌患者與BRCA1或BRCA2基因遺傳性突變有關，90%以上乳腺癌患者屬于散發(fā)性，不存在BRCA1或BRCA2基因突變。此結果表明BRCA1在細胞內(nèi)的定位影響其同源重組修復功能及PARP抑制劑敏感性；BRCA1定位于胞質(zhì)的細胞較BRCA1定位于胞核的細胞PARP抑制劑敏感性增高。BRCA1定位將成為預測PARP抑制劑敏感性的生物學標志物。

BRCA1是第一個克隆的與乳腺癌及卵巢癌易感性相關的腫瘤抑制基因[10]。50%的遺傳性乳腺癌患者及90%的有乳腺癌和卵巢癌易感性的家族攜帶者有生殖細胞BRCA1基因突變。BRCA1位于染色體17q21，是具有24個外顯子的長基因，編碼1 863個氨基酸殘基的蛋白[11]。BRCA1蛋白的氨基末端有個環(huán)狀(RING)結構域，羧基末端有卷曲螺旋結構和串聯(lián)的BRCT重復結構，這些結構均為BRCA1參與DNA損傷反應和修復信號轉(zhuǎn)導提供條件。BRCA1通常與也具有RING/BRCT結構域的乳腺癌相關蛋白BARD1結合成二聚體[12]。BRCA1參與細胞的多種功能和信號轉(zhuǎn)導，包括：DNA復制、DNA修復、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞周期調(diào)控點控制、細胞凋亡、蛋白泛素化等；這些功能的缺失將有可能導致腫瘤的發(fā)生[13]。DNA損傷修復對細胞的增殖和存活非常重要，BRCA1參與多種DNA修復途徑，其中最重要的是雙鏈斷裂的同源重組修復。細胞DNA發(fā)生雙鏈斷裂后，最先在DNA雙鏈斷裂處啟動的是組蛋白H2AX的磷酸化，形成γ-H2AX，然后γ-H2AX結合BRCA1、Rad50、Rad51、Rad54、BRCA2、MSN復合物等啟動DNA損傷修復的級聯(lián)反應[14]。

A

圖2 3種表達載體轉(zhuǎn)染MCF7細胞，放射和ABT-888處理后的克隆存活：A.克隆形成；B.3種表達載體轉(zhuǎn)染MCF7細胞放射后細胞克隆形成率；C.ABT-888處理后的細胞克隆形成率

BRCA1是穿梭蛋白，可通過控制其在各個細胞器的穿梭調(diào)節(jié)其功能。BRCA1通過2個位于蛋白中段的細胞核定位信號(NLS)與輸入蛋白(importin)的a/β轉(zhuǎn)運系統(tǒng)結合進入胞核[15]；BRCA1通過氨基末端RING結構區(qū)的2個核輸出信號序列(NES)與CRM1/輸出蛋白(Exportin)結合到胞質(zhì)[8,16]。通過在BRCA1 mutant的NLS和NES結構域引入突變構建穿梭功能不同的外源性BRCA1表達載體。WT-BRCA1在胞核和胞質(zhì)均有表達；NES-BRCA1 mutant無出核功能，主要聚集在胞核；NLS-BRCA1 mutant無入核功能，主要聚集在胞質(zhì)。放射處理后2 h，轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-BRCA1和NES-BRCA1 mutant細胞Rad51核焦點形成較多；轉(zhuǎn)染NLS-BRCA1 mutant細胞Rad51核焦點形成較少。放射處理后24 h，WT-BRCA1和NES-BRCA1 mutant細胞較轉(zhuǎn)染NLS-BRCA1 mutant細胞γ-H2AX核焦點明顯減少。Rad51核焦點的形成是細胞DNA損傷后同源重組修復途徑活化的標志物。γ-H2AX核焦點主要形成于未修復的雙鏈斷裂斷端，是雙鏈斷裂的原位標記，γ-H2AX核焦點的持續(xù)存在表明雙鏈斷裂未能被修復。此結果證明NES-BRCA1 mutant、NLS-BRCA1 mutant的突變影響B(tài)RCA1定位，定位在胞核的細胞較BRCA1定位在胞質(zhì)的細胞DNA雙鏈斷裂損傷修復能力強，未修復的DNA損傷量少。

三種載體轉(zhuǎn)染細胞給予4 Gy放射處理或ABT-888處理后，轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-BRCA1和NES-BRCA1 mutant細胞處理后的凋亡細胞量均較少，轉(zhuǎn)染NLS-BRCA1 mutant細胞處理后的凋亡細胞量明顯增加?？寺⌒纬蓪嶒炦M一步驗證了轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-BRCA1和NES-BRCA1 mutant對放射和ABT-888不敏感；轉(zhuǎn)染NLS-BRCA1 mutant細胞對放射和ABT-888的殺傷作用更敏感。已有研究表明乳腺癌相關蛋白BARD1的氨基末端有1個CRM1依賴的NES序列參與其蛋白的出核。Yang等[13]報道誘導BARD1出核也可使細胞凋亡增加，與本實驗結果一致。

綜上所述，BRCA1在細胞內(nèi)的定位可影響其同源重組介導的雙鏈斷裂修復功能，并可預測腫瘤對放射和PARP抑制劑的敏感性。誘導BRCA1出核將可增加細胞對放射和PARP抑制劑的敏感性。

[1] Dantzer F, Schreiber V, Niedergang C,etal. Involvement of poly (ADP-ribose) polymerase in base excision repair[J]. Biochimie, 1999,81(1-2):69-75.

[2] Ame J C, Spenlehauer C, de Murcia G. The PARP superfamily[J]. Bioessays, 2004,26(8):882-893.

[3] Farmer H, McCabe N, Lord C J,etal. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy[J]. Nature, 2005,434(7035):917-921.

[4] 朱亞寧，吳 健，周武碧，張智弘. 三陰型乳腺癌中BRCA1的表達及其預后意義[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2015,31(7):740-743.

[5] Fong P C, Boss D S, Yap T A,etal. Inhibition of poly (ADP-ribose) polymerase in tumors from BRCA mutation carriers[J]. N Engl J Med, 2009,361(2):123-134.

[6] Tutt A, Robson M, Garber J E,etal. Oral poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor olaparib in patients with BRCA1 or BRCA2 mutations and advanced breast cancer: a proof-of-concept trial[J]. Lancet, 2010,376(9737):235-244.

[7] Scully R, Chen J, Och R L,etal. Dynamic changes of BRCA1 subnuclear location and phosphorylation state are initiated by DNA damage[J]. Cell, 1997,90(3):425-435.

[8] Rodriguez J A, and Henderson B R. Identification of a functional nuclear export sequence in BRCA1[J]. J Biol Chem, 2000,275(49):38589-38596.

[9] Jiang J H, Yang E S, Jiang G C,etal. p53-dependent BRCA1 nuclear export controls cellular susceptibility to DNA damage[J]. Cancer Res, 2011,71(16):5546-5557.

[10] Miki Y, Swensen J, Shattuck-Eidens D,etal. A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1[J]. Science, 1994,266(5182):66-71.

[11] Couch F J, Weber B L. Mutations and polymorphisms in the familial early-onset breast cancer (BRCA1) gene[J]. Breast Cancer Information Core[J]. Hum Mutat, 1996,8(1):8-18.

[12] Rodriguez J A, Schüchner S, Au W W,etal. Nuclear-cytoplasmic shuttling of BARD1 contributes to its proapoptotic activity and is regulated by dimerization with BRCA1[J]. Oncogene, 2004,23(10):1809-1820.

[13] Yang E S, Xia F. BRCA1 16 years later: DNA damage-induced BRCA1 shuttling[J]. FEBS J, 2010,277(15):3079-3085.

[14] Au W W, Henderson B R. The BRCA1 RING and BRCT domains cooperate in targeting BRCA1 to ionizing radiation-induced nuclear foci[J]. J Biol Chem, 2005,280(8):6993-7001.

[15] Chen C F, Li S, Chen Y,etal. The nuclear localization sequences of the BRCA1 protein interact with the importin-αsubunit of the nuclear transport signal receptor[J]. J Biol Chem, 1996,271(51):32863-32868.

[16] Thompson M E, Robinson-Benion C L, Holt J T. An amino-terminal motif functions as a second nuclear export sequence in BRCA1[J]. J Biol Chem, 2005,280:21854-21857.

theFirstAffiliatedHospital,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510120,China;2DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China)

The effect of subcellular localization of tumor BRCA1 on the sensitivity of cell radiation and PARP inhibitor

JIANG Ju-hong1, LIU Jing1, LI Zhi2, GU Ying-ying1

(1TheStateKeyLaboratoryofRespiratoryDisease,GuangzhouInstituteofRespiratoryDisease,

Purpose To investigate the effect of subcellular location of tumor BRCA1 on the sensitivity to ionizing radiation (IR) and PARP inhibitor. Methods siRNA of BRCA1 were first used to inhibit endougenous BRCA1 expression in MCF7 cells. Then, plasmids of pCMV-3xFlag-WT-BRCA1, pCMV-3xFlag-NES-BRCA1 and pCMV-3xFlag-NLS-BRCA1 were transfected in MCF7 cells. Immunofluorescence staining was used to detect BRCA1 subcellular location as well as the formation of Rad51 and γ-H2AX foci. Apoptotic cells were analyzed by flow cytometry, and colony formation assay was performed to evaluate the survival of cells. Results There were 47% cells with nuclear BRCA1, 23% cells with cytoplasmic BRCA1 and 30% cell with mixed nuclear and cytoplasmic BRCA1 expression in WT-BRCA1 transfected cell. There were 87% cells with nuclear BRCA1 in NES-BRCA1 transfected cell, and 82% cells with cytoplasmic BRCA1 in NLS-BRCA1 transfected cell. There were 87%, 84% and 13% Rad51 foci positive cells at 2 hours after 4 Gy radiation treatment and 22%, 25% and 59% γ-H2AX foci positive cells at 24 hours after 4Gy radiation treatment in WT-BRCA1, NES-BRCA1 mutant and NLS-BRCA1 mutant transfected cell respectively. ABT-888 and radiation treatment induced more apoptosis and fewer colonies in NLS-BRCA1 transfected cell than WT-BRCA1, NES-BRCA1 mutant transfected cell. Conclusion Subcellular location of BRCA1 might affect homologous recombination repair of DNA double strand breaks and can be used to predict sensitivity to IR and PARP inhibitor.

BRCA1 subcellular location; homologous recombination; ionizing radiation; PARP inhibitor

時間：2017-3-16 14:23

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170316.1423.005.html

國家自然科學基金(81272901)

1廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院呼吸疾病國家重點實驗室/廣州呼吸疾病研究所， 廣州 5101202中山大學附屬第一醫(yī)院病理科，廣州 510080

姜桔紅，女，博士，副研究員。Tel:(020)83205060，E-mail：juhongjiang2006@163.com 顧瑩瑩，女，主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail: gyblgyy@126.com

R 737.9

A

1001-7399(2017)03-0253-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.03.005

接受日期：2017-02-09