孫 俊 周 鑫 李青林 蔣淑英 毛罕平 楊 寧

(1.江蘇大學(xué)電氣信息工程學(xué)院， 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 鎮(zhèn)江 212013)

樂果農(nóng)藥對生菜葉片微觀結(jié)構(gòu)的作用機(jī)理研究

孫 俊1,2周 鑫1李青林2蔣淑英1毛罕平2楊 寧1

(1.江蘇大學(xué)電氣信息工程學(xué)院， 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 鎮(zhèn)江 212013)

為了更深入地研究樂果對生菜組織結(jié)構(gòu)的影響，以蓮座期的生菜為實(shí)驗(yàn)對象，利用掃描電鏡和透射電鏡對生菜葉片微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測。研究發(fā)現(xiàn)隨著噴灑農(nóng)藥濃度的增加，生菜葉片微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。氣孔的長寬比和密度降低，葉片的厚度變小，嗜鋨顆粒增加，淀粉顆粒變少。在897～1 332 nm波長范圍內(nèi)，噴灑樂果的生菜光譜反射率與樂果濃度成反比，而在1 703～1 754 nm波長范圍內(nèi)，噴灑樂果的生菜光譜反射率與樂果濃度成正比。此外，噴灑不同濃度的樂果農(nóng)藥，生菜的紋理圖像也存在差異。研究結(jié)果表明，樂果農(nóng)藥對生菜微觀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了較大改變，從而導(dǎo)致生菜葉片光譜圖像信息產(chǎn)生較大變化。對噴灑不同濃度樂果農(nóng)藥的生菜葉片微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究分析，可為高光譜技術(shù)對不同濃度農(nóng)藥殘留的生菜進(jìn)行定量檢測提供機(jī)理研究依據(jù)。

生菜葉片； 農(nóng)藥殘留； 機(jī)理； 微觀結(jié)構(gòu)； 特征提取； 高光譜圖像

引言

生菜富含豐富的維生素、膳食纖維素、礦物質(zhì)元素，具有醫(yī)療保健作用[1]。在生菜生長過程中，主要蟲害有潛葉蠅、白粉虱、蚜蟲、薊馬等，通常選用樂果中等毒殺蟲劑來進(jìn)行防治，樂果的使用提高了生菜的產(chǎn)量，但是農(nóng)藥殘留問題也隨之而來[2-3]。由于農(nóng)藥的不規(guī)范、不科學(xué)使用造成的農(nóng)藥殘留嚴(yán)重威脅著生菜品質(zhì)安全，制約著生菜商品經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。而過量使用農(nóng)藥不僅會(huì)造成農(nóng)藥殘留在生菜上，還會(huì)造成地下水和土壤污染等環(huán)境問題[4]。一些學(xué)者利用光譜技術(shù)對農(nóng)藥殘留檢測進(jìn)行了研究[5-7]，使光譜信息檢測農(nóng)殘成為一種研究思路。

目前，已經(jīng)有部分學(xué)者進(jìn)行了農(nóng)藥殘留對植物葉片微觀結(jié)構(gòu)影響的研究。趙文等[8]利用掃描電鏡和透射電鏡對噴灑不同濃度毒死蜱和霜霉威的2種系列黃瓜的外果皮進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)在未噴灑農(nóng)藥的情況下，2種系列的黃瓜外果皮細(xì)胞具有較大差異。同時(shí)，也有學(xué)者利用掃描電鏡和透射電鏡對生菜進(jìn)行了一些研究。WU[9]利用透射電鏡觀測到電噴霧噴射的納米顆粒進(jìn)入生菜種子后可提高植物種子的萌發(fā)率。SHIM等[10]用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察了致病菌的細(xì)胞膜損傷，并研究評估了γ射線輻照對鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌以及細(xì)胞膜損傷存活的影響。這說明掃描電鏡和透射電鏡可以用于觀測生菜的微觀結(jié)構(gòu)，但目前，尚未存在關(guān)于不同濃度農(nóng)藥對生菜微觀結(jié)構(gòu)的研究報(bào)道。

本文利用掃描電鏡觀察不同濃度樂果處理后的生菜表皮形態(tài)結(jié)構(gòu)細(xì)微變化，根據(jù)電子和物質(zhì)間的相互作用，獲得生菜表面的氣孔密度、氣孔大小和生菜斷面的葉片厚度等信息，并利用透射電鏡觀察生菜細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本的栽培與制備

實(shí)驗(yàn)樣本為江蘇大學(xué)重點(diǎn)Venlo型溫室內(nèi)種植的意大利全年耐抽苔生菜，采用珍珠巖為基質(zhì)的無土栽培方式進(jìn)行生菜培育，確保每株生菜樣本的營養(yǎng)均衡以避免營養(yǎng)元素對生菜微觀結(jié)構(gòu)的影響。待到蓮座期時(shí)，利用塑料薄膜將生菜與土壤隔離開，防止生菜葉片上的農(nóng)藥滴入土壤中并被生菜根系吸收。實(shí)驗(yàn)試劑為南通江山晨樂化工股份有限公司生產(chǎn)的40%樂果乳油，首先配置4個(gè)濃度梯度(樂果農(nóng)藥與丙酮體積比分別為1∶1 400、1∶1 000、1∶500、1∶100)的樂果農(nóng)藥，然后將長勢相近的160株生菜分為4組，對每組生菜充分噴灑同一梯度濃度的樂果。歷時(shí)5 d后(安全間隔期)，摘取大小、形狀、長勢相近的160片成熟生菜葉片，依次編號(hào)并裝入貼有標(biāo)簽的塑料袋密封保存，將采集得到的160片生菜分別裝袋送往實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行樣本高光譜圖像采集[11]。并快速切取2 mm×5 mm葉片和1 mm×2 mm葉片(溫度為25℃左右，相對濕度為65%，光照強(qiáng)度約為1 000 lx，采摘時(shí)刻為14:00)，并分別用4%戊二醛溶液固定，使其完全下沉，利用掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)對生菜葉片微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測。最后，利用化學(xué)定量實(shí)驗(yàn)[12]噴灑4個(gè)農(nóng)藥(樂果，40%乳油)梯度，依次為0.36、1.02、5.10、15.78 mg/kg。其中，國家規(guī)定樂果農(nóng)藥每日允許攝入量0.002 mg/kg，生菜表面樂果農(nóng)藥最大檢測限量為1 mg/kg[13]。

1.2 掃描電鏡和透射電鏡

實(shí)驗(yàn)儀器主要包括HCP-2型臨界點(diǎn)干燥儀、IB-5型離子濺射儀、INCA X-ACT型能譜儀、Quanta 200型掃描電鏡[14](SEM，美國FEI公司)和JEM-1400型透射電子顯微鏡[15](TEM，日本電子株式會(huì)社)。在SEM儀器中，鎢燈絲作為電子槍，加速電壓為0.2～30 kV，放大倍數(shù)為20～300 000倍，分辨率達(dá)到3.5 nm，如圖1所示。在TEM儀器中，加速電壓為0.04～100 kV，放大倍數(shù)為50～1 000 000倍，點(diǎn)分辨率達(dá)到0.38 nm，線分辨率達(dá)到0.2 nm，如圖2所示。

圖1 Quanta 200型掃描電鏡實(shí)物圖Fig.1 Picture of Quanta 200 SEM

圖2 JEM-1400型透射電鏡實(shí)物圖Fig.2 Picture of JEM-1400 TEM

1.3 SEM樣本處理

在掃描電鏡試驗(yàn)前，先對葉片進(jìn)行固定、脫水、斷裂、干燥、投影等處理[16]。樣本固定：將2 mm×5 mm生菜葉片樣本浸入4%戊二醛溶液，固定2 h(4℃)。脫水：先采用5個(gè)體積分?jǐn)?shù)(30%、50%、70%、90%、100%)的乙醇按梯度逐步脫水，隨后采用體積比1∶1 的100%乙醇-乙醚混合液置換20 min，最后采用乙醚置換30 min。斷裂：將脫水處理后生菜葉片樣本放置在液氮環(huán)境中，當(dāng)液氮平靜后，用由液氮冷卻處理的單面刀片撞擊生菜葉片樣本使其斷裂。干燥：在真空環(huán)境中，采用CO2對斷裂后的生菜葉片樣本進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥，使其溫度升至常溫(20℃)。投影：使用導(dǎo)電膠將干燥處理后的生菜葉片斷面向上粘在樣品臺(tái)上，用離子濺射鍍膜儀對樣本進(jìn)行鍍金(15 mA，90 s)。最后，將2 mm×5 mm生菜葉片樣本進(jìn)行掃描電鏡觀察。

1.4 TEM樣本處理

在透射電鏡試驗(yàn)之前，葉片先經(jīng)過洗滌、固定、脫水、浸透、包埋、聚合和超薄切片等處理[17]。固定洗滌：過4 h后，用pH值7.0的磷酸緩沖液沖洗1 mm×2 mm葉片3次，每次約為20 min，然后放入2%鋨酸液中使其完全黑透。脫水、滲透、包埋、聚合：磷酸緩沖液沖洗3次，每次約為20 min，用4個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)(30%、50%、70%、90%)的丙酮按梯度逐步脫水，隨后用100%丙酮脫水2次，每次約30 min，然后用包埋劑逐步浸透、包埋，并在恒溫箱中進(jìn)行37℃—45℃—60℃加溫聚合12 h。超薄切片、染色：用美國RMC型超薄切片機(jī)切取50～70 nm厚度的葉片，采用鈾鉛方法染色，最后放入JEM-1400 TEM型透射電子顯微鏡觀察。

1.5 高光譜圖像的采集與標(biāo)定

利用高光譜圖像系統(tǒng)采集樣本的高光譜圖像，先將生菜葉片樣本放置在一個(gè)長5 cm、寬10 cm的長方形白紙上，對儀器進(jìn)行預(yù)熱使光源達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。其次將裝有生菜樣本的白紙放置在移動(dòng)平臺(tái)上，鹵素?zé)舴旁谒綂A角45°的位置，精密電控平移臺(tái)的平移速度設(shè)置為1.25 mm/s，曝光時(shí)間設(shè)置為20 ms，最終對所有制備的生菜樣本進(jìn)行掃描，通過Spectral Cube軟件采集生菜的高光譜圖像。在采集樣本高光譜圖像前，系統(tǒng)需要黑白板標(biāo)定[18]以消除暗電流等對高光譜圖像的影響。

2 結(jié)果與分析

為了從根本上研究樂果對生菜組織的影響，利用掃描電鏡觀察不同濃度樂果處理后的生菜表皮形態(tài)結(jié)構(gòu)細(xì)微變化，根據(jù)電子和物質(zhì)間的相互作用，獲得生菜表面的氣孔密度、氣孔大小和生菜斷面的葉片厚度等信息。利用透射電鏡觀察生菜細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化。

2.1 生菜表面微觀形態(tài)

生菜表面主要有表皮細(xì)胞和氣孔。生菜表面的樂果需通過氣孔進(jìn)入內(nèi)部細(xì)胞組織，因此對生菜表皮的研究主要針對氣孔進(jìn)行。經(jīng)過農(nóng)藥處理后，生菜葉片的氣孔發(fā)生較大變化。隨著噴灑農(nóng)藥濃度變高，氣孔的長寬比減小，氣孔密度也隨之變小，如圖3所示。因?yàn)樯俗陨泶嬖诒Ｗo(hù)系統(tǒng)，生菜碰觸到高濃度的樂果后會(huì)自動(dòng)開啟防御系統(tǒng)，氣孔會(huì)自動(dòng)慢慢收縮以防止樂果的侵入。盡管如此，部分農(nóng)藥殘留還會(huì)侵入生菜內(nèi)部來破壞內(nèi)部組織，高濃度樂果下的生菜表皮破損較為嚴(yán)重。因此，生菜表面氣孔的長寬比和密度變化直接反映了樂果農(nóng)藥的殘留量。

圖3 不同濃度樂果對生菜葉片表面氣孔特征的影響Fig.3 Effect of pores on lettuce leaves sprayed with different concentrations of dimethoate

2.2 生菜葉肉組織

從生菜葉片樣本的切面分析，生菜葉片切面組織主要包含海綿組織、柵欄組織、上表皮和下表皮。當(dāng)噴灑不同濃度農(nóng)藥樂果時(shí)，生菜葉片切面厚度會(huì)發(fā)生明顯的變化。其中，不同濃度農(nóng)藥樂果殘留下生菜葉片切面的海綿組織、柵欄組織厚度會(huì)出現(xiàn)明顯差異。從總體統(tǒng)計(jì)上看(表1)，隨著噴灑的農(nóng)藥濃度變大，葉片的厚度將越來越薄。在生菜噴灑1∶1 400的農(nóng)藥樂果時(shí)，生菜葉片的厚度為(168.38±8.80)μm，柵欄組織厚度為(117.05±5.68)μm，海綿組織厚度為(32.36±7.56)μm。當(dāng)生菜上噴灑1∶100樂果時(shí)，生菜葉片厚度為(140.96±2.32)μm，柵欄組織厚度為(81.02±5.26)μm，海綿組織厚度為(54.98±3.48)μm。兩者葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度相差較大。

表1 不同濃度樂果下的葉片厚度Tab.1 Thickness of lettuce leaf sprayed with different concentrations of dimethoate μm

2.3 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

生菜內(nèi)部細(xì)胞主要包括葉綠體、嗜鋨顆粒、細(xì)胞壁等，當(dāng)樂果農(nóng)藥通過氣孔進(jìn)入生菜內(nèi)部時(shí)，對生菜細(xì)胞產(chǎn)生較大影響。噴灑不同濃度樂果農(nóng)藥后，生菜葉片葉綠體形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)均未發(fā)生較大變化，表明這些內(nèi)部結(jié)構(gòu)組織對樂果的侵害具有一定的抵抗力。隨著噴灑樂果農(nóng)藥濃度的增加，生菜葉綠體內(nèi)的嗜鋨顆粒變化較為明顯，數(shù)量變多，而淀粉顆粒變少。通過透射電鏡試驗(yàn)觀察可以看出生菜葉片內(nèi)部葉綠體斷層紋路清晰，呈矩形條狀。1∶1 400、1∶1 000樂果配比下，生菜葉片內(nèi)部葉綠體排列緊湊，葉綠體間無縫隙；1∶500樂果配比下，生菜葉片內(nèi)部葉綠體間已經(jīng)開始出現(xiàn)了間隙；1∶1 00樂果配比下，生菜葉片內(nèi)部葉綠體間的間隙較為明顯。不同濃度樂果農(nóng)藥殘留下生菜葉片內(nèi)部組織形態(tài)產(chǎn)生了細(xì)微變化。相關(guān)透鏡試驗(yàn)結(jié)果見文獻(xiàn)[19]。

2.4 生菜光譜和紋理

樂果農(nóng)藥不僅對生菜表皮組織產(chǎn)生影響，而且使得生菜內(nèi)部組織形態(tài)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生細(xì)微變化。高光譜圖像技術(shù)將成像技術(shù)與光譜技術(shù)相結(jié)合，既得到了光譜信息，又得到了圖像信息。通過高光譜圖像的紋理信息和光譜信息直觀地反映出因噴灑不同濃度的農(nóng)藥而造成的差異。紋理差異直接表現(xiàn)在樂果對生菜表面結(jié)構(gòu)的破壞，噴灑農(nóng)藥的濃度不同，生菜農(nóng)藥殘留的光譜會(huì)存在差異，如圖4所示。

圖4 生菜農(nóng)殘?jiān)脊庾V曲線Fig.4 Original spectral curves of pesticide residues on lettuce leaves

生菜中心區(qū)域內(nèi)的250像素×250像素區(qū)域選為感興趣區(qū)域(Region of interest,ROI)，并將計(jì)算得到ROI區(qū)域內(nèi)光譜的平均值作為光譜數(shù)據(jù)。從圖4可以看出，在897～1 332 nm波長范圍內(nèi)，噴灑樂果的生菜光譜反射率與樂果濃度成反比，噴灑的樂果濃度越高，生菜的光譜反射率越低。在1 703～1 754 nm波長范圍內(nèi)，噴灑樂果的生菜光譜反射率與樂果濃度成正比，噴灑的樂果濃度越高，生菜的光譜反射率越高。在1 332～1 703 nm波長范圍內(nèi)，可以明顯看到噴灑濃度較大的生菜光譜反射率低，其他濃度的生菜光譜反射率也存在差異。因此，噴灑的樂果農(nóng)藥與生菜光譜反射率存在一定的相關(guān)性。

本文提取生菜葉片主成分圖像(PC1、PC2圖像)下基于灰度共生矩陣的紋理特征[20](對比度、相關(guān)性、能量、同質(zhì)性)作為圖像信息，本文采用的是Matlab中的graycomatrix函數(shù)，將距離設(shè)為1，方向依次取0°、45°、90°、135°共4個(gè)角度，然后對感興趣區(qū)域中的葉片分別提取對比度、能量、同質(zhì)性、相關(guān)性4個(gè)紋理特征，PC1、PC2下共計(jì)32個(gè)特征下紋理參數(shù)。從圖5可以看出,噴灑不同濃度的樂果農(nóng)藥，生菜的紋理也存在差異。這表明噴灑的樂果與生菜圖像光譜反射率和紋理數(shù)據(jù)之間存在一定的相關(guān)性，因此可以利用高光譜圖像(Hyperspectral image,HSI)技術(shù)定量檢測生菜樂果殘留。

圖5 生菜農(nóng)殘主成分圖像的紋理曲線Fig.5 Texture curves of principal component image of pesticide residues on lettuce leaf

3 結(jié)束語

采用掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)對不同濃度樂果農(nóng)藥殘留下的生菜葉片微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究分析。研究結(jié)果表明隨著噴灑樂果農(nóng)藥濃度的增加，生菜葉片表面氣孔的長寬比和氣孔密度逐漸變小，生菜葉片厚度變薄，生菜葉片內(nèi)部的嗜鋨顆粒增加，淀粉顆粒變少。此外，生菜葉片內(nèi)部細(xì)胞重要組成部分葉綠體間間隙隨著噴灑樂果農(nóng)藥濃度的增加而逐漸變大。其中，葉片細(xì)胞的排列結(jié)構(gòu)方式直接影響近紅外波段的植被反射光譜。噴灑不同濃度樂果農(nóng)藥的生菜葉片近紅外波段的高光譜圖像信息間的差異性進(jìn)一步驗(yàn)證了HSI技術(shù)應(yīng)用于生菜不同濃度農(nóng)藥殘留定量檢測的有效性。為此，對噴灑不同濃度樂果農(nóng)藥的生菜葉片微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究分析，為HSI技術(shù)對生菜不同濃度農(nóng)藥殘留進(jìn)行定量檢測提供了機(jī)理研究依據(jù)。

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Mechanism of Different Concentrations of Dimethoate Residue on Microstructure of Lettuce Leaves

SUN Jun1,2ZHOU Xin1LI Qinglin2JIANG Shuying1MAO Hanping2YANG Ning1
(1.SchoolofElectricalandInformationEngineering,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,China2.KeyLaboratoryofModernAgriculturalEquipmentandTechnology,MinistryofEducation,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,China)

Fast identification of pesticide residue in lettuce leaves plays a key role in the test of food safety. However, there are a few studies on the mechanism of pesticide on the internal structure of lettuce. In order to further study the effects of dimethoate on lettuce microstructure, the lettuce at rosette stage was used as the experimental object. Besides, scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM) were used to detect the microstructure of lettuce leaves. It was found that the microstructure of the lettuce leaves was changed obviously with the increase of the concentration of dimethoate pesticides sprayed. Moreover, the ratio of length to width and density of stomata in leaves were decreased, leaf thickness was decreased, osmiophilic granules were increased and the starch granules were decreased. In the wavelength range of 897～1 332 nm, spraying dimethoate lettuce spectral reflectance was inversely proportional to the concentration of dimethoate. However, in the wavelength range of 1 703～1 754 nm, spraying dimethoate lettuce reflectance was proportional to the concentration of dimethoate. In addition, dimethoate pesticide spraying with different concentrations resulted in different textures of lettuce leaves. The results showed that dimethoate produced a huge change on lettuce microstructure, which caused great changes of the image information of lettuce leaves. Study on the microstructure of lettuce leaves sprayed with different concentrations of dimethoate pesticide provided the basis for the study on the mechanism of HSI technology to detect the different concentrations of pesticide residues in lettuce. Therefore, hyperspectral image detection technology can effectively realize the quantitative detection of pesticide residues on the surface of lettuce leaves.

lettuce leaves; pesticide residues; mechanism; microstructure; feature extraction; hyperspectral image

2016-08-30

2016-10-08

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31471413)、江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目PAPD(蘇政辦發(fā)2011 6號(hào))、江蘇大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(NZ201306)和江蘇省六大人才高峰項(xiàng)目(ZBZZ-019)

孫俊(1978—)，男，教授，博士，主要從事計(jì)算機(jī)技術(shù)在農(nóng)業(yè)工程中的應(yīng)用研究，E-mail: sun2000jun@ujs.edu.cn

10.6041/j.issn.1000-1298.2017.05.044

S636.2； 0433.4

A

1000-1298(2017)05-0350-06