齊文千,牛文斌

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科,黑龍江 佳木斯 154003)

PCDH8基因啟動(dòng)子在前列腺癌組織及細(xì)胞中的甲基化測(cè)定及其臨床意義①

齊文千,牛文斌

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科,黑龍江 佳木斯 154003)

目的：檢測(cè)PCDH8基因啟動(dòng)子在前列腺癌細(xì)胞PC3、DU145、LNCap及組織中的甲基化狀態(tài)，并探討其臨床意義。方法：應(yīng)用甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(MSP)檢測(cè)42例前列腺癌組織，35例前列腺增生組織，前列腺癌細(xì)胞PC3、DU145、LNCap，人正常前列腺細(xì)胞RWPE-1、WPMY-1中PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化情況，并分析臨床資料。結(jié)果：甲基化存在于19例(19/42)前列腺癌患者組織以及全部3株前列腺癌細(xì)胞(3/3)中，而不存在于35例前列腺增生組織及2株正常前列腺細(xì)胞中(0/2)；并且甲基化與較高的Gleason評(píng)分，較高的術(shù)前PSA以及較高的病理分期相關(guān)。結(jié)論：前列腺癌中常出現(xiàn)PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化，且與預(yù)后不良及更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力相關(guān)，有可能成為潛在的生物標(biāo)記物。測(cè)定腫瘤組織中的PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)可以有助于確定需要積極臨床干預(yù)的患者來改善預(yù)后。

前列腺癌；PCDH8；DNA甲基化

前列腺癌是一種常見的實(shí)體惡性腫瘤，在美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家，長(zhǎng)期占據(jù)著男性惡性腫瘤的第一位。目前，我們尚不能完全解釋前列腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，臨床上大部分患者出現(xiàn)癥狀時(shí)已經(jīng)進(jìn)展到了中晚期。現(xiàn)在，在臨床上廣泛使用前列腺特異抗原(PSA)篩查前列腺癌，但是PSA也有局限性[1]，其檢查結(jié)果可靠性不高，尚不能對(duì)前列腺癌的危險(xiǎn)程度進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑u(píng)估。因此，我們就需要積極尋找新的具有特異性的標(biāo)志物來幫助早期篩查前列腺癌，并評(píng)估預(yù)后。近些年，國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為表觀遺傳學(xué)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著一定的甚至是至關(guān)重要的作用。表觀遺傳學(xué)是在不改變基因序列的前提下，通過DNA甲基化的改變，染色體重塑，組蛋白修飾等來調(diào)控基因的表達(dá)，貫穿腫瘤發(fā)生發(fā)展的整個(gè)過程[2]。其中研究較深入的是DNA甲基化，它的改變可以增加或者沉默相關(guān)基因的表達(dá)。近來PCDH8作為一種新型的抑癌基因得到關(guān)注，它可以在某些腫瘤發(fā)生啟動(dòng)子的高甲基化使基因表達(dá)減少甚至消失，來參與腫瘤的發(fā)生以及發(fā)展。PCDH8基因是原鈣黏素基因家族中的一員，在介導(dǎo)細(xì)胞黏附，遷移，侵襲等方面都起著作用，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]。其啟動(dòng)子異常高甲基化已經(jīng)被證實(shí)存在于例如腎癌，膀胱癌等多種人類癌癥中，被認(rèn)為與較差的預(yù)后相關(guān)[3～5]，并可能獨(dú)立預(yù)測(cè)前列腺癌患者的無生化復(fù)發(fā)生存時(shí)間[3]。然而，目前較少有關(guān)于前列腺癌組織及細(xì)胞中PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化情況的報(bào)道，本研究以前列腺癌組織及細(xì)胞為研究對(duì)象，檢測(cè)其PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，并分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本收集

收集2015-01～2016-06在佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科行前列腺癌根治術(shù)或經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)的前列腺癌患者和前列腺增生患者的術(shù)后標(biāo)本，均經(jīng)術(shù)后病理診斷證實(shí)。樣品收集之后應(yīng)用液氮快速冷凍，然后儲(chǔ)存在-80℃冰箱中。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

按照常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)程序，人前列腺癌細(xì)胞PC3使用含15%胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)液，置于5%CO2，37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，人前列腺癌細(xì)胞DU145、LNCap培養(yǎng)基含10%胎牛血清，其他條件不變。人正常前列腺細(xì)胞RWPE-1、WPMY-1使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。

1.3DNA提取及亞硫酸鹽修飾

從冰箱中取出收集的樣本，使用組織DNA提取試劑盒，按照說明書上的步驟提取組織DNA。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，使用細(xì)胞DNA提取試劑盒，按照操作步驟進(jìn)行操作提取細(xì)胞DNA。用紫外分光光度儀檢查，DNA濃度合格的標(biāo)本-20℃保存?zhèn)溆谩２捎肊ZDNAMethylation-GoldKit(zymoresearch美國(guó)，貨號(hào)：D5005) 進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾，經(jīng)甲基化修飾后置于-20℃保存。

1.4 甲基化特異性PCR

以亞硫酸鹽修飾后的DNA作為模板，使用已經(jīng)報(bào)道的引物序列[3,4]，由生工生物工程( 上海) 股份有限公司合成引物，具體引物序列見表1。之后分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下：12.5μLZymoTaqPreMix，2ul模板，上下游引物各1μL，ddH20補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)條件：95℃ 5min，1個(gè)周期預(yù)變性；94℃ 30s、退火 60℃ 30s、延伸 72℃ 30s，40個(gè)周期變性；72℃ 5min，1個(gè)周期。取10μLMSP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。甲基化正向存在條帶記為陽性，條帶只在未甲基化DNA出現(xiàn)的樣品記為甲基化陰性[3,4]。

表1 MSP 中PCDH8 基因甲基化引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0處理，用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法進(jìn)行分析。P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

①PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化存在于全部3株人前列腺癌細(xì)胞中，且PC3和DU145甲基化程度略高于LNCap細(xì)胞，而在2株人正常前列腺細(xì)胞中均未發(fā)現(xiàn)存在甲基化(圖1)。②檢出存在PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化的前列腺癌樣本19例(19/42)，前列腺增生組織中均未發(fā)現(xiàn)甲基化的存在，兩者之間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖2)。③分析19例存在PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化與23例未發(fā)現(xiàn)甲基化的前列腺癌病例的臨床資料。發(fā)現(xiàn)Gleason評(píng)分、術(shù)前前列腺特異性抗原(PSA) 和術(shù)后病理分期差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

圖1 細(xì)胞系中的MSP結(jié)果

圖2 前列腺癌組織中PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化具有代表性的MSP結(jié)果。M：甲基化;U：未甲基化。Pca1和Pca2為甲基化，Pca3為非甲基化

表2 42例前列腺癌患者的臨床資料

3 討論

進(jìn)入新世紀(jì)以來，我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率快速增長(zhǎng)?，F(xiàn)有的篩查方法PSA具有一定的局限性，尋找早期篩查前列腺癌，并評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志物就顯得尤為重要。目前，科學(xué)家普遍認(rèn)為除基因突變和染色質(zhì)丟失外，第三種導(dǎo)致抑癌基因失活的機(jī)制是甲基化，有時(shí)甚至是唯一的機(jī)制[6]。DNA甲基化水平的變化，在前列腺癌中被認(rèn)為出現(xiàn)相對(duì)較早，甚至是癌前病變階段，可使用PCR方法檢測(cè)，比較敏感，可能成為理想得生物標(biāo)志物。所以一些基因，在正常組織中無甲基化，若出現(xiàn)異常的甲基化表現(xiàn)，即有腫瘤發(fā)生的可能性。

PCDH8基因位于人類染色體的13q14.3，它含有6細(xì)胞外鈣黏蛋白結(jié)構(gòu)域，一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)區(qū)[3]。國(guó)內(nèi)外尚未有發(fā)現(xiàn)PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化存在于完全正常的組織中的報(bào)道，但是在多種腫瘤組織中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其存在啟動(dòng)子異常高甲基化，進(jìn)而使基因表達(dá)沉默。本研究顯示，PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化較多的出現(xiàn)在前列腺癌組織及細(xì)胞中，而在前列腺增生組織及正常前列腺細(xì)胞中均未檢測(cè)到甲基化。由此可以推斷，PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化不存在于正常前列腺或增生組織中，具有前列腺癌腫瘤特異性。因此我們有理由認(rèn)為：PCDH8 基因啟動(dòng)子甲基化僅發(fā)生于前列腺癌組織中，再次證明了使用PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化早期篩查前列腺癌的可能性。此外，我們比較了42例前列腺癌患者的臨床資料與PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Gleason評(píng)分≥7分，術(shù)前PSA≥10ng/mL以及較高的術(shù)后病理分期與患者PCDH8甲基化顯著相關(guān)，說明存在PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化的患者，其危險(xiǎn)等級(jí)相對(duì)更高，可能和患者的預(yù)后不良有關(guān)。這有助于我們篩選出患者，并給予更加積極的術(shù)后治療以及隨訪。但由于實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短，對(duì)所研究患者的長(zhǎng)期隨訪不足，我們尚無法明確PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化與前列腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。

人前列腺癌細(xì)胞LNCap、DU145和PC3是常見的三種前列腺癌細(xì)胞系，其中實(shí)驗(yàn)中常認(rèn)為L(zhǎng)NCap具有前列腺癌早期特征，是早期雄激素依賴性前列腺癌，轉(zhuǎn)移潛能相對(duì)較弱；而PC3和DU145具有雄激素非依賴性，其中PC3具有中等強(qiáng)度的轉(zhuǎn)移潛能，而DU145則具有強(qiáng)大的轉(zhuǎn)移潛能[7]。本實(shí)驗(yàn)首次驗(yàn)證了這三種前列腺癌細(xì)胞系中PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，甲基化存在于全部三種細(xì)胞中，并且PC3和DU145的甲基化水平高于LNCap。因此，我們有理由推測(cè)較高的PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化程度意味著較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力，這與認(rèn)為其介導(dǎo)細(xì)胞黏附侵襲等作用的觀點(diǎn)相一致。而轉(zhuǎn)移是臨床上實(shí)體腫瘤患者主要的死亡原因，所以更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力意味著需要更加積極的術(shù)后治療以及隨訪，這也與我們前面提到的結(jié)論相一致。

本實(shí)驗(yàn)患者數(shù)少，并且缺乏長(zhǎng)期的術(shù)后隨訪，使我們很難得出患者預(yù)后與PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化水平的相關(guān)性，這些都將繼續(xù)完善。此外，已有在血液樣本中檢測(cè)PCDH10基因啟動(dòng)子甲基化情況的相關(guān)報(bào)道[8]。我們也將嘗試在血、尿等患者體液中檢測(cè)PCDH8基因的啟動(dòng)子甲基化情況，為前列腺癌的早期篩查提供新的依據(jù)。

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2016年佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目，編號(hào)：YM2016_038。

齊文千(1990～)男，河北黃驊人，在讀碩士研究生。

牛文斌(1972～)男，黑龍江佳木斯人，博士，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:niuwenbin@sina.com。

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1008-0104(2017)02-0052-02

2016-11-18)