李 慶，吳正升，沈玉君，馮利杰，沈玉先

·論 著·

乳腺癌中RNF2的表達(dá)及其臨床意義

李 慶1，吳正升1，沈玉君2，馮利杰2，沈玉先2

目的 觀察RNF2在乳腺病變組織及乳腺上皮細(xì)胞系中的表達(dá)，探討其表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系。方法 運(yùn)用免疫組化EnVision兩步法檢測(cè)21例乳腺良性病變組織和112例乳腺癌組織中RNF2蛋白的表達(dá)，分析其表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系。應(yīng)用qRT-PCR法檢測(cè)2株乳腺正常上皮細(xì)胞系和5株乳腺癌細(xì)胞系中RNF2基因的表達(dá)。結(jié)果 乳腺癌組織中RNF2蛋白表達(dá)水平與乳腺良性病變組織相比顯著升高(P<0.05)，且其表達(dá)與乳腺癌腫瘤直徑、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、TNM分期顯著相關(guān)(P均<0.05)；與患者年齡、組織學(xué)分級(jí)、ER、PR、HER-2表達(dá)情況無(wú)顯著相關(guān)(P均>0.05)；乳腺癌細(xì)胞系RNF2 mRNA水平亦高于乳腺良性上皮細(xì)胞系(P<0.05)。結(jié)論 RNF2在乳腺癌組織中高表達(dá)，可作為乳腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。

乳腺腫瘤；環(huán)指蛋白2；免疫組織化學(xué)；qRT-PCR

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，在我國(guó)女性癌癥發(fā)生率和病死率中分別居第1位和第6位[1]；探索乳腺癌進(jìn)展機(jī)制，尋找潛在的治療靶點(diǎn)，成為廣大科研工作者的研究熱點(diǎn)。RNF2是多梳蛋白家族(polycomb group proteins, PcGs)的核心成員之一，具有E3連接酶的活性，從而在人類多種腫瘤中發(fā)揮重要作用[2]。目前，關(guān)于RNF2在乳腺癌中的表達(dá)及其意義國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本文著重探討RNF2在乳腺癌中的表達(dá)，并分析其表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2003～2004年安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科存檔的112例乳腺癌標(biāo)本和21例乳腺良性病變(包括乳腺腺病和纖維腺瘤)標(biāo)本，患者均為女性，且所有患者術(shù)前均未行放、化療等抗腫瘤治療。依據(jù) WHO(2012)乳腺腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各例進(jìn)行病理學(xué)分型、分級(jí)和分期[3]。所有組織均以10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水浸蠟，石蠟包埋，4 μm厚切片，常規(guī)HE染色。

1.2 組織芯片制備 光鏡下觀察常規(guī)HE染色切片，并進(jìn)行定位、標(biāo)記，選取病變明顯且組織壞死較少的位點(diǎn)，每例供體標(biāo)本選3個(gè)位點(diǎn)；使用TM-1型組織芯片制備儀(遼寧恒泰公司)，取樣針內(nèi)徑為1.5 mm，根據(jù)HE切片的定位，在相應(yīng)組織蠟塊上找到取樣位置，通過(guò)取樣、點(diǎn)樣，每枚蠟塊制成11×9點(diǎn)陣；以4 μm厚連續(xù)切片，貼附于10%多聚賴氨酸預(yù)處理的防脫載玻片上。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)所用的乳腺上皮細(xì)胞系和乳腺癌細(xì)胞系HMEC、MCF-10A、BT549、SKBR3、MCF-7、MDA-MB-231、T47D均購(gòu)自ATCC公司，按照推薦條件培養(yǎng)(采用含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng))；待細(xì)胞融合率達(dá)90%時(shí)提取RNA。

1.4 免疫組化 兔抗人RNF2多克隆抗體購(gòu)自O(shè)rigene公司，稀釋度1 ∶500。免疫組化EnVision兩步法試劑盒及DAB顯色劑試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋公司。具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，以PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照。由兩名病理醫(yī)師采用雙盲法對(duì)染色切片進(jìn)行全面觀察，以細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性；每例切片隨機(jī)選擇3個(gè)高倍視野(200倍)的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，陽(yáng)性細(xì)胞比例≥10%即為陽(yáng)性組，其余均為陰性組。

1.5 RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄 使用Trizol試劑(Ambion公司)按試劑盒說(shuō)明書從前述7株細(xì)胞系中提取總RNA。取1 μg細(xì)胞總RNA加入RT酶試劑盒(Takara公司)和滅RNA酶的水，配成20 μL體系，在37 ℃的條件下行RT-PCR 15 min，在85 ℃的條件下維持15 s后終止。

1.6 qRT-PCR 以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，合計(jì)40個(gè)循環(huán)，最后延伸60 ℃ 30 s。每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次；進(jìn)行qRT-PCR的引物序列如下。RNF2上游： 5′-GCGAGGCAAGAAACAACAG-3′，下游：5′-CAACAGTGGCGTTACCAGAA-3′；GAPDH上游：5′-CCACTCCTCCACCTTTG-3′，下游：5′-CACCACCCTGTTGCTGT-3′；引物均由上海生工公司合成。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。樣本率分析應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，定量資料比較用Studentt檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNF2蛋白在乳腺癌組織和乳腺良性病變中的表達(dá) RNF2在乳腺癌組織和乳腺良性病變組織中的表達(dá)，主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核(圖1)。在112例乳腺癌組織中，63例RNF2蛋白陽(yáng)性，49例陰性；21例乳腺良性病變組織中，6例RNF2為陽(yáng)性，15例陰性。RNF2蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯高于乳腺良性病變組織，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.427，P<0.05，表1)。

AB

圖1 A.乳腺癌組織中RNF2呈陽(yáng)性，EnVision兩步法；B.乳腺良性病變組織中RNF2呈陰性，EnVision兩步法

表1 RNF2在乳腺癌組織和乳腺良性病變組織中的表達(dá)

2.2 RNF2蛋白表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 RNF2蛋白表達(dá)與腫瘤大小、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目和TNM分期相關(guān)(P<0.05)；與患者年齡、組織學(xué)分級(jí)、ER、PR、HER-2表達(dá)情況無(wú)關(guān)(P>0.05，表2)。

表2 RNF2表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 RNF2 mRNA在乳腺癌細(xì)胞系和乳腺上皮細(xì)胞系中的表達(dá) qRT-PCR結(jié)果顯示：RNF2 mRNA在MCF-10A和HMEC乳腺上皮細(xì)胞系中低表達(dá)；在BT549、SKBR3、T47D、MCF-7、MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系中高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

3 討論

圖2 qRT-PCR法檢測(cè)RNF2 mRNA在乳腺上皮細(xì)胞系和乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

RNF2又稱RING1B，屬于PcGs的一員。PcGs基因首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為可維持Hox等生長(zhǎng)調(diào)控因子的表達(dá)水平，具有促進(jìn)組蛋白脫去乙?；?，阻滯ATP依賴的染色體重塑，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄的作用。據(jù)報(bào)道，PcGs參與多種細(xì)胞生命活動(dòng)，包括細(xì)胞周期調(diào)控、癌癥、老化、X染色體失活、決定細(xì)胞結(jié)局及干細(xì)胞分化。在哺乳動(dòng)物中，PcGs包含兩個(gè)核心組件，分別是多梳抑制復(fù)合體1和2(PRC1和PRC2)。人PRC1復(fù)合體包含CBX2、CBX4、CBX6、CBX7、CBX8、PHC1、PHC2、PHC3、BMI1、MEL18、MBLR、NSPC1、RING1A和RING1B。人PRC2復(fù)合體包含EZH1、EZH2/ENX1/KMT6、SUZ12和EED。PcGs主要通過(guò)表觀遺傳學(xué)事件抑制靶基因的活性、參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展、調(diào)控，如DNA甲基化、組蛋白脫甲基化、巨組蛋白H2A聯(lián)系、組蛋白脫乙?；取mi1是PcGs家族中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有促癌作用的蛋白，其與MYC基因協(xié)同促進(jìn)B細(xì)胞淋巴瘤和T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生；后續(xù)PcGs家族其他成員均發(fā)現(xiàn)與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，如SUZ12、EZH2、PCL3、RAE28等。RNF2作為PRC1的重要成員，具有環(huán)指結(jié)構(gòu)域，憑借其E3連接酶的特性，催化組蛋白H2A 119位賴氨酸單泛素化，從而可通過(guò)壓縮染色質(zhì)造成基因沉默并抑制轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)階段的進(jìn)行，在干細(xì)胞增殖分化、維持干細(xì)胞自我更新能力與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮一定作用[4-8]。

研究表明，RNF2在惡性腫瘤中高表達(dá)，發(fā)揮促癌作用。Yang等[9]發(fā)現(xiàn)在食管癌組織中RNF2蛋白顯著高表達(dá)，與腫瘤大小、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，且與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)；Li等[10]通過(guò)免疫組化和FISH法在侵襲性卵巢癌中發(fā)現(xiàn)，RNF2蛋白和基因高表達(dá)，與TNM分期、組織學(xué)分級(jí)、FIGO分期及Ki-67增殖指數(shù)密切相關(guān)；Li等[11]運(yùn)用免疫組化和FISH法發(fā)現(xiàn)RNF2蛋白及基因在膀胱尿路上皮癌中表達(dá)顯著高于膀胱黏膜，但其高表達(dá)與臨床病理特征無(wú)相關(guān)性，而與患者預(yù)后不良相關(guān)；Chen等[12]通過(guò)免疫組化法發(fā)現(xiàn)RNF2蛋白在胰腺癌組織中定位于細(xì)胞核，且呈高表達(dá)；而在癌旁正常胰腺組織中低表達(dá)，癌組織中高表達(dá)RNF2與患者5年生存率呈負(fù)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)RNF2蛋白在乳腺癌中高表達(dá)，陽(yáng)性率高于其在乳腺良性病變組織，提示乳腺癌中RNF2可能發(fā)揮促癌作用；本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)RNF2蛋白在乳腺癌組織中主要定位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)，而以往報(bào)道主要定位于細(xì)胞核，可能與抗體來(lái)源不同相關(guān)；臨床病理特征分析RNF2陽(yáng)性與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，而與患者年齡、組織學(xué)分級(jí)、ER、PR、HER-2表達(dá)情況無(wú)關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相符，提示RNF2陽(yáng)性可能與乳腺癌轉(zhuǎn)移、侵襲存在一定聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)未分析RNF2蛋白表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后、Ki-67增殖指數(shù)的聯(lián)系，將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行進(jìn)一步分析。

有研究表明RNF2對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移，細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡存在一定作用。Bosch等[13]運(yùn)用免疫組化法發(fā)現(xiàn)RNF2蛋白在乳腺癌組織中高表達(dá)，其在乳腺癌細(xì)胞系中通過(guò)維持Fak表達(dá)水平促進(jìn)細(xì)胞侵襲、遷移能力；Yang等[9]報(bào)道在食管癌細(xì)胞系中沉默RNF2的表達(dá)，細(xì)胞增殖受到抑制，且促進(jìn)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中癌細(xì)胞對(duì)放射的敏感性；周春輝等[14]報(bào)道下調(diào)RNF2的表達(dá)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)其放射敏感性。RNF2對(duì)腫瘤的調(diào)控作用可能是通過(guò)MDM2-p53通路介導(dǎo)發(fā)揮的。RNF2負(fù)性調(diào)控p53基因的表達(dá)，主要通過(guò)直接與p53、MDM2結(jié)合，促進(jìn)MDM2介導(dǎo)的p53泛素化降解；同時(shí)延長(zhǎng)MDM2的半衰期，抑制其自身泛素化降解[15-16]。本實(shí)驗(yàn)在體外細(xì)胞系中檢測(cè)RNF2 mRNA水平，同免疫組化結(jié)果一致，乳腺癌細(xì)胞系中RNF2基因表達(dá)水平高于乳腺上皮細(xì)胞系，為進(jìn)一步體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)提供充足依據(jù)，從而后續(xù)可根據(jù)各個(gè)乳腺癌細(xì)胞系中RNF2 mRNA相對(duì)水平進(jìn)行更加完善的功能和機(jī)制實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，乳腺癌中E3連接酶RNF2高表達(dá)，與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)，可能與乳腺癌轉(zhuǎn)移、侵襲相關(guān)，為乳腺癌提供一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。

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Expression of RNF2 in breast carcinoma and its significance

LI Qing1, WU Zheng-sheng1, SHEN Yu-jun2, FENG Li-jie2, SHEN Yu-xian2

(1DepartmentofPathology,2InstituteofBiopharmaceuticals,SchoolofBasicMedicalScience,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Purpose To investigate the expression of RNF2 in breast disease tissues and cell lines, and to analyze the association between expression of RNF2 and clinicopathological characteristics in breast carcinoma. Methods Expression of RNF2 protein and mRNA levels was detected using immunohistochemistry of EnVision two-step and qRT-PCR in breast carcinoma and benign breast disease as well as in cell lines. Results RNF2 expression was significantly higher in breast carcinoma tissue specimens compared with benign breast disease specimens (P<0.05). Besides, the expression of RNF2 protein was significantly associated to tumor size, lymph node status and TNM stage (P<0.05 for both), but was not related to age, histological grade, the expression of ER, PR and HER-2 (P>0.05 for both). Higher expression of RNF2 mRNA was detected in breast carcinoma cell lines compared with breast epithelial cell lines (P<0.05). Conclusion RNF2 is overexpressed in breast carcinoma and can be a potential therapeutic target for breast carcinoma.

breast neoplasm；RNF2；immunohistochemistry；qRT-PCR

時(shí)間：2017-3-16 14:23

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170316.1423.001.html

國(guó)家自然科學(xué)基金(81472493、81372576)、安徽省學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人及后備人選科研活動(dòng)經(jīng)費(fèi)(2016H074)

安徽醫(yī)科大學(xué)1病理學(xué)教研室、2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物藥物研究所，合肥 230032

李 慶，女，碩士研究生。E-mail: 863665545@qq.com 吳正升，男，博士，教授，通訊作者。E-mail: woozson@126.com

R 737.9

A

1001-7399(2017)03-0237-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.03.001

接受日期：2017-01-10