張騰騰，辛 華， 黃作義 ，鄒春穎 ，張淑萍

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科，黑龍江 佳木斯 154003)

培哚普利對APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠認知功能的改善及腦中NOS的影響①

張騰騰，辛 華， 黃作義 ，鄒春穎 ，張淑萍

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：觀察培哚普利對APPswe/PS1dE9癡呆模型小鼠認知功能的改善及腦中一氧化氮合酶(NOS)的影響。方法：將30只健康A(chǔ)PPswe/PS1dE9 4月齡雙轉(zhuǎn)基因雄性小鼠隨機分為3組：即模型組(AD組)、培哚普利治療組、石杉堿甲治療組。另外選擇10只健康4月齡野生雄性小鼠作為正常組。灌藥4個月以后，觀察小鼠一般狀態(tài)，Morris 水迷宮觀察小鼠行為學，化試劑盒檢測小鼠海馬中iNOS和nNOS含量。結(jié)果：與石杉堿甲治療組相比，培哚普利治療組能夠明顯改善APPswe/PS1dE9癡呆小鼠的認知功能，并且能夠降低小鼠海馬組織中iNOS、nNOS的含量。結(jié)論：培哚普利能夠明顯提高APPswe/PS1dE9癡呆小鼠的認知能力，同時降低小鼠海馬組織中iNOS及nNOS的含量。

阿爾茲海默病(AD)；培哚普利；一氧化氮合酶

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)[1]是發(fā)生于老年和老年前期、以進行性認知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。臨床上表現(xiàn)為記憶障礙、失語、失用、失認、視空間能力損害、抽象思維和計算力損害、人格和行為改變等。培哚普利是ACEI類藥物中的一種，除傳統(tǒng)的血壓調(diào)節(jié)、水鹽代謝、垂體激素分泌等生理功能外，對于神經(jīng)可塑性和學習記憶等認知功能也有重要作用[2，3]，目前許多國內(nèi)外學者研究表明其可以通過血腦屏障產(chǎn)生中樞性作用[4]，本研究著重分析培哚普利對老年癡呆小鼠認知功能的改善及對小鼠海馬區(qū)NOS(iNOS、nNOS)水平的影響，為以后老年癡呆的預防及治療提供新道路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取4月齡APPswe/PS1dE9癡呆小鼠30只及4月齡野生雄性小鼠10只。APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠購自中國醫(yī)學科學院神經(jīng)科學研究所(該品系引種于美國JACKSON實驗室)，4月齡野生雄性小鼠由佳木斯大學動物中心提供，飼養(yǎng)于佳木斯大學生命科學實驗中心。全程小鼠自由攝食、飲水。動物飼養(yǎng)及所有實驗操作均嚴格遵守佳木斯大學生命科學實驗中心實驗動物倫理委員會的相關(guān)規(guī)定進行。

1.2 藥品試劑與儀器

培哚普利片購自武漢能仁醫(yī)藥化工有限公司，石杉堿甲片購自上海復旦復華科技有限公司，iNOS、nNOS試劑盒購自上海滬震生物有限公司，標準型腦立體定向儀購自深圳市瑞沃德(RWD)生命科技有限公司。

1.3 動物分組及模型

將30只4月齡APPswe/PS1dE9癡呆小鼠隨機分為模型組、培哚普利組(1mg/kg·d)、石杉堿甲組(0.3mg /kg·d)[5]，另選擇同等數(shù)量的健康野生4月齡雄性小鼠作為正常組。模型組及正常組給予等體積生理鹽水灌胃。每日灌藥 1次,連續(xù) 4個月。

1.4 小鼠空間學習記憶能力測試

各組小鼠在末次給藥后次日進行 Morris 水迷宮探求小鼠的學習和記憶能力。恒溫游泳池直徑110cm，高50cm，深30cm，池壁周圍涂上黑漆，將池壁分為四個象限，選取任意象限，在該象限放一直徑8cm，高20cm的白色小鼠站臺，測試前使水溫保持25℃，水內(nèi)放入牛奶混勻。將小鼠分別從4個不同象限面壁入水，記錄小鼠在60s內(nèi)尋找平臺所需的時間(逃避潛伏期)。若時間超過60s，則指導動物到平臺并停留10s，此時潛伏期記為60s。以4個不同象限的平均值作為該次的逃避潛伏期，記錄小鼠的空間學習能力。測試歷時5d，每天訓練一次。同理移去原平臺進行空間探索實驗，記錄小穿越原平臺位置的次數(shù)及在原平臺所在象限的停留時間，記錄小鼠對原平臺的空間記憶情況。

1.5 腦組織NOS含量測定

Morris水迷宮測試后采用頸椎脫臼法處死小鼠，將其放置在標準型腦立體定位儀上，仔細分離出海馬,依據(jù)試劑盒要求處理小鼠海馬組織，測定其中iNOS和nNOS含量。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 培哚普利對癡呆小鼠學習記憶的影響

見表1～2。

表1 各組小鼠逃避潛伏期的比較±s)

注：與正常組相比，**P<0.05，*P<0.05;與模型組相比，△△P<0. 01，△P<0.05。

從表1可知，與正常組比較，模型組各個時間點小鼠的逃避潛伏期的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.1)，并且隨著時間的延長，各個組的潛伏期不斷縮短，表明模型組小鼠學習記憶出現(xiàn)障礙。各治療組與模型組比較，潛伏期均縮短，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。說明培哚普利組與石杉堿甲組均能使小鼠逃避潛伏期縮短，但二者效果相當，沒有明顯差別。

表2 各組小鼠原平臺穿越次數(shù)和象限停留 時間比較

注：與正常組相比，＊＊P<0.01，*P<0. 05;與模型組相比，△△P<0.01，△P<0.05。

由表2可知，與正常對照組比較，模型組原平臺象限停留時間及穿越次數(shù)明顯減小，并且呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.01)，表明雙轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠學習記憶能力明顯減退，表現(xiàn)為一定的癡呆癥狀。與模型組相比，石杉堿甲組與培哚普利組均有統(tǒng)計學意義，但培哚普利組小鼠原平臺象限停留時間明顯延長，原平臺穿越次數(shù)顯著增多，即培哚普利組效果更顯著(P<0.01)。

2.2 培哚普利對癡呆小鼠大腦海馬內(nèi)iNOS及nNOS的影響

見表3。

表3 各組小鼠大腦海馬內(nèi)iNOS及nNOS的含量

注： 與正常組相比，＊＊P<0.01，*P<0.05;與模型組相比，△△P<0.01，△P<0.05。

從表3可知，模型組與正常組比較腦組織iNOS和nNOS含量均顯著增加，說明癡呆小鼠腦組織中iNOS和nNOS表達水平升高，從而造成神經(jīng)細胞死亡。與模型組相比，兩治療組中iNOS和nNOS含量均降低，但培哚普利組更明顯(P<0.01)，說明兩組藥均能減輕iNOS和nNOS對大腦的損害，但培哚普利效果更好。

3 討論

腎素—血管緊張素系統(tǒng)(renin-aangiotensin-system,RAS)對人體的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)有重要作用。腎素在血管緊張素原的作用下生成血管緊張素I(AngI)，AngI在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的作用下，生成血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)。AngⅡ有兩個受體: 血管緊張素受體1(AT1R) 和血管緊張素受體2(AT2R) 。AngⅡ主要作用于AT1R，可以導致血管收縮和內(nèi)皮功能紊亂[6]，并產(chǎn)生氧化應激而損害腦血管功能[7]。ACEI類藥物主要抑制ACE，使AngⅡ的合成減少，從而減輕其對腦組織和神經(jīng)元的破壞。有資料表明[8]，能作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的血ACEI類藥物如卡托普利、福辛普利、賴諾普利、培哚普利、雷米普利等能通過血腦屏障，有效防止癡呆, 控制并減少氧化應激, 減輕腦組織炎癥。本文通過Morris水迷宮實驗，記錄小鼠逃避潛伏期、小鼠空間探索試驗的原平臺穿越次數(shù)、象限停留時間。證實，在使用中樞性ACEI類藥物培哚普利后，小鼠的學習記憶能力明顯得到改善。

一氧化氮(nitricoxide,NO)是體內(nèi)重要的信使分子，在體內(nèi)由L- 精氨酸在一氧化氮合成酶(nitricoxidesynthase，NOS)的催化作用下生成。NOS有三種亞型[9]:即神經(jīng)元型一氧化氮合成酶(nNOS)、誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)[10]。其中，nNOS和eNOS在生理條件下可正常表達，而iNOS在生理條件下不表達，只在病理條件下誘導表達,激活后會長時間大量合成NO。由于NO性質(zhì)不穩(wěn)定，實驗條件下能檢測到極少的含量，而NO的多少與NOS的活性呈正相關(guān)，固本實驗對iNOS、nNOS的含量進行了檢測，從而間接說明NO對小鼠認知功能的影響。

本實驗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠大腦中iNOS和nNOS均明顯升高，表明炎癥性刺激使iNOS和nNOS過度表達，使體內(nèi)生成的NO增多，產(chǎn)生神經(jīng)毒性；對其一般行為學觀察發(fā)現(xiàn)，小鼠喜蜷臥，實驗人員敲擊鼠柵欄不予理睬，對氣味及食物反應遲鈍，并且在Morris水迷宮試驗中表現(xiàn)出逃避潛伏期顯著延長，原平臺穿越次數(shù)和原平臺象限停留時間顯著縮短。猜測其機制可能為nNOS及iNOS激活產(chǎn)生的NO，激活凋亡級聯(lián)反應通向細胞死亡的最后共同通路,誘導細胞凋亡，導致血管收縮，內(nèi)皮細胞紊亂，從而使小鼠學習記憶功能出現(xiàn)障礙。而在使用培哚普利進行干預后，發(fā)現(xiàn)小鼠反應變得敏捷，一有聲音即睜眼, 跑到柵欄張望, 在聞到食物香味時， 鼻腔作嗅物狀。水迷宮實驗結(jié)果也出現(xiàn)巨大反差，即小鼠平臺逃避潛伏期縮短，原平臺穿越次數(shù)和平臺象限停留時間增多；同時發(fā)現(xiàn)癡呆小鼠腦中iNOS和nNOS含量均顯著降低，推斷培哚普利能通過小鼠的血腦屏障，抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的作用，使血管緊張素Ⅱ生成減少，使其對AT1R受體的作用減弱，增加腦血流灌注，有對抗氧化應激，保護腦血管功能，有利于神經(jīng)細胞分化、再生和存活，誘導神經(jīng)元分化以及軸突生長，有利于損傷神經(jīng)的功能修復，從而改善認知功能。

綜上所述，培哚普利對APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠有顯著的防治效果，能夠抑制iNOS和nNOS的合成，從而降低腦組織NO的產(chǎn)生，提高小鼠學習認識能力，從而為今后老年癡呆的預防提供新的思路。

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黑龍江省自然科學基金項目，編號：C2012-42。

張騰騰(1988～)女，黑龍江齊齊哈爾人，在讀碩士研究生。

張淑萍(1969～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，碩士研究生導師。E -mail:blcldxn@163.com。

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1008-0104(2017)02-0025-02

2017-01-05)