王國輝，陸曉紅，白 禹，楊曉玉，陰育紅，金 鑫

(1. 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003；2. 佳木斯市中心醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

電壓依賴性鉀通道在Aβ1-40誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)干細(xì)胞凋亡中的作用①

王國輝1，陸曉紅1，白 禹1，楊曉玉1，陰育紅2，金 鑫2

(1. 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003；2. 佳木斯市中心醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

目的：探討在Aβ1-40誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)干細(xì)胞凋亡過程中電壓依賴性鉀通道的作用。方法：應(yīng)用膜片鉗技術(shù)觀察Aβ1-40(5μM)慢性孵育12h、24h和48h對海馬神經(jīng)干細(xì)胞延遲整流鉀電流(IK)和瞬時(shí)外向鉀電流(IA)的影響；在Aβ1-40(5μM)孵育前30min加入鉀通道阻斷劑TEA(5mM)共同孵育12h、24h和48h，應(yīng)用Hoehest33342染色和MTT法檢測TEA與Aβ1-40聯(lián)合作用后對神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果：在不同時(shí)間點(diǎn)Aβ1-40均可增加IK，12h最顯著(P<0.01)，但I(xiàn)A并未發(fā)生明顯改變；Aβ1-40引起的IK增加與TEA密切相關(guān)，表現(xiàn)為給予TEA后Aβ1-40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞死亡明顯減輕。結(jié)論：Aβ1-40激活延遲整流鉀通道后促進(jìn)海馬神經(jīng)干細(xì)胞凋亡。

Aβ1-40；鉀通道；凋亡

阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)又叫老年性癡呆，是一種嚴(yán)重的退行性腦病，其主要特征表現(xiàn)為β-淀粉樣多肽(Aβ)的大量沉積和神經(jīng)元的大量丟失[1,2]。其中，Aβ聚集被認(rèn)為是AD病理機(jī)制的核心問題。許多研究均已證實(shí)，由Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷主要為細(xì)胞凋亡，如自由基的產(chǎn)生、鈣離子平衡紊亂、微管結(jié)合能力喪失等。此外，近年有大量研究表明，許多凋亡刺激因素可引起細(xì)胞內(nèi)鉀離子平衡失調(diào)，表現(xiàn)為細(xì)胞外鉀離子濃度過度升高[3～5]，從而促進(jìn)凋亡的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)以Aβ1-40和TEA為施加因素，觀察電壓依賴性鉀通道在Aβ1-40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡中的作用，為探討AD的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康Sprague-Dawley(SD)大鼠(<72h)，雌雄均可，購于佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)藥品

Aβ1-40購于Biosouxee公司，MTT、Hoechst

-33342、TEA購于Sigma公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法1.3.1 全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)

在倒置顯微鏡下選擇邊緣整齊、胞內(nèi)無明顯顆粒的細(xì)胞進(jìn)行封接，通過負(fù)壓抽吸形成高阻封接后再Zap破膜形成全細(xì)胞記錄。采用Multiclamp700B型膜片鉗放大器記錄電流，經(jīng)濾波及數(shù)字化處理后，應(yīng)用pclampsoftwaysystem10.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.2MTT法

在神經(jīng)干細(xì)胞中加入20μL的MTT溶液(5mg/mL)，置37℃培養(yǎng)4h，吸去培養(yǎng)液后加入150μL二甲基亞砜(DMSO)，低速振蕩10min，酶標(biāo)儀OD570nm處檢測各孔吸光值。

1.3.3Hoechst33342法

在細(xì)胞中加入4%多聚甲醛，與培養(yǎng)液以1：3混合，固定細(xì)胞10min。去除固定液，在各組細(xì)胞中加入Hoechst33342，37℃孵育15min。吸除染色液并洗滌后，直接在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1Aβ1-40慢性孵育對海馬神經(jīng)干細(xì)胞IK和IA的影響

Aβ1-40(5μM)慢性孵育12h、24h和48h后，應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察Aβ1-40對海馬神經(jīng)干細(xì)胞IK和IA的影響。結(jié)果顯示，Aβ1-40呈時(shí)間依賴性的增加IK，即隨著時(shí)間的增加，IK逐漸增加，12h達(dá)峰值(n=7，P<0.01)，見圖1。但I(xiàn)A并未發(fā)生明顯改變(n=7，P>0.05)，見圖2。

圖1 Aβ1-40對海馬神經(jīng)干細(xì)胞IK的影響

圖2 Aβ1-40對海馬神經(jīng)干細(xì)胞IA的影響

2.2TEA與Aβ1-40聯(lián)合作用對海馬神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的影響

在Aβ1-40(5μM)孵育前30min加入TEA(5mM)，與Aβ1-40共同孵育12h、24h和48h，應(yīng)用MTT法觀察其對海馬神經(jīng)干細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果顯示，TEA可明顯減輕Aβ1-40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞死亡，使細(xì)胞存活率明顯升高(P<0.01),見圖3。

圖3 TEA與Aβ1-40聯(lián)合作用對海馬神經(jīng)干細(xì)胞存活率的影響

(與對照組相比#P<0.01；與Aβ1-40組相比*P<0.01)

在Aβ1-40(5μM)孵育前30min加入TEA(5mM)，與Aβ1-40共同孵育48h，應(yīng)用Hoehest33342染色觀察其對海馬神經(jīng)干細(xì)胞凋亡發(fā)生率的影響。結(jié)果顯示，TEA可明顯降低Aβ1-40所引起的細(xì)胞凋亡發(fā)生率，由(19.3±0.6)%降至(10.1±0.4)%(P<0.01)。

3 討論

AD是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要病理特征為新皮層、海馬出現(xiàn)高度老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)和大量神經(jīng)元的丟失等[6,7]。Aβ是構(gòu)成老年斑的重要成分，由39～43個(gè)氨基酸組成。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，Aβ的毒性作用可通過擾亂細(xì)胞內(nèi)鉀離子的平衡而發(fā)揮作用[8]，然而，鉀離子功能紊亂所致的神經(jīng)毒性與AD的發(fā)病機(jī)制之間所存在的關(guān)系還不十分清晰。因此，有必要做進(jìn)一步研究，為明確鉀通道的病理生理作用及Aβ的毒性作用機(jī)制提供依

據(jù)。本實(shí)驗(yàn)以Aβ1-40和TEA為施加因素，觀察了TEA在Aβ1-40所誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)干細(xì)胞凋亡中的作用，結(jié)果顯示，Aβ1-40可明顯增加延遲整流鉀通道的活性，使得IK明顯增加，但I(xiàn)A并未發(fā)生明顯改變；同時(shí)，Aβ1-40引起的IK增加與TEA密切相關(guān)，表現(xiàn)為給予TEA后Aβ1-40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞死亡明顯減輕。這些結(jié)果都表明，延遲整流鉀通道的激活參與了Aβ1-40誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)干細(xì)胞凋亡過程，即，Aβ1-40首先激活延遲整流鉀通道，引起K+的大量外流，進(jìn)而引起海馬神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡。然而，在Aβ1-40誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中有哪些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)尚不十分清楚，因此，在今后的實(shí)驗(yàn)中可進(jìn)一步研究，以更加明確Aβ1-40誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程的機(jī)制。

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Effect of voltage-dependent potassium channels on the hippocampal neural stem cells apoptosis inducing by the Aβ1-40

WANGGuo-hui1,LUXiao-hong1,BAIYu1,YANGXiao-yu1,YINYu-hong2,JINXin2

(1.The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003，China;2.Jiamusi Central Hospital, Jiamusi 154002,China)

Objective:To investigate the effect of voltage-dependent potassium channels on the hippocampal neural stem cells apoptosis inducing by the Aβ1-40.Methods:Hippocampal neural stem cells were chronic incubated at different time point with Aβ1-40to observe the change of delayed rectifier potassium current and transient outward potassium current by the patch clamp technique. And 30 minutes before incubation, the potassium channel blocker (TEA) was added together with Aβ1-40incubated at different time point and to observe the survival and apoptosis rate of the neural stem cells by the MTT method and Hoehest33342 staining.Results:The Aβ1-40can gradually increase the IK with increasing time and reaching the spike at the 12 hour, while the IA has not obvious change. The TEA can obviously reduce the neural stem cells death by the Aβ1-40induced.Conclusion:The delayed rectifier potassium channels participate in the apoptosis process of hippocampal neural stem cells by the Aβ1-40induced.

Aβ1-40; potassium channel; apoptosis

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目資助項(xiàng)目，編號：12521569。

王國輝(1971～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，副主任醫(yī)師。

Q

A

1008-0104(2017)02-0011-02

2016-10-10)