張麗先，魏悅，曹靜亞，王志堯，王學(xué)方，李曉*

(1. 河南科高中標(biāo)檢測(cè)技術(shù)有限公司，鄭州 450002; 2. 河南省科高植物天然產(chǎn)物開發(fā)工程技術(shù)有限公司，鄭州 450002)

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HPLC法同時(shí)測(cè)定連花柴芩可溶性粉中4種有效成分含量

張麗先1，魏悅1，曹靜亞1，王志堯2，王學(xué)方2，李曉2*

(1. 河南科高中標(biāo)檢測(cè)技術(shù)有限公司，鄭州 450002; 2. 河南省科高植物天然產(chǎn)物開發(fā)工程技術(shù)有限公司，鄭州 450002)

建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定連花柴芩可溶性粉中綠原酸、甘草苷、連翹酯苷A及黃芩苷的含量。采用Venusil XBP C18分析柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈～0.1%磷酸水為流動(dòng)相，1.0 mL/min的流速下進(jìn)行梯度洗脫，320 nm波長(zhǎng)處對(duì)4種成分進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果表明，在此色譜條件下，4種組分分離度良好，分別在3.28～26.24 μg/mL、3.17～25.36 μg/mL、6.08～48.64 μg/mL及8.81～70.48 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，加樣回收率均大于96.61 %，RSD均小于1.75 %。該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，重復(fù)性良好，可用于連花柴芩可溶性粉中綠原酸、甘草苷、連翹酯苷A及黃芩苷的同時(shí)測(cè)定。

連花柴芩可溶性粉；含量測(cè)定；高效液相色譜法

連花柴芩可溶性粉是針對(duì)禽病毒性呼吸道疾病、以“清熱解毒、宣肺止咳”為治療原則，通過臨床篩選、科學(xué)組方，研制的純中藥制劑，由連翹、山銀花、柴胡、黃芩、甘草等藥味組成。前期研究表明，連花柴芩可溶性粉具有明顯的抗炎解熱、止咳祛痰以及免疫增強(qiáng)等作用[1-2]，臨床用于畜禽病毒性呼吸道疾病的預(yù)防和治療，效果良好。連花柴芩可溶性粉藥味眾多，成分復(fù)雜，建立可靠的方法對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制勢(shì)在必行，多指標(biāo)含量測(cè)定質(zhì)量控制體系在增加復(fù)方制劑質(zhì)量可控性、保證產(chǎn)品質(zhì)量、確保制劑穩(wěn)定性、安全性及有效性方面具有重要現(xiàn)實(shí)意義[3]，本試驗(yàn)采用高效液相方法對(duì)連花柴芩可溶性粉中4種有效成分的含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，為該產(chǎn)品的質(zhì)量可控性提供了重要的技術(shù)依據(jù)，以期為進(jìn)一步建立其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供重要參考。

1 材 料

1.1 儀器 島津LC-20AT高效液相色譜儀(包括CMA-20A系統(tǒng)、LC-20AT二元高壓泵、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20A柱溫箱、SPD-M20A檢測(cè)器、LC Soulation工作站)，ME204梅特勒電子天平，島津AUW 220D十萬分之一天平，昆山KQ-500超聲儀。

1.2 試劑與樣品 3批連花柴芩可溶性粉(由河南科高植物天然產(chǎn)物開發(fā)工程技術(shù)有限公司提供，批號(hào)為20140324、20140325、20140326)。綠原酸對(duì)照品(批號(hào)為110753-200413)、甘草苷對(duì)照品(批號(hào)為111610-201106)、連翹酯苷A對(duì)照品(批號(hào)為111810-201001)、黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)為110715-200815)，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。甲醇、乙腈(色譜純)，磷酸(分析純)，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸5.12 mg，甘草苷4.96 mg，連翹酯苷A 9.50 mg，黃芩苷13.76 mg，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為102.4 μg/mL綠原酸，99.2 μg/mL甘草苷，190 μg/mL連翹酯苷A和275.2 μg/mL黃芩苷的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密移取上述儲(chǔ)備液3.2 mL至10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為32.77 μg/mL綠原酸，31.74 μg/mL甘草苷，60.8 μg/mL連翹酯苷A和88.06 μg/mL黃芩苷的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備方法 取本品0.2 g，置50 mL容量瓶中，加入50%甲醇，定容搖勻，超聲處理30 min，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm膜，得供試品溶液。

2.3 色譜條件 Venusil XBP C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈(B)～0.1%磷酸水溶液(A)為流動(dòng)相，梯度洗脫程序?yàn)椋?～10 min 9%～13.5% B，10～13 min 13.5%～16.2% B，13～25 min 保持16.2% B，25～27 min 16.2%～19.8% B，27～32 min 19.8%～21.6% B，32～38 min 21.6%～31.5% B，38～40 min 31.5%～36% B，40～55 min 36%～45.9% B，55～60 min 45.9%～75% B；流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性范圍 精密移取1、2、4、6、8 mL的混合對(duì)照品溶液，分別置于10 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度。按2.3項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖(圖1)，以峰面積 (y)對(duì)進(jìn)樣濃度(x)進(jìn)行線性回歸，得到4種有效成分的線性回歸方程(表1)。

2.4.2 精密度考察 取同一混合對(duì)照溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。綠原酸的RSD為0.64%，甘草苷的RSD為1.26%，連翹酯苷A的RSD為0.89%，黃芩苷的RSD為0.92%，表明儀器精密度良好，滿足檢測(cè)需要。

圖1 混合對(duì)照品的HPLC色譜圖 (1：綠原酸，2：甘草苷，3：連翹酯苷A，4：黃芩苷)Fig 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(1. chlorogenic acids, 2. liquiritin, 3. forsythoside A, 4. baicalin)

成分名稱保留時(shí)間/min標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍/(μg·mL-1)相關(guān)系數(shù)R2綠原酸11.621y=31921x-56783.28～26.240.9999甘草苷24.417y=6636x+993.17～25.360.9998連翹酯苷A26.146y=14754x-43436.08～48.640.9999黃芩苷41.790y=23201x+151988.81～70.480.9999

2.4.3 重復(fù)性考察 取20140324批次連黃柴芩粉，按2.2項(xiàng)平行制備供試品溶液6份，分別按2.3項(xiàng)中色譜條件測(cè)定綠原酸、甘草苷、連翹酯苷A和黃芩苷含量。結(jié)果綠原酸的含量分別為3.82、3.79、3.85、3.81、3.86、3.88 mg/g，甘草苷的含量為1.03、1.06、1.02、1.06、1.05、1.02 mg/g，連翹酯苷A含量為3.28、3.19、3.31、3.26、3.28、3.35 mg/g，黃芩苷含量為14.42、14.45、14.35、14.28、14.37、14.49 mg/g，RSD分別為0.88%、1.82%、1.63%、0.52%，RSD均小于1.82 %，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性考察 取同一份供試品溶液，分別于配制完成后0、4、8、12、24 h進(jìn)樣1次，記錄峰面積。結(jié)果綠原酸峰面積的RSD為1.98%，甘草苷峰面積的RSD為1.65%，連翹酯苷A 峰面積的RSD為1.24%，黃芩苷峰面積的RSD為0.87%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率 準(zhǔn)確稱取同一已測(cè)知含量的連花柴芩可溶性粉樣品6份，各0.1 g，置于50 mL量瓶中，分別準(zhǔn)確加入相應(yīng)量的綠原酸、甘草苷、連翹酯苷A及黃芩苷對(duì)照品溶液，加50%甲醇至刻度，搖勻，超聲30 min，放冷，定容并搖勻，過0.45 μm濾膜，得加樣回收率供試品溶液，進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算加樣回收率及RSD，結(jié)果見表2～表5。綠原酸、甘草苷、連翹酯苷A及黃芩苷平均回收率分別為97.44%、96.91%、96.61%、98.61%，RSD分別為1.52%、1.18%、1.75%、1.67%，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.4.6 專屬性考察 取按2.2項(xiàng)方法分別制備的連花柴芩可溶性粉去除山銀花、甘草、連翹、黃芩的陰性供試液，上述色譜條件下分別進(jìn)樣分析(圖2)，從圖中箭頭指向的相應(yīng)目標(biāo)物出峰處可看出，山銀花、甘草、連翹、黃芩陰性供試液分別在綠原酸、甘草苷、連翹酯苷A、黃芩苷出峰處無干擾，表明該方法可以用于4種有效成分定量。

2.5 樣品測(cè)定 取批號(hào)為20140324、20140325、20140326的3批連花柴芩可溶性粉，分別按2.1項(xiàng)制備3份平行供試品溶液，按上述方法進(jìn)行含量測(cè)定，HPLC色譜圖見圖3，外標(biāo)法計(jì)算綠原酸、甘草苷、連翹酯苷A及黃芩苷的含量，并計(jì)算其RSD，結(jié)果見表6，RSD值均小于2.0%。

表2 綠原酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab 2 Recovery results of chlorogenic acids (n=6)

表3 甘草苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Recovery results of liquiritin (n=6)

表4 連翹酯苷A加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Recovery results of forsythoside A(n=6)

表5 黃芩苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Recovery results of baicalin (n=6)

圖2 陰性對(duì)照HPLC色譜圖(a. 山銀花陰性，b.甘草陰性，c. 連翹陰性，d. 黃芩陰性)Fig 2 HPLC chromatograms of negative control. (a. Lonicera confusa negative control, b.Glycyrrhiza uralensis negative control, c. fructus forsythiae negative control, d. Scutellaria baicalensis negative control)

圖3 連花柴芩可溶性粉HPLC色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms of Lian-hua-chai-qin soluble power

批號(hào)綠原酸甘草苷連翹酯苷A黃芩苷含量/(mg·g-1)RSD/%含量/(mg·g-1)RSD/%含量/(mg·g-1)RSD/%含量/(mg·g-1)RSD/%201403243.841.521.041.863.280.9214.400.68201403255.600.671.521.695.261.3415.011.16201403268.400.791.961.787.241.2021.701.48

3 討論與小結(jié)

3.1 測(cè)定成分的選擇 復(fù)方制劑的藥效是多組分共同作用的結(jié)果，單一成分的含量不能整體綜合的反映復(fù)方制劑的質(zhì)量[4]，在選擇定量指標(biāo)時(shí)綜合考慮連花柴芩可溶性粉所含的活性成分、君藥的特征成分等特點(diǎn)[5-6]，有針對(duì)性的選擇了綠原酸、甘草苷、連翹酯苷A、黃芩苷4個(gè)指標(biāo)成分，以多方面監(jiān)控連花柴芩可溶性粉的質(zhì)量。

3.2 樣品前處理方法的選擇 提取方法的選擇，考察了回流法和超聲法，鑒于回流法操作煩瑣，且綠原酸受熱不穩(wěn)定[7]，采用操作簡(jiǎn)便的超聲法。對(duì)比了30%甲醇、50%甲醇和純甲醇為提取溶劑以及10、20、30 min超聲時(shí)間對(duì)4目標(biāo)分析物的提取效率，結(jié)果以50%甲醇為溶劑，超聲30 min效果最好。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 由4種目標(biāo)成分的紫外圖譜可得，綠原酸的最大吸收在326 nm，連翹酯苷A最大吸收波長(zhǎng)為328 nm，甘草苷最大吸收在276 nm處，次吸收波長(zhǎng)在312 nm，黃芩苷在277 nm處有最大吸收，次吸收在317 nm，綜合考慮色譜峰響應(yīng)值及分離度，最終選擇320 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 流動(dòng)相的選擇 基于綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷自身的酸堿性，酸性環(huán)境中3種組分良好的穩(wěn)定性能[7-9]，以及磷酸對(duì)甘草苷良好的分離效果[10]，本試驗(yàn)分別考察了甲醇-磷酸水、乙腈-磷酸水以及不同比例磷酸對(duì)指標(biāo)成分分離度的影響。以甲醇為有機(jī)相色譜峰基線不平穩(wěn)，對(duì)于指標(biāo)成分的準(zhǔn)確定量有影響，以乙腈為有機(jī)相可避免此問題；分別考察了0.05%、0.1%、0.2%、0.5%磷酸水溶液對(duì)色譜峰的分離效果，發(fā)現(xiàn)0.1%、0.2%磷酸下4指標(biāo)成分的分離度、色譜峰對(duì)稱性較好，考慮到色譜柱對(duì)大比例酸的耐受能力較弱，選擇0.1%磷酸水；最終流動(dòng)相選擇乙腈-0.1%磷酸水。

本試驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定連花柴芩可溶性粉中綠原酸、甘草苷、連翹酯苷A及黃芩苷含量的HPLC方法，該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，為控制連花柴芩可溶性粉質(zhì)量，確保產(chǎn)品批次間穩(wěn)定性，建立其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供重要參考，同時(shí)該方法可進(jìn)一步用于含相同藥味的其他復(fù)方制劑中綠原酸、甘草苷、連翹酯苷A及黃芩苷的定性定量檢測(cè)。

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(編輯：侯向輝)

Simultaneous Determination of Four Active Components in Lian-hua-chai-qin Soluble Power by HPLC

ZHANG Li-xian1, WEI Yue1,CAO Jing-ya1, WANG Zhi-yao2, WANG Xue-fang2, LI Xiao2*

(1. Cogotesting International Company Limited, Zhengzhou 450000, China;2. Henan Plant Natural-Products Development Engineering Technology Company, Zhengzhou 450002, China)

LI Xiao E-mail: 67430218@qq.com

A new HPLC method was firstly established for simultaneous determination of caffeotannic acid,

liquiritin, forsythoside A and baicalin in Lian-hua-chai-qin soluble power. Analysis was performed on a venusil XBP C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm). The mobile phase was considered of acetonitrile and 0.1% phosphoric acid solution, the flow rate set at 1.0 mL/min and the detected wavelength was 320 nm. Results showed four substances were separated effectively, caffeotannic acid, liquiritin, forsythoside A and baicalinin had good linearity over the range of 3.28～26.24 μg/mL, 3.17～23.36 μg/mL, 6.08～48.64 μg/mL and 8.81～70.48 μg/mL, respectively. The average recoveries were higher than 96.61% andRSDall below 1.75%. The method is accurate, rapid and repeatable, can be used for simultaneous determination of caffeotannic acid, liquiritin, forsythoside A and baicalin in Lian-hua-chai-qin soluble power.

Lian-hua-chai-qin soluble power; content determination; HPLC

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.5.06

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(152102110115)

張麗先，碩士，從事中藥質(zhì)量控制研究。

李曉。E-mail: 67430218@qq.com

2016-11-25

A

1002-1280 (2017) 05-0027-06

S859.2