朱連連 趙容 李詩慧 趙思慧 劉洋洋 梁一凡

遼細(xì)辛和北馬兜鈴ISSR-PCR的引物篩選及反應(yīng)體系的建立與正交優(yōu)化※

朱連連 趙容*李詩慧 趙思慧 劉洋洋 梁一凡

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物學(xué)教研室，大連116600）

目的探尋適合細(xì)辛和馬兜鈴品種鑒定的ISSR引物。方法利用一個(gè)品種對(duì)全部100條ISSR引物設(shè)置退火溫度進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)，篩選出重復(fù)性好、條帶清晰的引物5條，從理論上講，這些篩選的引物可以實(shí)現(xiàn)對(duì)現(xiàn)有遼細(xì)辛和北馬兜鈴品種的鑒定。馬兜鈴屬ISSR-PCR的引物篩選，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法，從Taq DNA聚合酶濃度、Mg2+濃度、dNTP濃度、引物濃度，這4種因素3個(gè)水平，對(duì)馬兜鈴屬ISSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化分析，并在此基礎(chǔ)上對(duì)模板DNA濃度、PCR反應(yīng)過程中的退火溫度進(jìn)行梯度檢測(cè)。結(jié)果從樣品中篩選出優(yōu)選引物，細(xì)辛UBC815、UBC826、UBC862、UBC868、UBC888；馬兜鈴UBC825、UBC827、UBC836、UBC846、UBC848。反應(yīng)體系的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果均穩(wěn)定可靠。結(jié)論得到馬兜鈴的最佳組合，即20μL ISSR-PCR反應(yīng)體系中含0.25 Lmol/L引物、1.5 mmol/L Mg2+、1×PCR buffer、150 Lmol/LdNTP和0.5 UTaqDNA聚合酶。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，以30個(gè)循環(huán)94℃變性30 s，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，最后以72℃延伸10 min。得到細(xì)辛的最佳組合，20 μL ISSR-PCR反應(yīng)體系中含0.50 Lmol/L引物、1.5 mmol/L Mg2+、2×PCR buffer、250 Lmol/L dNTP和2.0 UTaqDNA聚合酶；同時(shí)得到最佳模板DNA濃度為10 ng，最佳退火溫度為50℃。

遼細(xì)辛；北馬兜鈴；引物篩選；正交優(yōu)化

馬兜鈴科植物北馬兜鈴Aristolochia contorta Bge.或馬兜鈴Aristolochia debilis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果實(shí)[3]。馬兜鈴為多年生的纏繞性草本植物。其根、莖、果實(shí)都稱馬兜鈴，苦，微寒。歸肺、大腸經(jīng)。馬兜鈴具有清肺止咳、降氣平喘、清腸消痔的功效，馬兜鈴有強(qiáng)烈致癌物質(zhì)成分，馬兜鈴中含有的馬兜鈴酸可導(dǎo)致馬兜鈴酸腎病。貯藏置干燥處[8-11]。

細(xì)辛來源于漢城細(xì)辛Asarum sieboldii Miq.var.se oulense Nakai或華細(xì)辛Asarwm sieboldii Miq.北細(xì)辛AsarumheterotropoidesFr.Schmidtvar.mandshuricum (Maxim.)Kitag.的干燥根和根蓮[3]。前2種習(xí)稱“遼細(xì)辛”。夏季果熟期或初秋采挖，除凈地上部分和泥沙，陰干。辛，溫。歸心、肺、腎經(jīng)。解表散寒，祛風(fēng)止痛，通竅，溫肺化飲。貯藏置陰涼干燥處。本文的主旨是建立馬兜鈴屬植物——細(xì)辛和馬兜鈴的ISSR優(yōu)化體系[1-2]。

1 材料和方法

1.1 材料22份細(xì)辛和7份馬兜鈴種質(zhì)資源采自遼寧省撫順市新賓、清原鎮(zhèn)，丹東鳳城市愛陽鎮(zhèn)，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)尹海波，王冰教授鑒定，植株保存在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)孵化器，DNA保存于超低溫冰箱中。本文中的馬兜鈴都是北馬兜鈴，細(xì)辛都是遼細(xì)辛。

1.2 方法植物遼細(xì)辛，北馬兜鈴材料的基因組DNA提取采用經(jīng)典CTAB法。然后0.8%瓊脂糖凝膠上檢測(cè)遼細(xì)辛，北馬兜鈴基因組DNA質(zhì)量，接著用快速蛋白質(zhì)-核酸分析儀分析DNA濃度和純度，最后稀釋到20 ng/L并－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增反應(yīng)在Biometra PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。ISSR采用20 μL反應(yīng)體系，其中包括了4種dNTP各200 μmol/L，引物各0.5 μmol/L，1×PCRbuffer，1.5 mmol/L MgCl2，rTaq酶1.0 U，基因組DNA 20 ng。本實(shí)驗(yàn)的PCR反應(yīng)條件為95℃然后預(yù)變性2 min，以40個(gè)循環(huán)94℃變性1 min，然后50℃退火1 min，再72℃延伸2 min，最后以72℃延伸5 min。實(shí)驗(yàn)所用PCR相關(guān)試劑均購自TaKaRa(寶)生物工程(大連)有限公司。ISSR引物使用加拿大哥倫比亞大學(xué)(Univer-sity of British Columbia，UBC)所設(shè)計(jì)100條引物，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成[1]。

1.3 提取植物基因組總DNA本實(shí)驗(yàn)采用CTAB法提取遼細(xì)辛和北馬兜鈴基因組總DNA，使用0.8%的瓊脂糖電泳檢測(cè)，最后實(shí)驗(yàn)時(shí)把DNA濃度稀釋至20 ng/μL。

1.4 遼細(xì)辛和北馬兜鈴引物篩選從22份細(xì)辛中選取一份細(xì)辛樣品，用100條引物篩選（本實(shí)驗(yàn)所用引物為哥倫比亞大學(xué)UBC公布的100條ISSR通用引801-900，由華大公司合成），從中優(yōu)選出5條，一條用于做正交實(shí)驗(yàn)，另外4條備份。馬兜鈴?fù)怼?/p>

1.5 遼細(xì)辛和北馬兜鈴ISSR-PCR反應(yīng)體系正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別對(duì)引物濃度、Mg2+濃度、dNTP濃度、TaqDNA聚合酶濃度進(jìn)行篩選，方案如表1、2。

表1 ISSR-PCR反應(yīng)體系的因素與水平L9(34)[2]

表2 ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[2]

根據(jù)以上表1、2配制遼細(xì)辛和北馬兜鈴PCR反應(yīng)總體積為20[0]μL，再加入DNA和PCR達(dá)到總體積，馬兜鈴引物選用UBC827，細(xì)辛引物選用UBC868，每組處理設(shè)置2次重復(fù)。本實(shí)驗(yàn)遼細(xì)辛，北馬兜鈴擴(kuò)增PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；然后94℃變性30 s，45℃退火60 s，72℃延伸60 s，此循環(huán)30次；72℃延伸10 min。所得的PCR產(chǎn)物通過凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

1.6 遼細(xì)辛和北馬兜鈴的ISSR-PCR反應(yīng)體系中模板DNA濃度的優(yōu)化根據(jù)兩種材料正交試驗(yàn)結(jié)果選出最佳反應(yīng)體系組合，再篩選出合適的模板DNA濃度。兩種材料反應(yīng)體系為20 μL，DNA質(zhì)量分別為10 ng、20 ng、40 ng、60 ng、80 ng、100 ng、120 ng七個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)2次重復(fù)，其它程序與正交實(shí)驗(yàn)相同。

1.7 遼細(xì)辛和北馬兜鈴的ISSR-PCR反應(yīng)體系中退火溫度的優(yōu)化在上述試驗(yàn)確定的最佳反應(yīng)體系基礎(chǔ)之上，對(duì)退火溫度進(jìn)行梯度試驗(yàn)，篩選出最佳退火溫度。在PCR梯度擴(kuò)增儀上設(shè)置最低退火溫度為40℃，最高為58℃，PCR反應(yīng)8個(gè)梯度，即45℃、49℃、50℃、51℃、55℃、56℃、57℃、58℃，每個(gè)梯度設(shè)2次重復(fù)，其它程序與正交實(shí)驗(yàn)相同。

1.8 遼細(xì)辛和北馬兜鈴的ISSR-PCR反應(yīng)體系的穩(wěn)定性檢測(cè)分別選擇遼細(xì)辛，北馬兜鈴的另外四個(gè)ISSR引物：馬兜鈴為UBC825、UBC836、UBC846、UBC848；細(xì)辛為UBC815、UBC826、UBC862、UBC888根據(jù)以上篩選穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)引物設(shè)2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果和分析

2.1 遼細(xì)辛和北馬兜鈴引物篩選從22份細(xì)辛中選取一份細(xì)辛樣品，用100條引物篩選，從中優(yōu)選出5條，一條用于做正交實(shí)驗(yàn)，另外4條備份。馬兜鈴從7份馬兜鈴中選取一份馬兜鈴樣品，用100條引物篩選，從中優(yōu)選出5條，一條用于做正交實(shí)驗(yàn)，另外4條備份。細(xì)辛選擇引物UBC868，馬兜鈴選擇引物UBC827供實(shí)驗(yàn)使用。

圖1 細(xì)辛

圖2 馬兜鈴

2.2 遼細(xì)辛和北馬兜鈴ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化

圖3 細(xì)辛的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)ISSR-PCR反應(yīng)體系的擴(kuò)增結(jié)果

圖4 馬兜鈴的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)ISSR-PCR反應(yīng)體系的擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)文獻(xiàn)和《藥典》，最佳組合應(yīng)篩選確定為譜帶清晰以及譜帶穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)的組合，故本實(shí)驗(yàn)遼細(xì)辛選擇組合8為最佳組合，即20 μL ISSR-PCR反應(yīng)體系中含0.50 mmol/L引物、1.5 mmol/L Mg2+、2×PCR buffer、250 mmol/L dNTP和2.0UTaqDNA聚合酶；北馬兜鈴選擇組合為1最佳組合，即20 μL ISSR-PCR反應(yīng)體系中含0.25 mmol/L引物、1.5 mmol/L Mg2+、1× PCR buffer、150 mmol/L dNTP和0.5 UTaqDNA聚合酶。

2.3 遼細(xì)辛和北馬兜鈴不同模板DNA濃度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果選擇組合8對(duì)模板DNA濃度進(jìn)行梯度篩選。由圖5看出，由于模板DNA濃度不同，擴(kuò)增結(jié)果存在差異。因此，本實(shí)驗(yàn)確定最佳模板DNA濃度為10 ng。

圖5 馬兜鈴ISSR-PCR反應(yīng)體系中不同模板DNA濃度的擴(kuò)增結(jié)果(引物:UBC827)

圖6 細(xì)辛ISSR-PCR反應(yīng)體系中不同模板DNA濃度的擴(kuò)增結(jié)果(引物:UBC868)

2.4 遼細(xì)辛和北馬兜鈴不同退火溫度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響從下圖7和8可以看出，退火溫度由40℃升到58℃，退火溫度為50℃時(shí)，譜帶清晰、譜帶穩(wěn)定、譜帶多態(tài)性高的組合清晰、雜帶少。綜上，本實(shí)驗(yàn)最終確定引物UBC868，UBC827的最佳退火溫度確定為50℃。

圖7 北馬兜鈴ISSR-PCR反應(yīng)體系中不同退火溫度的擴(kuò)增結(jié)果。引物:UBC827

圖8 細(xì)辛ISSR-PCR反應(yīng)體系中不同退火溫度的擴(kuò)增結(jié)果。引物:UBC868

2.5 遼細(xì)辛和北馬兜鈴ISSR-PCR反應(yīng)體系的穩(wěn)定性檢測(cè)選擇北馬兜鈴另外4條ISSR引物分別為UBC825、UBC836、UBC846、UBC848，再選擇遼細(xì)辛另外4個(gè)ISSR引物細(xì)辛UBC815、UBC826、UBC862、UBC888對(duì)優(yōu)化反應(yīng)體系的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)。由圖9看出，均能擴(kuò)增出譜帶，表明優(yōu)化確立的遼細(xì)辛和北馬兜鈴ISSRPCR反應(yīng)體系是穩(wěn)定可靠的。

圖9 北馬兜鈴、遼細(xì)辛ISSR-PCR反應(yīng)體系中不同引物的穩(wěn)定性擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

本研究是采用ISSR對(duì)藥用植物馬兜鈴屬—遼細(xì)辛，北馬兜鈴進(jìn)行研究。項(xiàng)目創(chuàng)新之處，首次對(duì)藥用植物馬兜鈴屬—遼細(xì)辛，北馬兜鈴進(jìn)行分子方面的實(shí)驗(yàn)。首次同時(shí)對(duì)遼細(xì)辛和北馬兜鈴進(jìn)行ISSR鑒別。通過在第四次全國中藥資源普查期間采集實(shí)驗(yàn)材料，22份細(xì)辛和7份馬兜鈴種質(zhì)資源采自遼寧省撫順市新賓、清原鎮(zhèn)，丹東鳳城市愛陽鎮(zhèn)。

本研究中，前期進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)性工作，樣品干燥，研磨，DNA提取采用CTAB法，篩選DNA，最后從22份細(xì)辛中選取一份細(xì)辛樣品，用100條引物篩選，從中優(yōu)選出5條，一條用于做正交實(shí)驗(yàn)，另外4條備份。馬兜鈴從7份馬兜鈴中選取一份馬兜鈴樣品，用100條引物篩選，從中優(yōu)選出5條，一條用于做正交實(shí)驗(yàn)。細(xì)辛UBC815、UBC826、UBC862、UBC 868、UBC888；馬兜鈴UBC825、UBC827、UBC836、UBC846、UBC848。

參考其他文獻(xiàn)[4-16]和《藥典》，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)引物濃度、Mg2+濃度、dNTP濃度、TaqDNA聚合酶濃度進(jìn)行4因素3水平篩選，由于本實(shí)驗(yàn)為遼寧省大學(xué)生創(chuàng)業(yè)基金項(xiàng)目（編號(hào)201510162000055）實(shí)驗(yàn)人員為本科生，實(shí)驗(yàn)條件不理想，知識(shí)儲(chǔ)備不足，實(shí)驗(yàn)操作中的誤差等，使得在得到譜圖方面結(jié)果不是太理想，最終篩選確定北馬兜鈴1最佳組合，即20 μL ISSRPCR反應(yīng)體系中含0.25 mmol/L引物、1.5 mmol/L Mg2+、1×PCR buffer、150 mmol/L dNTP和0.5 UTaqDNA聚合酶，基因組DNA為10 ng。擴(kuò)增反應(yīng)在Biometra PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，以30個(gè)循環(huán)94℃變性30 s，退火溫度為50℃1 min，72℃進(jìn)行延伸1 min，最后以溫度72℃進(jìn)行延伸10 min。遼細(xì)辛組合8為細(xì)辛最佳組合，即20 μL ISSRPCR反應(yīng)體系中含20 μL ISSR-PCR反應(yīng)體系中含0.50 mmol/L引物、1.5 mmol/L Mg2+、2×PCR buffer、250 mmol/L dNTP和2.0UTaqDNA聚合酶；最佳模板DNA濃度為10 ng；最佳退火溫度篩選確定為50℃。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明優(yōu)化確立的遼細(xì)辛和北馬兜鈴ISSR-PCR反應(yīng)體系是穩(wěn)定可靠的。

對(duì)影響馬兜鈴屬中藥—遼細(xì)辛和北馬兜鈴ISSRPCR反應(yīng)體系的主要因素進(jìn)行優(yōu)化篩選分析，篩選出了最佳實(shí)驗(yàn)組合。所以，對(duì)會(huì)受多種因素影響的ISSR-PCR反應(yīng)體系來說，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)可以彌補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的缺陷。ISSR分子標(biāo)記法是檢測(cè)遼細(xì)辛，北馬兜鈴遺傳多樣性的可靠方法，可檢測(cè)到豐富的遺傳多樣性信息。本實(shí)驗(yàn)所建立的ISSR-PCR反應(yīng)穩(wěn)定體系可以為遼細(xì)辛，北馬兜鈴品種鑒定、親緣關(guān)系分析、遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建等提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Primer Screening of Aristolochicaceae-Liao Asarum and Aristolochia mansoni by ISSR-PCR and Establishment and Orthogonal Optimization of Reaction System

ZHU Lianlian,ZHAO Rong*,LI Shihui,ZHAO Sihui,LIU Yangyang,LIANG Yifan
(Department of Pharmaceutical Botany Liaoning University of Traditonal Chinese Medicine,Liaoning Province,Dalian 116600,China)

ObjectiveTo explore the ISSR primers for identification of varieties and Aristolochia asarum.Methods The annealing gradient experiment for all 100 ISSR primers were screened using a variety of high polymorphism primers,5 primers with good repeatability,theoretically,these primers screening can achieve identification of existing species of Aristolochia contorta and asarum. Primer screening of Aristolochia ISSR-PCR,using the method of orthogonal experimental design,the primer concentration,Taq DNA polymerase concentration,Mg2+concentration and dNTP concentration of 4 factors and 3 levels to optimize the analysis of Aristolochia ISSR-PCR reaction system,and on the basis of template DNA concentration,annealing temperature of PCR reaction in the process of gradient detection.Results Preferably selected primers from samples,UBC815,UBC826,UBC862,UBC868,UBC825,UBC827, UBC888;aristolochic UBC836,UBC846,UBC848.The stability of the reaction system is stable and reliable.Conclusion he optimal combination of aristolochic acid,namely 20μL ISSR-PCR reaction system containing 1×PCR buffer,150Lmol/L dNTP,0.25Lmol/ L primer,1.5mmol/L Mg2+and 0.5UaqDNA polymerase.The PCR reaction conditions were denaturation at 94℃for 5 min, denaturation at 94℃for 30s,annealing at 50℃for 1 min,extension at 72℃for 1 min and extension at 72℃for 10 min.The optimal DNA concentration was 20ng and the optimal DNA concentration was 20ng.The optimal conditions were as follows:20μL ISSR-PCR reaction system containing 2×PCR buffer,250Lmol/L dNTP,0.50Lmol/L primer,1.5mmol/L Mg2+and 2.0UTaqDNA polymerase;And the optimum template DNA concentration was 10 ng,The annealing temperature was 50°C.

Aristolochia asarum;Aristolochia contorta;primer screeni;reaction system optimization

10.3969/j.issn.1672-2779.2017.10.060

1672-2779（2017）-10-0137-04

：張文娟本文校對(duì)：邢艷萍

2017-01-24）

遼寧省大學(xué)生創(chuàng)業(yè)基金項(xiàng)目【No.201510162000055】

*通訊作者：zhaoxiaorong1985@163.com