蔡方雨，鄒志田，朱曉峰

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸心外科，黑龍江 佳木斯 154003)

自噬促進肺腺癌細胞對培美曲塞耐藥的實驗研究①

蔡方雨，鄒志田，朱曉峰

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸心外科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：研究自噬在對培美曲塞耐藥的肺腺癌細胞中的作用。方法：采用MTT法檢測對培美曲塞耐藥的H1299和A549細胞的增殖；采用免疫印跡檢測對培美曲塞耐藥的H1299和A549細胞自噬相關(guān)蛋白的改變；采用自噬抑制劑CQ抑制自噬后觀察培美曲塞對耐藥H1299和A549細胞的抑制作用。結(jié)果：成功培養(yǎng)出對培美曲塞耐藥的肺腺癌細胞系；對培美曲塞耐藥的肺腺癌細胞自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達和LC3-I 向LC3-II 的轉(zhuǎn)換增加，p62表達降低；自噬抑制劑CQ提高培美曲塞對耐藥肺腺癌細胞的抑制作用。結(jié)論：對培美曲塞耐藥的肺腺癌細胞自噬增強，抑制自噬提高培美曲塞對耐藥肺腺癌細胞的抑制作用，自噬的激活是肺腺癌細胞對培美曲塞耐藥的原因之一。

肺腺癌；培美曲塞；耐藥；自噬

肺癌是最常見的癌癥類型，而且也是癌癥死亡的首要原因,非小細胞肺癌是肺癌中最常見的類型[1,2]。對于局部晚期或轉(zhuǎn)移性的腫瘤組織學(xué)被證實為腺癌或大細胞癌的患者，培美曲塞聯(lián)合順鉑被推薦為一線治療選擇[3]。培美曲塞是一種新型抗葉酸制劑，可通過抑制腫瘤細胞內(nèi)多種酶的活性影響腫瘤細胞DNA合成，從而發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用[4]。自噬與腫瘤發(fā)生的關(guān)系已在許多研究中有所報道[5]。多項研究表明自噬是腫瘤治療的新靶點[6～8]?，F(xiàn)已知許多應(yīng)激因素可以誘導(dǎo)癌細胞自噬上調(diào)，包括營養(yǎng)不足、缺氧、抗腫瘤治療帶來的細胞損傷，并且某些癌癥細胞可能利用自噬的增強作為耐藥機制或促進腫瘤生長[9]。同其他化療藥物相似，耐藥是導(dǎo)致培美曲塞對肺癌患者療效不佳的重要因素。肺癌細胞對培美曲塞耐藥的產(chǎn)生是否與用藥期間肺癌細胞自噬作用的激活有關(guān)尚不明確。本研究通過體外培養(yǎng)耐培美曲塞的A549和H1299細胞株，并觀察耐藥細胞株自噬相關(guān)蛋白表達情況以及耐藥細胞株在自噬受抑制條件下對培美曲塞的敏感性變化，進而探討肺腺癌對培美曲塞的耐藥機制與肺腺癌細胞自噬功能之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

人NSCLC細胞A549、H1299購自ATCC; DMEM高糖培養(yǎng)基購于Hyclone公司；胎牛血清購于Biological Industries公司; 蛋白Marker購自Fermentas公司; PVDF膜購于Millipore公司; 培美曲塞(PEM)購于美國禮來公司; 氯喹( chloroquine，CQ) 購于Aladdin公司; LC3I/II， Beclin-1， p62，β-actin抗體購于Cell Signaling Technology；羊抗兔IgG二抗購于北京中杉金講橋生物科技公司。

1.2 方法1.2.1 耐藥細胞培養(yǎng)

用含有PEM的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)A549、H1299兩種肺腺癌細胞系，PEM濃度為2μmol/L，每48h更換培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)3個月。3個月后進行耐藥檢測。

1.2.2 細胞增殖抑制實驗

取對數(shù)期肺腺癌細胞，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入0.5×104個細胞，空白組只含有培養(yǎng)基而無細胞，24h后將培養(yǎng)液換成含PEM的完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)72h后，加入20μLMTT，37℃孵育4h，用加入100μL二甲基亞砜溶解MTT，用酶標儀在490nm波長下測量吸光值。通過GraphPad Prism 5.0軟件繪制細胞增殖活性曲線。

1.2.3 免疫印跡分析

將A549、A549-PEM、H1299、H1299-PEM細胞分別接種于6孔板中，24h后加入含有不同濃度PEM的完全培養(yǎng)液，處理72h后，棄去原培養(yǎng)液，用冷PBS清洗，細胞裂解液裂解細胞，12000G×5min離心后收集上清，加入1/4體積的蛋白上樣液，沸水中煮10min，上樣進行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)，5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1h，相應(yīng)一抗于4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜10min×3次，加入相應(yīng)的HRP標記的二抗，室溫孵育1h，用碧云天 ECL發(fā)光液、柯達膠片顯影，β-actin作為對照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)耐PEM的A549，H1299細胞系

經(jīng)過3個月的連續(xù)培養(yǎng)，成功培養(yǎng)出了兩株耐PEM的肺腺癌細胞系，分別命名為A549-PEM、H1299-PEM。與A549、H1299相比，A549-PEM、H1299-PEM對PEM的敏感性明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1、2。

圖1A549與A549-PEM對PEM的敏感性對比

圖2 H1299與H1299-PEM對PEM的敏感性對比

2.2A549-PEM、H1299-PEM自噬相關(guān)蛋白表達增加

LC3-I/II、Beclin-1、p62是自噬活化中的重要蛋白。LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)換增加,Beclin-1蛋白的表達與自噬活化呈正相關(guān)；p62的表達同自噬活化呈負相關(guān)。Westernblot結(jié)果表明，A549-PEM、H1299-PEM中，LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)換增加,Beclin-1蛋白的表達增加，p62蛋白的表達減少，見圖3。

圖3 Western blot結(jié)果

2.3 抑制自噬提高PEM對A549-PEM、H1299-PEM的抑制作用

為了進一步證明自噬活化導(dǎo)致肺腺癌細胞耐藥的發(fā)生，我們用CQ來抑制自噬并檢測自噬抑制后PEM對耐藥細胞的作用。MTT分析表明，自噬抑制劑CQ促進了PEM對A549-PEM、H1299-PEM的抑制作用(P<0.05)，統(tǒng)計學(xué)意義明顯，見圖4、5。

圖4 應(yīng)用CQ后PEM對A549-PEM抑制作用變化

圖5 應(yīng)用CQ后PEM對H1299-PEM抑制作用變化

3 討論

自噬是細胞維持自我穩(wěn)態(tài)和進化上的一種保守降解過程，是細胞的一種自我防御機制[7,10]。為從細胞成分中獲取能量和營養(yǎng)，自噬作用通過將長壽蛋白和受損細胞器轉(zhuǎn)入溶酶體內(nèi)進行降解，并將養(yǎng)分釋放入細胞質(zhì)內(nèi)以回收利用建立新的大分子[7,9]。自噬在正常條件下保持基礎(chǔ)的活躍水平，但在外界壓力因素影響下，自噬作為細胞生存機制，會通過增加非選擇性或選擇性降解來進行應(yīng)答。化療藥物可能會進一步誘導(dǎo)改變細胞的信號傳導(dǎo)和代謝,從而激活細胞自噬機制以便抵抗外界壓力。在腫瘤的發(fā)生和治療期間腫瘤細胞的代謝異常,以及隨后腫瘤細胞依賴自噬適應(yīng)這樣的失調(diào),為癌癥治療提供了新的分子靶點[8]。

微管相關(guān)蛋白1A/1B輕鏈3(LC3)是一個可溶性蛋白，其分子量為17kDa，并且廣泛分布于人工培養(yǎng)細胞和哺乳動物組織[11]。在自噬中，胞漿型LC3(LC3-I)通過與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-磷脂酰乙醇胺共軛體(LC3-II)，聚集于自噬體膜。自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，自噬體內(nèi)成分由溶酶體水解酶降解。同時，LC3-II在自噬溶酶體的腔內(nèi)被分解。因此，自噬體的標記LC3-II在溶酶體內(nèi)的轉(zhuǎn)化反映了自噬活動[13]。LC3已經(jīng)被廣泛用于檢測細胞自噬[14]。

在哺乳動物和果蠅中，自噬抑制與p62水平的增加有相關(guān)性，這提示p62蛋白的穩(wěn)態(tài)水平反映自噬活動狀態(tài)。同樣，p62水平降低有關(guān)自噬激活[15]。P62是多結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，含有不同種類的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域，包括N-端PB1結(jié)構(gòu)域，ZZ型鋅指結(jié)構(gòu)域，核定位信號(NLS)，出口基序(NES)，LC3相互作用區(qū)(LIR)，KEAP1互動區(qū)(KIR)，和一個C-末端的泛素相關(guān)區(qū)域(UBA)。P62的多個結(jié)構(gòu)域的功能均與自噬密切相關(guān)[16]。多項證據(jù)表明，自噬障礙導(dǎo)致p62的積累，從而促進腫瘤的發(fā)生[17～19]。p62可作為一個標記蛋白來檢測自噬[15]。

Beclin1是自噬機制中的核心蛋白。Beclin1被確定為一個與Bcl-2抗凋亡家族成員在BH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合的蛋白。正常條件下的穩(wěn)態(tài)，Beclin1與不同的Bcl-2家族成員結(jié)合，而其從Bcl-2的解離會介導(dǎo)自噬。Beclin1與自噬活化劑相互作用，通過促進PI(3)K、VPS34 的活化和自噬體的形成來調(diào)控自噬[16]。檢測BECN1 現(xiàn)已經(jīng)被許多人做為監(jiān)控自噬的方式[13]。

眾多研究已經(jīng)確認，在腫瘤細胞暴露于抗癌藥物后，腫瘤細胞的自噬機制被激活[5]。而這一點也在我們的研究中得以印證。在我們成功培養(yǎng)的A549-PEM、H1299-PEM中，LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)換增加,Beclin-1蛋白的表達增加，p62蛋白的表達減少，這樣的結(jié)果充分說明培美曲塞激活了肺癌細胞的自噬機制，使得細胞自噬活動增加。但是這種自噬增加是否是導(dǎo)致肺癌細胞耐藥的原因尚不明確，我們進行了進一步實驗。我們用CQ抑制了自噬，發(fā)現(xiàn)抑制自噬大大提高了培美曲塞對A549-PEM、H1299-PEM的抑制能力，即抑制自噬提高了A549-PEM、H1299-PEM對培美曲塞的敏感性。這表明自噬是導(dǎo)致肺腺癌細胞對培美曲塞耐藥的原因之一。但是，很顯然，還存在其它的導(dǎo)致耐藥的原因，這也是我們未來的研究方向。我們希望通過對肺腺癌細胞耐藥的研究，找到新的治療肺腺癌的靶點。

綜上，培美曲塞可以激活肺腺癌細胞的自噬機制，耐培美曲塞肺腺癌細胞自噬增強，抑制自噬提高耐培美曲塞肺腺癌細胞對培美曲塞的敏感性，自噬的激活是肺腺癌細胞對培美曲塞耐藥的原因之一，自噬介導(dǎo)的耐藥機制是否是導(dǎo)致肺腺癌細胞對培美曲塞耐藥的核心機制尚待研究探索。

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Activation of autophagy caused the pemetrexed resistance in lung adenocarcinoma cells

CAIFang-yu,ZOUZhi-tian,ZHUXiao-feng

(Department of Cardio-Vascular,The First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003，hina)

Objective:To study the role of autophagy in pemetrexed-resistant lung adenocarcinoma cells. Methods:Detect the proliferation of Pemetrexed-resistant H1299 cells and A549 cells with MTT assay. After inhibiting autophagy with CQ, we observed the subtle effects of Pemetrexed on drug-resistant cells. Western blot was used to test the autophagy-related proteins. Results:We obtained cultured lung adenocarcinoma cell strain with drug resistance successfully. In Pemetrexed-resistant lung adenocarcinoma cell strain, the conversion of LC3 (LC3-I to LC3-II) increased, the expression of Beclin-1 increased, the expression of p62 decreased. And we found that the autophagy inhibitor CQ improved the inhibitory effect of pemetrexed on drug-resistant cells.Conclusion:Autophagy is activated in Pemetrexed-resistant lung adenocarcinoma cells. The resistance to autophagy improved the inhibitory effect of pemetrexed on drug-resistant cells. The activation of autophagy is one of the causes which lead to pemetrexed resistance in lung adenocarcinoma cells.

lung adenocarcinoma; pemetrexed; drug-resistant; autophagy

蔡方雨(1990～)男，黑龍江哈爾濱人，在讀碩士研究生。

鄒志田(1962～)男，黑龍江佳木斯人，博士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail: zxf700105@sina.com。

R734.2

A

1008-0104(2017)02-0079-03

2016-10-16)