毛罕平 左志強(qiáng) 施 杰 楊 寧,2 HUANG J S 嚴(yán)玉婷,4

(1.江蘇大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 鎮(zhèn)江 212013； 2.江蘇大學(xué)電氣信息工程學(xué)院， 鎮(zhèn)江 212013；3.加州大學(xué)圣地亞哥分校信息理論與應(yīng)用研究中心， 圣地亞哥 CA 92126； 4.江蘇大學(xué)化工化學(xué)學(xué)院， 鎮(zhèn)江 212013)

基于紙質(zhì)微流控芯片的農(nóng)藥檢測(cè)系統(tǒng)

毛罕平1左志強(qiáng)1施 杰1楊 寧1,2HUANG J S3嚴(yán)玉婷1,4

(1.江蘇大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 鎮(zhèn)江 212013； 2.江蘇大學(xué)電氣信息工程學(xué)院， 鎮(zhèn)江 212013；3.加州大學(xué)圣地亞哥分校信息理論與應(yīng)用研究中心， 圣地亞哥 CA 92126； 4.江蘇大學(xué)化工化學(xué)學(xué)院， 鎮(zhèn)江 212013)

針對(duì)當(dāng)前農(nóng)藥檢測(cè)手段儀器復(fù)雜、成本昂貴等問題，提出了一種基于紙質(zhì)微流控農(nóng)藥檢測(cè)方法。設(shè)計(jì)了具有自動(dòng)進(jìn)樣、混合反應(yīng)、電化學(xué)檢測(cè)等功能的紙質(zhì)微流控芯片，采用石墨碳、Ag/AgCl材料以及結(jié)合化學(xué)交聯(lián)法制備了環(huán)狀結(jié)構(gòu)的絲網(wǎng)印刷酶電極，并利用循環(huán)伏安法對(duì)制備的酶電極進(jìn)行了電化學(xué)表征，構(gòu)建了一套基于酶抑制法的集成酶電極紙質(zhì)微流控農(nóng)藥檢測(cè)系統(tǒng)。最后建立了酶抑制率與對(duì)硫磷濃度的數(shù)學(xué)模型，并測(cè)試了酶電極的性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酶電極具有良好的制備重復(fù)性、穩(wěn)定性和線性度。抑制率與對(duì)硫磷濃度的負(fù)對(duì)數(shù)在 1.0×10-7～1.0×10-5g/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：I=158.82+21.11lgC，R2為0.993，最低檢出限為3.3×10-8g/mL。所制備的酶電極微流控傳感器抗干擾性較強(qiáng)，對(duì)對(duì)硫磷農(nóng)藥具有一定的選擇性。加標(biāo)回收率范圍在95.8%～115.0%之間。

農(nóng)藥檢測(cè)系統(tǒng)； 酶抑制法； 紙質(zhì)微流控芯片； 酶電極； 電化學(xué)檢測(cè)

引言

微流控技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)以微流體操控為核心的科學(xué)技術(shù)，它將生化檢測(cè)所涉及的進(jìn)樣、混合、反應(yīng)、檢測(cè)等功能集成到一塊微米尺度芯片上構(gòu)建“芯片實(shí)驗(yàn)室”(Lab on a chip)，具有集成度高、耗材少、檢測(cè)速度快、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)[1-3]，已逐步被應(yīng)用在農(nóng)藥檢測(cè)領(lǐng)域。郭紅斌等[4]研制了一種有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)微流控芯片，利用甲基對(duì)硫磷和水解酶發(fā)生水解反應(yīng)產(chǎn)生有色溶液，用分光光度計(jì)檢測(cè)；DUFORD等[5]研制了一種由電動(dòng)機(jī)驅(qū)動(dòng)的陣列化離心式旋轉(zhuǎn)微流控芯片，利用分光光度計(jì)對(duì)2個(gè)獨(dú)立通道內(nèi)顯色區(qū)域進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)來實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥檢測(cè)；苑寶龍等[6]研制了一種用于農(nóng)藥殘留現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)微流控芯片，以二硫代二硝基苯甲酸和碳酸氫納為顯色劑，結(jié)合手持式光度分析裝置實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥檢測(cè)。以上微流控芯片農(nóng)藥檢測(cè)存在一些不足，微流控芯片造價(jià)高、芯片結(jié)構(gòu)復(fù)雜、需要外置驅(qū)動(dòng)來操控流體流動(dòng)。

而紙質(zhì)微流控芯片的出現(xiàn)，解決了傳統(tǒng)微流控芯片的諸多弊端，它具有成本低、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、無需外置驅(qū)動(dòng)，依靠自身層析力流動(dòng)，具有廣泛的應(yīng)用前景，引起了國(guó)內(nèi)外眾多研究者的關(guān)注[7-9]。CARRILHO等[10]利用噴蠟打印法，在紙上創(chuàng)建了完整的疏水區(qū)域、親水通道、流體液池和反應(yīng)區(qū)，并利用所制作的紙質(zhì)微流控芯片來檢測(cè)乳酸；馬翠翠等[11]創(chuàng)建了一種利用紫外光降解自組裝單分子層的紙芯片制作方法，并以顯色檢測(cè)的方式對(duì)血液中亞硝酸根進(jìn)行定量分析；WANG等[12]利用噴蠟打印機(jī)、蠟、聚二甲基硅氧烷(PDMS)等作為疏水性材料結(jié)合普通濾紙制備紙芯片，完成了重金屬離子的顯色分析。到目前為止，紙質(zhì)微流控技術(shù)在農(nóng)藥檢測(cè)領(lǐng)域鮮有報(bào)道，把紙質(zhì)微流控技術(shù)引入農(nóng)藥檢測(cè)，發(fā)揮紙質(zhì)微流控芯片諸多優(yōu)勢(shì)，將有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)微流控農(nóng)藥檢測(cè)成本高、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、需外置驅(qū)動(dòng)等諸多弊端。

因此，本文基于紙質(zhì)微流控芯片的廉價(jià)、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、自身層析流動(dòng)等優(yōu)勢(shì)，設(shè)計(jì)紙質(zhì)微流控芯片和酶電極，構(gòu)建基于酶抑制法的集成酶電極紙質(zhì)微流控農(nóng)藥檢測(cè)系統(tǒng)。測(cè)試并驗(yàn)證酶電極的制備重復(fù)性、貯藏性和線性度。建立抑制率與對(duì)硫磷濃度的負(fù)對(duì)數(shù)線性數(shù)學(xué)模型。最后，分別針對(duì)實(shí)際樣品河水、黃瓜、番茄中的農(nóng)藥進(jìn)行加標(biāo)回收率的計(jì)算，為農(nóng)藥檢測(cè)提供一種低廉、簡(jiǎn)便的檢測(cè)手段。

1 紙質(zhì)微流控農(nóng)藥檢測(cè)系統(tǒng)

1.1 檢測(cè)原理

采用乙酰膽堿酯酶抑制法作為紙質(zhì)微流控系統(tǒng)檢測(cè)農(nóng)藥的基本生化檢測(cè)方法，具體檢測(cè)原理為：底物氯化乙酰硫代膽堿在乙酰膽堿酯酶(AChE)催化下分解生成硫代膽堿和乙酸產(chǎn)物，而產(chǎn)物硫代膽堿在電極表面的激勵(lì)電流作用下發(fā)生氧化還原反應(yīng)，最終生成二硫化物、氫離子和電子，從而產(chǎn)生氧化還原電流[13]?；瘜W(xué)反應(yīng)整個(gè)過程為

有機(jī)磷農(nóng)藥的磷酰基能與乙酰膽堿酯酶的活性位點(diǎn)緊密結(jié)合，導(dǎo)致乙酰膽堿酯酶磷?；Щ頪14]。在上述化學(xué)反應(yīng)中，當(dāng)加入有機(jī)磷農(nóng)藥后，乙酰膽堿酯酶的活性就會(huì)被抑制，催化能力隨之降低，致使中間產(chǎn)物硫代膽堿減少，在電極的電流激勵(lì)下，相應(yīng)生成的二硫化物、氫離子和電子的量也隨之減少，此時(shí)氧化還原反應(yīng)電流降低。通過電極來檢測(cè)乙酰膽堿酯酶被農(nóng)藥抑制前后氧化還原反應(yīng)伴隨的電流變化，將所檢測(cè)到的抑制前后2個(gè)電流代入

(1)

式中 I——乙酰膽堿酯酶抑制率 I1——在乙酰膽堿酯酶未被有機(jī)磷農(nóng)藥抑制下底物溶液中所測(cè)得的穩(wěn)定電流

I2——在乙酰膽堿酯酶被農(nóng)藥抑制下底物溶液中所測(cè)得的穩(wěn)定電流

可以計(jì)算出當(dāng)前農(nóng)藥濃度下對(duì)應(yīng)的酶抑制率。

在一定范圍內(nèi)，有機(jī)磷農(nóng)藥濃度越大，乙酰膽堿酯酶的抑制率就越大，兩者之間具有正相關(guān)關(guān)系，為實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥濃度的定量檢測(cè)奠定了重要的基礎(chǔ)。

1.2 紙質(zhì)微流控芯片結(jié)構(gòu)

紙質(zhì)微流控芯片選用英國(guó)Whatman4號(hào)濾紙，如圖1所示，芯片由進(jìn)樣池A和進(jìn)樣池B、進(jìn)樣通道A和進(jìn)樣通道B、檢測(cè)池A和檢測(cè)池B、方波型被動(dòng)式微混合器構(gòu)成[15]，進(jìn)樣池A和進(jìn)樣池B分別位于進(jìn)樣通道A和進(jìn)樣通道B的上端部，檢測(cè)池A位于進(jìn)樣通道A的中部，檢測(cè)池B位于方波型微混合器混合通道的末端。紙質(zhì)微流控芯片的微通道橫截面尺寸長(zhǎng)為800 μm，寬(即紙厚度)為100 μm, 進(jìn)樣池A和B的半徑均為2 mm, 檢測(cè)池A和B的半徑是進(jìn)樣池A和B的1.5倍，為3 mm；進(jìn)樣通道A長(zhǎng)度為15 mm, 進(jìn)樣通道B長(zhǎng)度為20 mm, 方波形被動(dòng)式微混合器有效長(zhǎng)度為22 mm。具體原理為：氯化乙酰硫代膽堿溶液從進(jìn)樣池A進(jìn)入進(jìn)樣通道A，經(jīng)過檢測(cè)池A中酶電極檢測(cè)電流為I1，之后與從進(jìn)樣池B中進(jìn)入進(jìn)樣通道B中的有機(jī)磷農(nóng)藥匯合，在方波型混合結(jié)構(gòu)中充分混合，并在有機(jī)磷農(nóng)藥抑制后共同進(jìn)入含有酶電極的檢測(cè)池B中得到檢測(cè)電流I2, 根據(jù)式(1)計(jì)算農(nóng)藥濃度。

圖1 紙質(zhì)微流控芯片原理圖Fig.1 Schematic of designed paper-based microfluidic chip1.方波型被動(dòng)式微混合器 2.進(jìn)樣通道B 3.進(jìn)樣池B 4.進(jìn)樣池A 5.進(jìn)樣通道A 6.檢測(cè)池A 7.檢測(cè)池B

1.3 酶電極設(shè)計(jì)及制作

1.3.1 絲網(wǎng)印刷三電極設(shè)計(jì)

碳具有良好的穩(wěn)定性和導(dǎo)電性，且具有成本低等優(yōu)點(diǎn)，故選用石墨碳為工作電極和對(duì)電極的材料。絲網(wǎng)印刷三電極中的參比電極材料一般選用Ag/AgCl[16-17],故選用Ag/AgCl作為參比電極制作材料。

據(jù)文獻(xiàn)[18]可知，電極尺寸對(duì)擴(kuò)散傳質(zhì)速率和電流具有較大的影響。如果電極尺寸半徑越小，那么擴(kuò)散傳質(zhì)速率就越大，反應(yīng)越快。電流與電極表面積成正比，而電極尺寸又不能無限制地縮小，否則會(huì)導(dǎo)致電流太小，不利于正常檢測(cè)。因此，設(shè)計(jì)工作電極直徑為3 mm。此外，三電極環(huán)狀結(jié)構(gòu)對(duì)去離子水具有較好的電流響應(yīng)特性[19]，本文設(shè)計(jì)的三電極結(jié)構(gòu)如圖2所示，參比電極和對(duì)電極呈環(huán)形，并分別位于工作電極的兩側(cè)，構(gòu)成絲網(wǎng)印刷三電極，電極采用聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)作為基底。

圖2 絲網(wǎng)印刷三電極Fig.2 Three screen-printed electrodes

1.3.2 乙酰膽堿酯酶的固定

酶固定所用的試劑與儀器有：亞甲基藍(lán)(MB，西隴化工)、曲拉通X-100(Triton X-100，西隴化工)、乙酰膽堿酯酶(AchE，上海金穗生物科技有限公司)、戊二醛(C5H8O2，西隴化工)、牛血清白蛋白(BSA，上海金穗生物科技有限公司)、磷酸鹽緩沖液(PBS，自行配制)、微量移液槍(艾本德)。

酶一般有固態(tài)和溶液態(tài)，溶液態(tài)的酶通常不穩(wěn)定、易失活且耗量大成本高，因此需要將酶固定化。目前酶的固定方法分為：吸附法、交聯(lián)法、包埋法、共價(jià)鍵合法[20-23]。其中，交聯(lián)法結(jié)合力強(qiáng)且穩(wěn)定性好、能保持較好的酶活性，故采用交聯(lián)法作為固定酶的方法，并選用牛血清白蛋白-戊二醛作為交聯(lián)劑。

在乙酰膽堿酯酶固定前，必須首先采用文獻(xiàn)[24]中的方法先對(duì)裸電極進(jìn)行修飾。修飾的目的是提高電極的物化性能，加快電子的傳遞，具體修飾過程如下:把0.128 g亞甲基藍(lán)粉末加入到10 mL 0.01 mol/L 的磷酸鹽緩沖液中(pH值為7.4)，不斷攪拌均勻，配置成40 mol/L的亞甲基藍(lán)溶液；再向剛配好的亞甲基藍(lán)溶液中加入10 μL的Triton X-100 溶液(確保亞甲基藍(lán)更好地吸附在電極表面)，攪拌使之充分混合，用微型移液槍抽取5 μL 的修飾溶液滴至工作電極表面，在24℃恒溫的室內(nèi)放置12 h。電極修飾完畢后，取1 g牛血清白蛋白加入10 mL 磷酸鹽緩沖液中，配置成10%的牛血清白蛋白溶液；取2 mL 25%的戊二醛溶液加入8 mL磷酸鹽緩沖液中，配置成5%的戊二醛溶液；分別取40 μL乙酰膽堿酯酶溶液(500 U/mL)，5 μL 10%的牛血清白蛋白溶液，5 μL 5%的戊二醛溶液，三者充分混合后，用移液槍將5 μL 的混合酶液滴涂在工作電極表面，室溫下晾干后并放置在4℃的冰箱內(nèi)保存。

1.4 實(shí)驗(yàn)平臺(tái)

圖3 紙質(zhì)微流控農(nóng)藥檢測(cè)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)Fig.3 Experiment platform of paper-based microfluidic for pesticides detection1.紙質(zhì)微流控系統(tǒng) 2.微量注射泵 3.轉(zhuǎn)換接頭 4.電化學(xué)工作站

如圖3所示為搭建的紙質(zhì)微流控農(nóng)藥檢測(cè)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，平臺(tái)包括紙質(zhì)微流控系統(tǒng)(由紙質(zhì)微流控芯片和集成酶電極構(gòu)成)、微量注射泵(LSP04-1A，保定蘭格)、電化學(xué)工作站(CHI660C，上海辰華)。另外，電化學(xué)工作站與電極連接線末端的3個(gè)金屬夾頭太大，無法夾緊酶電極的三電極，又為了便于酶電極與紙芯片的集成，因此采用了轉(zhuǎn)換接頭，轉(zhuǎn)換接頭右邊類似USB插口，便于酶電極平行插入， 轉(zhuǎn)換接頭左邊引出凸出的3根金屬棒，分別對(duì)應(yīng)三電極，便于電化學(xué)工作站連接線上的3個(gè)鱷魚夾夾緊。

2 實(shí)驗(yàn)方案與設(shè)計(jì)

2.1 試劑材料

表征溶液所采用的試劑材料有：亞鐵氰化鉀(K4Fe(CN)6，成都科龍化工)、鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6，成都科龍化工)、氯化鉀(KCl，成都科龍化工)。所需要的表征溶液為5 mmol/L鐵氰化鉀-亞鐵氰化鉀溶液+0.1 mol/L氯化鉀溶液，其中，鐵氰化鉀-亞鐵氰化鉀溶液為氧化還原探針，氯化鉀溶液為電解質(zhì)溶液。配制方法為：稱取0.164 6 g鐵氰化鉀、0.211 2 g亞鐵氰化鉀、0.745 5 g氯化鉀，并用去離子水定容到100 mL即可。

農(nóng)藥檢測(cè)所需試劑材料有：氯化鈉(NaCl，上海國(guó)藥試劑)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O，上海國(guó)藥試劑)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O，上海國(guó)藥試劑)、氯化乙酰膽堿即底物(ACH，上海金穗生物科技有限公司)、乙酰膽堿酯酶(AChE，上海金穗生物科技有限公司)、對(duì)硫磷溶液(北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司)。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用1.3節(jié)中酶電極制備方法重復(fù)制作6只酶電極，將它們分別置于底物溶液中，用差分脈沖伏安法分別測(cè)得它們的峰電流，根據(jù)峰電流的穩(wěn)定性來測(cè)試酶電極的制備重復(fù)性。

將制備好的酶電極保存在4℃冰箱中，保持其他環(huán)境相同，每隔5 d測(cè)一次峰電流值，以此來考察其穩(wěn)定性。

將10-4g/mL 的對(duì)硫磷溶液稀釋成不同濃度梯度的農(nóng)藥溶液，并將稀釋的農(nóng)藥和底物溶液同時(shí)注入紙質(zhì)微流控系統(tǒng)，通過電化學(xué)工作站采集2個(gè)檢測(cè)池中集成的酶電極上的電流信號(hào)，代入式(1)后可得到當(dāng)前農(nóng)藥濃度所對(duì)應(yīng)的抑制率，以此來建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型。通過這種模型來求得所構(gòu)建系統(tǒng)對(duì)有機(jī)磷的檢測(cè)線性度及最低檢測(cè)限。

傳感檢測(cè)系統(tǒng)的準(zhǔn)確度常選擇用回收率指標(biāo)來表示[25]?；厥章实挠?jì)算方法為：加標(biāo)后的實(shí)際測(cè)量值除以加入的標(biāo)準(zhǔn)濃度值。為考察該檢測(cè)系統(tǒng)的實(shí)用性能，通過加標(biāo)回收的方法測(cè)算檢測(cè)系統(tǒng)的回收率。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，分別用江蘇大學(xué)玉帶河水、新鮮黃瓜和番茄汁配置成10-5g/mL、10-6g/mL、10-7g/mL 3種濃度的對(duì)硫磷溶液作為標(biāo)本，利用該紙質(zhì)微流控農(nóng)藥檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)出當(dāng)前農(nóng)藥濃度值，繼而求得回收率。

3 結(jié)果與討論

3.1 酶電極電化學(xué)表征

在酶電極電化學(xué)表征前，必須對(duì)電化學(xué)工作站進(jìn)行參數(shù)設(shè)置，具體參數(shù)設(shè)置如下：掃描范圍-0.2～0.6 V，掃描速度0.1 V/s，采樣間隔0.001 V，靜止時(shí)間2 s，靈敏度10-5A/V。圖4中曲線a為修飾亞甲基藍(lán)的電極，曲線b為修飾亞甲藍(lán)并固定酶的電極，曲線c為裸電極。由圖4可知，修飾亞甲基藍(lán)的電極在氧化過程中，當(dāng)工作電壓為-0.026 V時(shí)取得峰電流I1；固定酶的電極在氧化過程中，當(dāng)工作電壓為-0.034 V時(shí)取得峰電流I2；裸電極在氧化過程中，當(dāng)工作電壓為-0.015 V時(shí)取得峰電流I3，電流I1>I2>I3。與裸電極相比，修飾了亞甲基藍(lán)的電極測(cè)得的峰電流明顯增大，極大地改善了電極導(dǎo)電性能，表明亞甲基藍(lán)的修飾提高了電極的電導(dǎo)性；而把膽堿酯酶固定到電極上時(shí)，峰電流反而有所減小, 原因是酶分子沒有導(dǎo)電性，阻礙了電子的傳遞，也說明酶固定成功。

圖4 循環(huán)伏安表征圖Fig.4 Cyclic voltammetry characterization

最后利用電化學(xué)工作站探究掃描速度v與峰電流I之間的關(guān)系。設(shè)置掃描速度為6個(gè)不同的值，分別為50、75、100、125、150、200 mV/s，在不同的掃描速度下測(cè)取峰電流。如圖5所示，隨著掃描速度的增加，峰電流也相應(yīng)地增加，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，峰電流與掃描速度的平方根之間呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，氧化反應(yīng)和還原反應(yīng)過程的相關(guān)性方程分別為：I=-14.48v1/2+41.53(決定系數(shù)R2=0.993)、I=19.15v1/2-59.84(決定系數(shù)R2=0.996)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明在氧化還原反應(yīng)過程中，電極表面表現(xiàn)出擴(kuò)散電流的特征。

圖5 掃速平方根與峰電流關(guān)系曲線Fig.5 Relationship between square root of sweep speed and peak current

3.2 酶電極性能測(cè)試與分析

3.2.1 重復(fù)性

制作出來的不同電極之間物理化學(xué)性質(zhì)相差太大，會(huì)給檢測(cè)結(jié)果造成較大的誤差，所以需要驗(yàn)證以相同的工藝重復(fù)制備多只電極時(shí)的制備重復(fù)性是否滿足要求。

采用相同的制作工藝制備出6只酶電極，并放置在相同的底物溶液中測(cè)試，以電極對(duì)底物的電流響應(yīng)值來測(cè)試酶電極的制備重復(fù)性。所測(cè)得6只酶電極峰電流的方差S2為0.16，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.04%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)制作6只酶電極時(shí)，峰電流的離散度較低，說明相同工藝制作出的多只電極之間的物化性能相差不大，檢測(cè)效果相似，因此，酶電極有良好的制備重復(fù)性，可批量制備。

3.2.2 穩(wěn)定性

把制備完成的酶電極保存在溫度為4℃的冰箱中，保持其他環(huán)境相同，每隔5 d測(cè)量一次。過15 d后，在底物溶液中測(cè)得的峰電流仍然保持在初始電流的90%以上，30 d后測(cè)得的峰電流值保持在初始電流的80%左右，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說明酶電極在保持良好的性能之下存放時(shí)間較長(zhǎng)，穩(wěn)定性好，且保持良好穩(wěn)定性最佳時(shí)間范圍在15 d以內(nèi)。主要原因是電極表面被修飾了亞甲基藍(lán)，亞甲基藍(lán)表現(xiàn)出了兩大優(yōu)勢(shì)，第一提高了電極的電導(dǎo)性，能夠促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移，第二使電極具有更好的生物兼容性，保持其表面所固定酶的活性，也能使固定在電極表面的酶更加牢固，提高了酶的有效固定量。

3.2.3 線性度

線性度是衡量紙質(zhì)微流控農(nóng)藥檢測(cè)系統(tǒng)特性的一個(gè)重要指標(biāo)，表征了平均校準(zhǔn)曲線與擬合直線之間的偏離程度。只有系統(tǒng)保持較高的線性度，才能建立更準(zhǔn)確的數(shù)學(xué)模型，達(dá)到精準(zhǔn)檢測(cè)農(nóng)藥的目的。因此，需要測(cè)量線性度來考察檢測(cè)系統(tǒng)的性能。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，抑制率與對(duì)硫磷濃度的負(fù)對(duì)數(shù)在1.0×10-7～1.0×10-5g/mL 的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：I=158.82+21.11lgC，其中C表示對(duì)硫磷濃度，決定系數(shù)R2為0.993，按抑制率為10%確定檢出限，則檢出限為3.3×10-8g/mL，該檢測(cè)方法檢出限低于對(duì)硫磷國(guó)家檢出限標(biāo)準(zhǔn)5.0×10-7g/mL。

圖6 對(duì)硫磷濃度負(fù)對(duì)數(shù)與抑制率關(guān)系Fig.6 Relationship between negative logarithm of parathion concentration and inhibition rate

3.2.4 抗干擾選擇性測(cè)試

圖7 不同干擾物質(zhì)加入后酶電極對(duì)0.4 μg/mL對(duì)硫磷溶液的電化學(xué)響應(yīng)Fig.7 Amperometric response of sensor to 0.4 μg/mL parathion in absence and presence of different interference substances

3.3 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用江蘇大學(xué)玉帶河水、新鮮黃瓜和番茄搗碎萃取汁液作為實(shí)際樣本。通過標(biāo)準(zhǔn)加入法，把10-4g/mL的對(duì)硫磷溶液加入到不等量的河水、新鮮黃瓜汁和番茄汁中，稀釋配置成10-5、10-6、10-7g/mL 3種濃度的對(duì)硫磷溶液，利用加標(biāo)回收的方法測(cè)取系統(tǒng)的回收率，回收率的計(jì)算方法為：加標(biāo)后的實(shí)際檢測(cè)濃度除以加入的標(biāo)準(zhǔn)濃度(加標(biāo)回收率在90%～120%之間視為正常)。

表1 河水中對(duì)硫磷檢測(cè)濃度Tab.1 Detectable concentrations of parathion in river water g/mL

表2 河水中對(duì)硫磷的加標(biāo)回收率Tab.2 Recovery rates of parathion in river water

表3 黃瓜汁中對(duì)硫磷的檢測(cè)濃度Tab.3 Detectable concentrations of parathion in cucumber juice g/mL

表4 黃瓜汁中對(duì)硫磷的加標(biāo)回收率Tab.4 Recovery rates of parathion in cucumber juice

表5 番茄汁中對(duì)硫磷的檢測(cè)濃度Tab.5 Detectable concentrations of parathion in tomato juice g/mL

所制備酶電極傳感器分別對(duì)河水、新鮮黃瓜汁和番茄汁的回收率范圍都處在正?；厥章史秶?0%～120%內(nèi)，方差S2都小于1, 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差都小于10%, 結(jié)果表明所制備的酶電極抗干擾性較強(qiáng)。其中，加標(biāo)回收率在以100%為基準(zhǔn)上下微小浮動(dòng)，原因是實(shí)際樣品中存在各種不明的雜質(zhì)等干擾物質(zhì)，對(duì)制備的酶電極傳感器有一定程度上微小的干擾，河水的水質(zhì)環(huán)境最為復(fù)雜，不明干擾物質(zhì)較多，其回收率的范圍、方差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差相比新鮮黃瓜汁和番茄汁較大。

表6 番茄汁中對(duì)硫磷的加標(biāo)回收率Tab.6 Recovery rates of parathion in tomato juice

由此可知，所設(shè)計(jì)的紙質(zhì)微流控農(nóng)藥檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)農(nóng)藥的加標(biāo)回收率在正常范圍內(nèi)，抗干擾能力較強(qiáng)，準(zhǔn)確度較高，可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

4 結(jié)束語

設(shè)計(jì)了紙質(zhì)微流控芯片和酶電極，構(gòu)建了紙質(zhì)微流控農(nóng)藥檢測(cè)系統(tǒng)并測(cè)試了酶電極的檢測(cè)性能。測(cè)試結(jié)果說明酶電極具有良好的制備重復(fù)性、穩(wěn)定性；建立了抑制率和對(duì)硫磷農(nóng)藥的數(shù)學(xué)模型，即抑制率與對(duì)硫磷濃度的負(fù)對(duì)數(shù)在1.0×10-7～1.0×10-5g/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：I=158.82+21.11lgC，R2為0.993，檢出限為3.3×10-8g/mL；檢測(cè)河水中的農(nóng)藥時(shí)，加標(biāo)回收率的范圍在95.8%～115.0%之間；檢測(cè)黃瓜汁中的農(nóng)藥時(shí)，加標(biāo)回收率的范圍在96.2%～111.0%之間；檢測(cè)番茄汁中的農(nóng)藥時(shí)，加標(biāo)回收率的范圍在99.1%～110.0%之間；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所設(shè)計(jì)的紙質(zhì)微流控農(nóng)藥檢測(cè)系統(tǒng)的準(zhǔn)確度較高、可靠性強(qiáng)，可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

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Detection System for Pesticides with Paper-based Microfluidic Chip

MAO Hanping1ZUO Zhiqiang1SHI Jie1YANG Ning1,2HUANG J S3YAN Yuting1,4
(1.KeyLaboratoryofModernAgriculturalEquipmentandTechnology,MinistryofEducation,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,China2.SchoolofElectricalandInformationEngineering,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,China3.TheInformationTheoryandApplicationsCenter，UniversityofCaliforniaSanDiego,SanDiegoCA92126,USA4.SchoolofChemistryandChemicalEngineering,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,China)

In order to solve the problems relating to pesticides detection with the use of complex instruments in terms of high cost, tedious operation and low degree of automation, a new method for pesticides detection with paper-based microfluidic chip was provided. The paper-based microfluidic chip was designed and developed with automatic sample injection, hybrid reaction and electrochemical detection. Subsequently, the enzyme electrode of ring structure was prepared by chemical crosslinking method using graphite carbon and Ag/AgCl materials and then characterized with electrochemistry cyclic voltammetry (CV). The integrated enzyme electrode of the paper-based microfluidic detection system for pesticides was built based on enzyme inhibition mechanism. Finally, the linear model between inhibition rate and parathion pesticides concentration was set up and the performance of the enzyme electrode was tested. The results showed that the prepared enzyme electrode was of good repeatability, linearity and stability. Furthermore, a linear relationship was displayed between inhibition rate and parathion pesticides, which was represented by the equationI=158.82+21.11lgCwith good linear range of 1.0×10-7g/mL～1.0×10-5g/mL. The determination coefficient obtained was 0.993 and the corresponding limit of detection was 3.3×10-8g/mL. The enzyme electrode integrated on the paper-based microfluidic chip was robust with parathion pesticides which can not be interfered with other pesticides and substance with standard addition recovery rate of 95.8%～115.0%.

pesticides detection system; enzyme inhibition method; paper-based microfluidic chip; enzyme electrode; electrochemical detection

2016-08-13

2016-10-19

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2014BAD08B03)、國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(61233006)、國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31671584)、江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目(CXC1571033-02)和江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目(蘇財(cái)教(2014)37號(hào))

毛罕平(1961—)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備和設(shè)施農(nóng)業(yè)環(huán)境控制技術(shù)研究，E-mail: maohp@ujs.edu.cn

10.6041/j.issn.1000-1298.2017.05.011

S220.1； TH703

A

1000-1298(2017)05-0094-07