趙艷玲, 姚婕

(華僑大學(xué) 化工學(xué)院， 福建 廈門 361021)

巨尾桉銅分子伴侶EuCCS基因的克隆及表達(dá)分析

趙艷玲, 姚婕

(華僑大學(xué) 化工學(xué)院， 福建 廈門 361021)

以巨尾桉為研究對象，克隆得到巨尾桉銅分子伴侶(CCS)基因(GenBank注冊號為KJ755351.1)，生物信息學(xué)分析表明:EuCCS蛋白定位于葉綠體，與龍眼同源基因的一致性達(dá)到99%.巨尾桉CCS的原核表達(dá)載體pET-EuCCS在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)可以穩(wěn)定表達(dá)，超氧化物歧化酶(SOD)活檢測結(jié)果表明:轉(zhuǎn)化菌株的SOD酶活性比對照菌株高，說明外源基因EuCCS具有生物學(xué)活性.利用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)分析CCS在巨尾桉中的表達(dá)特性，結(jié)果表明：在植株生長旺盛的部位,CCS表達(dá)量較大，如植株幼葉，隨植株葉片慢慢衰老，CCS的表達(dá)量也隨之下降；在組培苗中，葉片的CCS表達(dá)量最大，其次是莖.

巨尾桉; 銅分子伴侶; 克隆; 原核表達(dá); 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

銅離子是細(xì)胞色素氧化酶、銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutase，Cu/ZnSOD)、漆酶、賴氨酰氧化酶和多巴胺單加氧酶等所必需的輔助因子，在維持植物正常的新陳代謝及生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[1].當(dāng)銅離子超過一定值時，銅離子參與Fenton反應(yīng)會生成大量的羥自由基，對生物體產(chǎn)生重金屬毒害作用，所以在長期進(jìn)化過程中，生物體內(nèi)形成一套完整的銅代謝調(diào)控機(jī)制，分子伴侶和銅螯合劑調(diào)控細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外銅的轉(zhuǎn)運，達(dá)到生物體內(nèi)銅離子的穩(wěn)態(tài)[2].銅分子伴侶(CCS)可以傳遞銅離子到Cu/ZnSOD中,并將其激活生成有活性的酶分子[3-7].相關(guān)研究表明:CCS在調(diào)控植物體內(nèi)銅離子平衡過程中發(fā)揮著特殊作用[8-9].本文克隆了巨尾桉的CCS基因，通過初步構(gòu)建該基因原核表達(dá)體系，測定該酶的活性，并通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative PCR)技術(shù)分析巨尾桉中CCS的表達(dá)特性，研究了該基因的基本功能特點.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與植物材料 pET-32a(+)，E.coliJM109，BL21(DE3),巨尾桉植株為本實驗室保存.

1.1.2 試劑 Takara SYBR ExScript等試劑盒和試劑采購自大連Takara公司；引物由廈門精聚公司合成.

1.2 實驗方法

1.2.1 巨尾桉EuCCS基因的克隆方法 具體克隆方法參見文獻(xiàn)[10].PCR引物為CCS1：5′-CATGGCATTTCTGAGGTCGG-3′，CCS2：5′-CTCAGACTTTGCTGGTGAC-3′.CCS目的片段與pMD-18T Vector連接，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)驗證陽性克隆子，命名為pMD-EuCCS，委托華大基因測序.

1.2.2 構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-EuCCS并誘導(dǎo)表達(dá) 設(shè)計引物CSS3:5′CGGATCCATGGCATTTCTGAGGT 3′，CSS4:5′CGAGCTCTCA GACTTTGCTGGTG 3′，獲得亞克隆載體pMD-CCS1，用BamHⅠ 和SacⅠ 雙酶切連接pET-32a(+).用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的SDS-PAGE蛋白電泳分析融合基因在大腸桿菌Bl21中的表達(dá)，具體方法參見文獻(xiàn)[10].

1.2.3 IPTG誘導(dǎo)CCS蛋白原核表達(dá)條件與SOD酶活性測定 設(shè)計兩組實驗，一是加入終濃度分別為0,0.5,1.0,1.5,2.0 mmol·L-1的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，誘導(dǎo)4 h后，SDS-PAGE電泳分析;二是設(shè)置16,22,37 ℃搖床中異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)4 h的SDS-PAGE電泳分析.采用氮藍(lán)四唑(NBT)檢測超氧化物歧化酶(SOD)蛋白酶活，具體方法參見文獻(xiàn)[10].

1.2.4 RT-PCR 和qPCR檢測CCS在巨尾桉不同部位的表達(dá)量 巨尾桉葉片及組培苗總核糖核酸(RNA)提取，使用Takara公司的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser去除基因組DNA，Takara公司的PrimeScript Ⅱ反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，利用RT-PCR檢測CCS在桉樹中的表達(dá)情況.利用Takara SYBR ExScript 試劑和羅氏LightCycler 480儀器，以桉樹6個樣本的cDNA為模板，內(nèi)參基因為巨尾桉18S rRNA(171 bp)，引物設(shè)計分別為EgCCS1：5′TCATCAAGTCTTGCCTGAGC 3′，EgCCS2：5′GCTCAAGTCCACCTC AACAT 3′，Eg18S1：5′CGCGCTACACTGATGTATTC 3′，Eg18S2：5′GTACAAAGGGCAGGG ACGTA 3′.預(yù)變性：95 ℃，30 s;變性：95，℃，5 s;退火：60 ℃，20 s，40個循環(huán)，最后延伸，65 ℃，15 s，分析實時定量PCR(qPCR)數(shù)據(jù)，每個反應(yīng)包括3個重復(fù).

圖1 RT-PCR擴(kuò)增巨尾桉CCS基因Fig.1 Amplification products of eucalyptusCCS cDNA sequence

2 研究結(jié)果

2.1 巨尾桉CCS基因的克隆

純化采用Trizol法大量提取巨尾桉總RNA獲得信使RNA(mRNA)后，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到非單一條帶，如圖1所示.圖1中：M為DNA Marker;1～3為cDNA 序列擴(kuò)增條帶.選擇預(yù)測的960 bp左右的條帶為目標(biāo)條帶切膠回收，克隆得到CCS基因(GenBank注冊號為KJ755351.1).

生物信息學(xué)分析(數(shù)據(jù)未列出)的結(jié)果表明:CCS蛋白是定位在葉綠體中的親水的、穩(wěn)定的酸性蛋白質(zhì)，該蛋白含2個跨膜螺旋，從N末端朝外由內(nèi)到外進(jìn)行跨膜.該蛋白主要由59.6%的無規(guī)則卷曲，29.5%的β-折疊和11.0%的α-螺旋等構(gòu)成，并存在多個磷酸化位點和保守結(jié)構(gòu)域，這些保守結(jié)構(gòu)域的存在可能是激活SOD表達(dá)所必須的.采用MEGA 5.2對來自11種不同物種的CCS核酸序列作進(jìn)化樹分析(數(shù)據(jù)未列出)，巨尾桉CCS與龍眼、葡萄、蓖麻處于同一分支中，與它們在進(jìn)化距離上較為接近，同源性分別為99%，81%，80%.

圖2 pET-EuCCS Sac Ⅰ/BamH Ⅰ雙酶切驗證Fig.2 Gel analysis of plasmid pET-EuCCS double digested by Sac Ⅰ/BamH Ⅰ

2.2 原核表達(dá)載體pET-EuCCS的構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)

亞克隆獲得具有SacⅠ/BamHⅠ酶切位點的pMD-EuCCS與線性載體PET-32a(+)同時雙酶切，凝膠回收之后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliBL21，SacⅠ/BamHⅠ雙酶切篩選陽性質(zhì)粒，命名為pET-EuCCS.

pET-EuCCSSacⅠ/BamHⅠ雙酶切驗證，如圖2所示.圖2中：M為DNA Marker;1～3為pET-EuCCSSacⅠ/BamHⅠ雙酶切條帶.

圖3 重組CCS在E. coli BL21中表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of expression of recombinant pET-EuCCS in E. coli BL21

pET-32a(+)載體的N端部分分子量大約為18 ku，基因完整閱讀框為960 bp，編碼320個氨基酸，理論上可表達(dá)32 ku大小，加上表達(dá)系統(tǒng)的融合蛋白部分，預(yù)期融合蛋白大小是50 ku.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)之后，重組質(zhì)粒表達(dá)一條大約50 ku條帶，如圖3所示.這與預(yù)期的表達(dá)目標(biāo)蛋白一致.圖3中：M為蛋白Marker;1為未誘導(dǎo)的空菌株;2為誘導(dǎo)的空菌株;3為未誘導(dǎo)的含pET-32a(+)的菌株;4為誘導(dǎo)的含pET-32a(+)的轉(zhuǎn)化菌株;5為未誘導(dǎo)的含pET-EuCCS的轉(zhuǎn)化菌株;6為誘導(dǎo)的含pET-EuCCS的轉(zhuǎn)化菌株；箭頭所示為表達(dá)的融合蛋白條帶位置.

2.3 CCS蛋白原核表達(dá)條件的初步研究

在不同濃度IPTG誘導(dǎo)CCS蛋白表達(dá)實驗中，IPTG添加量為0.5 mmol·L-1時，足以誘導(dǎo)CCS蛋白表達(dá)，如圖4所示.圖4中：M為蛋白Marker;1～5分別為0,0.5,1.0,1.5,2.0 mmol·L-1誘導(dǎo)4 h的蛋白表達(dá)；箭頭所示為表達(dá)的融合蛋白條帶.16,22,37 ℃ 的IPTG誘導(dǎo)含pET-EuCCS菌株都能正常表達(dá)出CCS蛋白，如圖5所示.圖5中：M為蛋白 Marker;1為16 ℃ IPTG誘導(dǎo)pET-32a;2為16 ℃ IPTG誘導(dǎo)pET-EuCCS;3為22 ℃ IPTG誘導(dǎo)pET-32a；4為22 ℃ IPTG誘導(dǎo)pET-EuCCS;5為37℃ IPTG pET-32a；6為37 ℃IPTG誘導(dǎo)pET-EuCCS.為了檢測最佳的IPTG誘導(dǎo)時間，對16,22,37 ℃下的IPTG誘導(dǎo)時間進(jìn)行研究.結(jié)果表明：16 ℃誘導(dǎo)下，9 h后，CCS蛋白表達(dá)量趨于穩(wěn)定；22 ℃誘導(dǎo)下，6 h后，CCS蛋白表達(dá)到最大量；37 ℃誘導(dǎo)下，4 h后，CCS蛋白表達(dá)趨于穩(wěn)定(數(shù)據(jù)未列出).

圖4 不同濃度IPTG誘導(dǎo)對EuCCS蛋白表達(dá)的影響 圖5 不同溫度IPTG誘導(dǎo)對CCS蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of IPTG concentration on expression of recombinant EuCCS protein expression Fig.5 Effect of IPTG temperature on expression of CCS protein expression

圖6 不同溫度誘導(dǎo)菌株的SOD酶活檢測Fig.6 SOD enzyme activity detection under different induction temperatures

CCS的酶活性無法直接檢測，可以通過檢測CCS底物Cu/ZnSOD酶活來間接檢測CCS的活性.為了檢測外源基因CCS誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白是否具有生物學(xué)活性，利用氮藍(lán)四唑法檢測不同溫度誘導(dǎo)菌株的SOD酶活，如圖6所示.圖6中：z為酶活；t為溫度.由圖6可知：在16，22 ℃ IPTG誘導(dǎo)下，轉(zhuǎn)化菌株pET-EuCCS的SOD酶活性高于對照菌株pET-32a，說明EuCCS的表達(dá)可以提高大腸桿菌Cu/ZnSOD的活性；在37 ℃誘導(dǎo)下，SOD酶活變化不大，可能是由于表達(dá)蛋白在此溫度下形成包涵體所致，包涵體中的蛋白無酶活性.

2.4 巨尾桉CCS的表達(dá)分析

巨尾桉CCS基因在組培苗根、莖、葉和植株幼葉、中段葉和老葉均有表達(dá)，如圖7所示.由圖7可知：組培苗葉片中的CCS表達(dá)量比根、莖更大，植株中幼葉的CCS表達(dá)量最大，之后是成熟葉和老葉.

(a) 溫室苗的不同齡葉片 (b) 組培苗的不同部位圖7 RT-PCR檢測巨尾桉不同部位的CCS表達(dá)情況Fig.7 RT-PCR detection of CCS expression in eucalyptus

利用實時定量 PCR方法進(jìn)行基因表達(dá)解析，選擇18S RNA作為參比基因來對所有樣品進(jìn)行歸一化處理，再對不同樣品之間的目的基因表達(dá)量進(jìn)行比較.用目的基因CCS的定量結(jié)果除以管家基因18S的定量結(jié)果得到校正值.實時定量PCR分析巨尾桉CCS基因表達(dá)，如圖8所示.由圖8(a)可知：用目的基因CCS校正值作柱狀圖，巨尾桉組培苗葉和莖中的CCS表達(dá)量較高，而根中的表達(dá)量相對較低.由圖8(b)可知：巨尾桉溫室苗幼葉中的CCS表達(dá)量最高，其次是成熟葉，衰老葉片中檢測不到CCS的表達(dá)，可能是由于表達(dá)量太小所致，這個結(jié)果和RT-PCR的結(jié)果基本一致.

(a) 組培苗 (b) 溫室苗圖8 實時定量PCR分析巨尾桉CCS基因表達(dá)Fig.8 Quantitative PCR analysis of CCS relative expression in eucalyptus

3 討論

CCS基因的功能研究的方法主要是原核表達(dá)和真核表達(dá)研究.擬南芥的CCS基因轉(zhuǎn)入酵母表達(dá)體系中發(fā)現(xiàn)，擬南芥CCS可以激活酵母細(xì)胞中Cu/ZnSOD的表達(dá)[11]，大豆的CCS基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，也具有表達(dá)活性[6].文中巨尾桉CCS基因可以穩(wěn)定地在大腸桿菌中表達(dá)，在37,22,16 ℃條件下，1 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)到4,6,12 h，可達(dá)到穩(wěn)定.通過SOD酶活測定 22,16 ℃誘導(dǎo)下，轉(zhuǎn)化菌株酶活比對照組明顯升高，說明該溫度下獲得的EuCCS表達(dá)產(chǎn)物可以提高大腸桿菌的Cu/ZnSOD活性.

研究者已經(jīng)對馬鈴薯、擬南芥等的CCS的表達(dá)特性進(jìn)行了研究.在CCS表達(dá)部位的研究有將馬鈴薯的CCS啟動子區(qū)域融合熒光素酶序列，轉(zhuǎn)基因發(fā)現(xiàn)在馬鈴薯莖塊和匍匐枝中CCS基因表達(dá)量最大，在根部和花部的表達(dá)量最小[4].擬南芥全長CCS基因融合綠色熒光蛋白基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥后熒光蛋白集中在葉綠體內(nèi).這表明克隆得到的擬南芥CCS主要定位于葉綠體內(nèi)[11].利用RT-PCR和qPCR技術(shù)研究巨尾桉的CCS基因發(fā)現(xiàn)，在植株生長旺盛的部位CCS表達(dá)量較大，如植株幼葉，隨植株葉片慢慢衰老，CCS的表達(dá)量也隨之下降；巨尾桉組培苗中葉片中CCS的表達(dá)量最大，其次是莖和根，與該基因可能定位于葉綠體表達(dá)的研究結(jié)果相呼應(yīng).

4 結(jié)束語

CCS與逆境相關(guān)的表達(dá)特性主要體現(xiàn)為：環(huán)境中銅離子過量時，擬南芥莖和根中CCS的表達(dá)量上升，反之則下降[12].馬鈴薯的CCS啟動子區(qū)域包含幾個同源的順式作用因子，其中有3個和植物生長素響應(yīng)有關(guān)，4個和應(yīng)激響應(yīng)有關(guān).CCS可以被植物生長素、赤霉素、果糖、蔗糖、葡糖糖誘導(dǎo)表達(dá)，高濃度的銅離子則抑制表達(dá)[4].植物在衰老狀態(tài)下，CCS的表達(dá)量也會隨之增加[13].CCS是一個與逆境相關(guān)的基因，調(diào)控CCS的表達(dá)可能會提高植物的耐受逆境的能力，下一步的工作是把基因轉(zhuǎn)入到植物中，研究基因的功能和調(diào)控機(jī)理，定向培育高抗植物.

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(責(zé)任編輯： 錢筠 英文審校： 劉源崗)

Cloning and Expression of Copper Chaperone or Superoxide Dismutase Gene inEucalyptusgrandis×E.ophylla

ZHAO Yanling, YAO Jie

(College of Chemical Engineering, Huaqiao University, Xiamen 361021, China)

The major pathway for activation ofCu/ZnSODrequires the CCS copper chaperone to insert copper and activateCu/ZnSODthrough oxidation of an intramolecular disulfide. TheEuCCSgene is cloned by RT-PCR fromEucalyptusgrandis×E.ophylla(GenBank Accession Number: KJ755351.1).Boinformatics analysis suggests that CCS is located in the chloroplast and the evolutionary distance between eucalyptus and longan is quite close with the identity of 99%.The strain prokaryotic expression vector pET-EuCCScan be expressed stably inE.coli, and the superoxide dismutase enzyme activityis higher than control indicating that the clonedEuCCSgene could activateCu/ZnSOD.Besides, the expression characteristics of eucalyptus CCS gene are analyzed by quantitative PCR.And the results show that theEuCCSquantity of the young leaves is relatively higher than that of the old one to greenhouse seedling and for tissue culture seedling theEuCCSis expressed higher in leaves than stem and root. Keywords：Eucalyptusgrandis×E.ophylla; copper chaperone for superoxide dismutase; clone; prokaryotic expression; polymerase chain reaction

2016-05-18

趙艷玲(1978-)，女，助理研究員，博士，主要從事植物分子生物學(xué)的研究.E-mail:zhaoyl@hqu.edu.cn.

國家自然科學(xué)基金資助項目(31300497)

Q 943.2

A

1000-5013(2017)03-0374-05