高長玉,姜志梅,李博文,李冀*
(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江省小兒腦性癱瘓防治療育中心博士后科研工作站,黑龍江 佳木斯 154003)
六味地黃丸對腦癱模型大鼠腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)影響的實驗研究
高長玉1,2,姜志梅2,李博文1,李冀1*
(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江省小兒腦性癱瘓防治療育中心博士后科研工作站,黑龍江 佳木斯 154003)
目的:觀察六味地黃丸對腦癱模型大鼠腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響,探討其治療腦癱的作用機(jī)理。方法:采用孕鼠腹腔注射脂多糖(LPS)合并缺氧方法制作腦癱動物模型,通過對模型大鼠腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的檢測,觀察六味地黃丸的影響。結(jié)果:六味地黃丸能明顯提高腦癱模型大鼠腦組織中NE、DA、5-HT的含量,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:六味地黃丸能夠改善腦癱模型大鼠運動功能、感知覺障礙,其機(jī)理可能與調(diào)節(jié)腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平有關(guān)。
六味地黃丸;腦癱模型大鼠;單胺類神經(jīng)遞質(zhì)
腦性癱癱(cerebral palsy,CP)簡稱腦癱,是由于各種原因引起的嬰兒出生前后1個月內(nèi)顱腦損傷或發(fā)育缺陷所導(dǎo)致的姿勢異?;蛘哌\動障礙,屬于非進(jìn)行性的腦損傷[1]。目前,腦癱是兒童致殘的主要疾病之一,國內(nèi)外治療方法多以康復(fù)訓(xùn)練為主,配合中醫(yī)針灸、按摩、藥物,以及高壓氧、手術(shù)治療等。本研究通過觀察六味地黃丸對腦癱模型大鼠腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響,以期為中醫(yī)藥防治小兒腦癱提供實驗依據(jù)和新思路。
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
清潔級成熟Wistar大鼠雌性24只,雄性12只,體質(zhì)量200~220 g,均購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實驗動物中心,實驗動物許可證號:SCXK(黑)2013-001。
1.1.2 藥品與試劑
六味地黃丸(濃縮丸,北京同仁堂有限責(zé)任公司,批號15012157);脂多糖(LPS,血清型055:B5,美國SIGMA公司);酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢博士德公司);8%氧氣92%氮氣混合氣體(哈爾濱盛大氣體公司)。
1.1.3 實驗儀器
SpectraMax M2核酸酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司);BX51熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司);MIKRO22臺式離心機(jī)(德國赫提馳公司);自制缺氧箱。
1.2 實驗方法
1.2.1 造模方法
將雌雄大鼠置于明暗周期為12 h/12 h,溫度(21±1)℃環(huán)境中常規(guī)飼養(yǎng),自由進(jìn)食飲水。適應(yīng)環(huán)境1周后,于下午17時將大鼠按照雌雄比例2∶1合籠,第2天早晨7時觀察雌鼠陰栓情況,并且進(jìn)行陰道涂片的檢查,如果雌鼠陰道涂片查得精子或發(fā)現(xiàn)陰栓,則標(biāo)記為妊娠0 d,將懷孕雌鼠單獨飼養(yǎng)。隨機(jī)選取孕鼠15只分為造模組10只和對照組5只。造模組孕鼠在妊娠第16 d給予腹腔注射LPS(450 μg/kg),注射12 h后將其置于缺氧環(huán)境(8%O2和92%N2混合氣體)中2 h,6 h后再重復(fù)做一次。對照組孕鼠腹腔注射同等劑量生理鹽水[2-3]。待孕鼠自然分娩后,將生產(chǎn)的幼鼠同籠飼養(yǎng)。
1.2.2 動物模型的篩選
以9日齡正常大鼠為標(biāo)準(zhǔn),對其進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)測試,檢測的內(nèi)容包括動作姿勢、肌張力、異常外觀、異常動作和斜坡試驗等。測試完成后,將大鼠各項神經(jīng)行為學(xué)檢測評分結(jié)果作正態(tài)檢驗,以單側(cè)95%作為正常區(qū)間參考值范圍篩選模型大鼠[4]。大鼠神經(jīng)行為學(xué)檢測具體內(nèi)容和各項評分標(biāo)準(zhǔn)如下。
動作姿勢:采用改良的Tarlov分級評定法,根據(jù)大鼠的動作程度分為4分:大鼠完全癱瘓,不能做任何運動,記為0分;大鼠嚴(yán)重癱瘓,支撐不起身體,可以做原地小幅度活動,不能爬行,記為1分;大鼠不能支撐起身體,但是可以做短距離爬行移動,記為2分;大鼠可以支撐起身體進(jìn)行自主活動,但是爬行不穩(wěn),有跛行或者轉(zhuǎn)圈翻滾現(xiàn)象,記為3分;大鼠可以有力地支撐身體,行走自如,沒有動作行為障礙,記為4分。
肌張力:采用改良的Ashworth分級評定方法,根據(jù)大鼠肢體的活動范圍和關(guān)節(jié)屈伸的自由程度分為5分。大鼠活動靈活自如,無肌張力增強(qiáng),活動僵硬等現(xiàn)象,記為0分;大鼠有輕度的肌張力增高,在肢體屈伸過程中出現(xiàn)一些停頓,動作稍有滯澀,記為1分;大鼠肢體尚易屈伸,有輕度共濟(jì)失調(diào),有明顯的肌張力增強(qiáng),記為2分;大鼠活動困難,肢體屈伸動作僵硬,記為3分;大鼠有明顯的共濟(jì)失調(diào)表現(xiàn),肢體屈伸活動明顯受限,記為4分。
斜坡試驗:將大鼠頭向下倒置放于傾斜45°的木板上,開始記錄大鼠身體扭轉(zhuǎn)使頭部向上,并轉(zhuǎn)至與頭部原始方向夾角>135°時所需要的時間,以秒為單位。
斜板試驗出現(xiàn)異常的評定標(biāo)準(zhǔn):大鼠轉(zhuǎn)頭所需要的時間>正常組。
異常動作與異常外觀:異常動作有1)震顫;2)抽搐;3)痙攣扭動;4)動作反應(yīng)緩慢;5)無力吮乳。外觀異常有1)毛發(fā)稀疏;2)肢體殘缺。
異常標(biāo)準(zhǔn):上述情況出現(xiàn)一項即記為1分,結(jié)果≥1分即為異常。
經(jīng)過對66只9日齡正常大鼠神經(jīng)行為學(xué)測試,得出腦癱模型大鼠篩選標(biāo)準(zhǔn)見表1。
表1 腦癱模型大鼠篩選標(biāo)準(zhǔn)表(n=66)
根據(jù)表1標(biāo)準(zhǔn)對造模組大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)測試,篩選出模型大鼠。
1.2.3 實驗分組
選取模型大鼠30只隨機(jī)分為三組:中藥治療組、康復(fù)訓(xùn)練組、模型對照組,每組10只。另外再隨機(jī)選取10只正常等齡大鼠作為空白對照組。
1.2.4 治療方法
給藥方法:中藥治療組模型大鼠按體質(zhì)量灌服六味地黃丸混懸液,給藥劑量根據(jù)臨床常用量,按照人與大鼠體表面積進(jìn)行折算。連續(xù)灌胃給藥20天。模型對照組和空白對照組連續(xù)灌服20天等劑量生理鹽水。
康復(fù)訓(xùn)練方法:通過在籠內(nèi)釋放風(fēng)油精、白醋等有刺激性的氣味;放置各種顏色、不同形狀的物體,各種可以活動的“玩具”如跑輪、滑梯、小球、管道、臺階等進(jìn)行豐富環(huán)境的刺激與運動訓(xùn)練[5]。每日對大鼠進(jìn)行康復(fù)訓(xùn)練2次,每次30 min。同時多次抓取撫摸刺激大鼠,連續(xù)刺激訓(xùn)練20天??瞻讓φ战M和模型對照組大鼠分別飼養(yǎng)于無特殊刺激的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境之中,不做任何干預(yù)。
1.2.5 取材
用10%水合氯醛麻醉后快速斷頭處死大鼠,在冰盤上操作,取出腦組織,剝離腦膜及粗大血管,以冰生理鹽水沖洗,稱重。
1.2.6 組織勻漿
稱重后立即置于9倍體積預(yù)冷生理鹽水中,使用組織搗碎勻漿器在低溫環(huán)境中將組織打碎,震蕩制作勻漿。在低溫離心機(jī)中離心、取上清液,置于-80℃冰箱待測。
1.3 觀察指標(biāo)
使用酶聯(lián)免疫試劑盒,檢測所取材的各組大鼠腦組織中去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)的含量。
1.4 統(tǒng)計學(xué)處理
各組大鼠腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量檢測結(jié)果見表2~4。
表2 腦組織DA含量檢測結(jié)果
注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,▲P<0.05;與康復(fù)組比較,●P<0.05。
由表2可見,模型對照組與空白對照組比較,大鼠腦組織中DA含量顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型對照組比較,康復(fù)訓(xùn)練組和中藥治療組大鼠腦組織中DA含量顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與康復(fù)訓(xùn)練組比較,中藥治療組大鼠腦組織中DA含量顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
表3 腦組織5-HT含量檢測結(jié)果
注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,▲P<0.05;與康復(fù)組比較,●P<0.05。
由表3可見,模型對照組與空白對照組比較,大鼠腦組織中5-HT含量顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型對照組比較,中藥治療組大鼠腦組織中5-HT含量顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與康復(fù)訓(xùn)練組比較,中藥治療組大鼠腦組織中5-HT含量顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
表4 腦組織NE含量檢測結(jié)果
注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,▲P<0.05;與康復(fù)組比較,●P<0.05。
由表4可見,模型對照組與空白對照組比較,大鼠腦組織中NE含量顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型對照組比較,康復(fù)訓(xùn)練組和中藥治療組大鼠腦組織中NE含量顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與康復(fù)訓(xùn)練組比較,中藥治療組大鼠腦組織中NE含量顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
小兒腦癱的直接病因是在腦發(fā)育成熟之前,由腦損傷和/或發(fā)育缺陷所導(dǎo)致。臨床表現(xiàn)以運動障礙和姿勢異常為主,同時伴有認(rèn)知、感覺、知覺、交流以及行為障礙[6]。腦損傷和腦發(fā)育缺陷發(fā)生的時間可以劃分為三個階段:出生前、圍生期、出生后。近來認(rèn)為發(fā)生于出生前的腦癱占70%~80%,其中原因不明的占相當(dāng)大的比例[7]。中醫(yī)學(xué)雖無腦癱之病名,但是古代醫(yī)家對此已有深刻認(rèn)識,將其歸為“五遲”“五軟”“五硬”等范疇[8-11]。認(rèn)為其發(fā)病多因先天稟賦不足、精髓不允,腎氣虧虛所致,治療當(dāng)補腎填精益髓以強(qiáng)壯筋骨為核心法則,方藥以六味地黃丸為代表。
單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要遞質(zhì),其主要功能為參與調(diào)解肌緊張、軀體運動、學(xué)習(xí)與記憶、情緒、精神活動以及內(nèi)分泌活動等[12]。本研究結(jié)果表明,模型對照組大鼠腦組織中NE、DA、5-HT的含量明顯降低,灌服六味地黃丸后,含量明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),說明六味地黃丸可通過調(diào)解單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平來改善腦癱模型大鼠運動功能、感知覺障礙等癥狀,這可能是六味地黃丸治療腦癱的作用機(jī)制之一。
[1] 李靜,樊祥偉,高晶,等.電針刺激頭部運動區(qū)對腦癱鼠大腦磁共振彌散張量纖維束成像的影響[J].中醫(yī)藥信息,2015,32(6):63-65.
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黑龍江省博士后資助項目(No.LBH-Z13190);黑龍江省研究生創(chuàng)新科研基金項目(2015)
高長玉(1971-),男,教授,方劑學(xué)博士,碩士研究生導(dǎo)師,現(xiàn)為黑龍江省小兒腦性癱瘓防治療育中心博士后科研工作站在站工作人員,主要從事方劑學(xué)的教學(xué)與科研工作。
李冀*(1960-),男,教授,博士研究生導(dǎo)師,主要研究方向:方劑配伍規(guī)律及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。
2016-10-20
R285.5
A
1002-2406(2017)03-0055-03
修回日期:2016-11-15