趙龍，徐京育，張超越，臧萌

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.佳木斯大學醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154007)

芪桂益脈靈干預急性心肌缺血再灌注大鼠模型炎癥因子ICAM-1，VCAM-1和p38MAPK通路的實驗研究

趙龍1，徐京育2，張超越1，臧萌3*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.佳木斯大學醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的:觀察芪桂益脈靈(QGYML)對大鼠急性心肌缺血再灌注損傷模型血管細胞黏附因子-1(VCAM-1)和內皮細胞間黏附分子-1(ICAM-1),p38MAPK通路的影響。方法：50只大鼠隨機分為空白組、假手術組、單純缺血再灌注組、QGYML低劑量組、QGYML高劑量組5組，灌胃1 h后，結扎左冠狀動脈前降支，結扎60 min，再灌注180 min，測定VCAM-1、ICAM-1、p38、p-p38蛋白表達。結果：各組p38蛋白表達基本一致，差異無統計學意義(P>0.05)；單純缺血再灌注組與假手術組比較,VCAM-1、ICAM-1、p-p38蛋白表達升高(P<0.05)，差異有統計學意義；灌藥組與單純缺血再灌注組比較，VCAM-1、ICAM-1、p-p38蛋白表達明顯降低(P<0.05)，差異有統計學意義，高劑量組效果更佳。結論：芪桂益脈靈可以下調VCAM-1和ICAM-1在內皮細胞膜上的表達，抑制p38MAPK通路，對急性心肌缺血再灌注損傷有抑制作用。

芪桂益脈靈；細胞間黏附分子-1；血管細胞黏附分子-1；再灌注損傷；p38絲裂原活化蛋白激酶

血運重建的發(fā)展和成熟雖能重建冠脈血流供應，但患者反復心絞痛發(fā)作、進行性心功能惡化以及患者心肌缺血現象持續(xù)存在，說明大血管的血運重建并不代表心臟微循環(huán)的改善以及心臟再灌注的成功，不能完全解決微循環(huán)障礙所帶來的問題，然而微循環(huán)在心臟供血過程中發(fā)揮著重要的作用，其結構和功能的正常與否也直接關系到心臟的功能和代謝[1-8]。本實驗前期研究證實[7-9]，芪桂益脈靈能夠減小心肌梗死面積，清除氧自由基的產生，提高心肌抗氧化能力，降低鉀離子通道的開放的時間和概率，抑制心肌細胞的凋亡，發(fā)揮對缺血再灌注心肌的保護作用。本實驗在以往研究的基礎上，通過觀察芪桂益脈靈對急性心肌缺血再灌注損傷后VCAM-1、ICAM-1以及p38信號通路的影響，進一步探討其作用機制，為以后的應用提供依據。

1 材料

1.1 實驗動物及分組

健康雄性SD大鼠(體質量200～250 g，許可證號：SCXK(黑)2013-004，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供)50只。隨機分為5組，即空白組、假手術組、單純缺血再灌注組、芪桂益脈靈低劑量組、芪桂益脈靈高劑量組，常規(guī)飼養(yǎng)1周后用于實驗。

1.2 試劑

芪桂益脈靈(黨參、黃芪、三七、炒酸棗仁、苦參、龍齒、黃連、桂枝、麥門冬、五味子)(江陰天江藥業(yè)有限公司)；Sc-101759(兔一抗)試劑盒、Sc-7149(兔一抗)試劑盒、Pv-9001(兔二抗)試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)酶聯免疫分析試劑盒(北京誠林生物科技有限公司)。

1.3 實驗儀器

電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；DH-150型小動物呼吸機(浙江大學醫(yī)學儀器廠)；ECG-1150型心電機(上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司)；318型洗板機(上海三科儀器有限公司)；低溫冰箱(日本三洋公司)；NiKon E200光學顯微鏡(日本)；冰凍切片機；DK-8B型電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設備有限公司)；ELX808全自動酶標儀(上海啟步生物科技有限公司)；低溫離心機(日本三洋公司)。

2 方法

大鼠用20%烏拉坦(1 g/kg)進行腹腔麻醉，然后將麻醉后的大鼠固定于手術臺上行心電檢測，氣管切開，連小動物呼吸機，潮氣量為12 ml，呼吸頻率為90次/min，呼吸比為1∶1。從胸骨左緣3、4肋間處鈍性分離皮膚和肌肉，剪開胸骨，輕輕分離心包膜，充分的暴露心臟；在肺動脈圓錐和左心耳的交界處，于淺層心肌下穿過一條絲線，結扎左冠狀動脈前降支，兩端穿一條聚乙烯塑料管，末端用小動脈夾固定，結扎后將心臟送回胸腔。連續(xù)記錄冠狀動脈前降支結扎前后及再通后心電圖。空白組：只開胸，不穿線，不結扎；假手術組：開胸、只穿線但不結扎；單純缺血再灌注組：末次灌藥后1 h行左主冠狀動脈結扎60 min，再灌注180 min；芪桂益脈靈高劑量組、芪桂益脈靈低劑量組造模方法與單純缺血再灌注組相同。

模型成功標準:結扎后心電圖S-T段拱背抬高或QRS波增高、增寬與T波融合；松開小動脈夾后,ST段下降1/2以上。

3 實驗指標檢測

3.1 VCAM-1、ICAM-1檢測

造模成功后，開腹暴露腹主動脈，采血5 ml，低溫離心后取上層血清按照酶聯免疫試劑盒檢測步驟測定。

3.2 p38、p-p38檢測

實驗結束后，立即處死大鼠，摘取心臟，用生理鹽水沖洗血漬，浸泡于10%的甲醛中固定備用。

HE染色：取出固定在10%甲醛中的心臟組織，用酒精梯度脫水，石蠟包埋，冰凍切片機切片(厚約5 μm)，HE染色，封片，在光鏡下觀察(結果見圖1)。

免疫組化法檢測：具體實驗步驟參照文獻[5]進行。在400×光鏡下拍攝切片圖像，每張圖片選取3個不重疊視野計算平均陽性百分比。詳見圖2～3。

3.3 統計學處理

4 實驗結果

4.1 VCAM-1和ICAM-1結果比較

表1顯示，假手術與空白對照組相比，ICAM-1，VCAM-1含量并無明顯差異(P>0.05)；冠脈結扎組與空白組、假手術組相比，ICAM-1、VCAM-1含量有統計學意義(P<0.05)；用藥組(QGYML低劑量、QGYML高劑量)與單純缺血再灌注組相比，ICAM-1，VCAM-1含量均降低，差異有統計學意義(P<0.05),表明QGYML具有抗心肌缺血損傷，保護血管內皮的作用，其中高劑量組效果更佳。

4.2 各組缺血再灌注大鼠心肌組織病理形態(tài)學改變

單純缺血再灌注組，心肌纖維排列紊亂，部分區(qū)域有斷裂，細胞破壞嚴重，心肌纖維腫脹明顯，細胞間質水腫、增寬，有少量炎癥細胞；芪桂益脈靈組與單純缺血再灌注組相比心肌纖維排列基本整齊，炎癥細胞浸潤減少，間質腫脹不明顯，其中高劑量組改善更為顯著。

4.3 p38MAPK免疫組化結果

各組大鼠心肌組織中p38表達比較穩(wěn)定，無統計學意義(P>0.05)；假手術組與空白組相比，p-p38的蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)；冠脈結扎組與空白組對比，p-p38的蛋白表達水平增加顯著，差異具有統計學意義(P<0.05)；芪桂益脈靈低劑量組、芪桂益脈靈高劑量組與單純缺血再灌注組相比，p-p38的表達降低，差異具有統計學意義(P<0.05)；芪桂益脈靈高劑量組與芪桂益脈靈低劑量組比較，p-p38蛋白表達降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。結果見表1。

表1 各組ICAM-1、VCAM-1、p38、p-p38含量比較

注：與空白組比較,#P<0.05;與假手術組比較，△P<0.05;與單純缺血再灌注組比較，○P<0.05;與芪桂益脈靈低劑量組比較,▽P<0.05。

圖1 HE染色組圖(400×)

圖2 p38組圖(400×)

圖3 p-p38組圖(400×)

5 討論

目前研究認為，在急性缺血再灌注損傷中，內皮細胞是關鍵，黏附分子是導致內皮損傷的重要因素，而黏附分子表達的調控，絲裂原活化蛋白激酶信號通路起到了重要的作用[9-11]。黏附分子選擇素使白細胞與微血管內內皮形成疏松的結合，之后在炎癥因子VCAM-1和ICAM-1的作用下，與微血管內皮結合牢固，同時ICAM-1可引起細胞骨架的改變，有利于炎性細胞向局部組織浸潤，損傷微血管內皮細胞，造成心肌細胞的損傷[12-16]。當缺氧等一系列刺激下，使得p38MAPK被磷酸化激活p-p38，促進內皮細胞表達黏附分子VCAM-1、ICAM-1，造成內皮細胞的損傷；此外p38還可以使MAPKAP2磷酸化，激活炎性細胞因子基因TNF-α，TNF-α也可以反向激活p38信號通路，加重炎癥反應。由此可見抑制p38信號通路的激活，對保護心肌細胞意義重大[17-18]。

本實驗通過觀察芪桂益脈靈對急性缺血再灌注損傷大鼠模型p38信號通路和炎性因子VCAM-1及ICAM-1的影響。結果表明芪桂益脈靈能夠減輕炎癥反應，減輕炎性浸潤，抑制p38信號通路的激活，減輕心肌的壞死灶，改善心肌的病理學改變，保護損傷心肌。

芪桂益脈靈是導師徐京育教授臨床多年的經驗總結，臨床頗有效驗。該方由桂枝、黃芪、三七、麥門冬、五味子等10余味藥物組成，方中桂枝辛、甘、溫，能溫通經脈,助陽化氣，強心；黃芪補氣諸藥之最，能益氣補心，清除自由基，促進機體新陳代謝，擴張血管，促進微循環(huán)[19]；三七能夠活血、化瘀、定痛，能夠抗血小板聚集和溶栓，此外，三七還可以降低心肌的耗氧量，提高氧利用率；麥門冬可養(yǎng)陰清心除煩，提高免疫功能，增加冠脈流量，對于心肌缺血具有明顯的保護作用；五味子益氣、生津、寧心，能增加機體的免疫功能，降低心肌耗氧。諸藥相互配伍，恰中該病的病機，發(fā)揮益氣活血，化瘀通脈之功效。

實驗研究結果顯示，急性缺血再灌注損傷后大鼠心肌組織中VCAM-1、ICAM-1和p-p38蛋白表達明顯高于空白組和假手術組(P<0.05)，芪桂益脈靈組VCAM-1、ICAM-1和p-p38蛋白表達濃度明顯低于模型組(P<0. 05)，其中芪桂益脈靈高劑量組比低劑量組表達濃度更低。實驗證實了芪桂益脈靈能通過減輕炎癥反應，抑制p38MAPK信號通路，抑制細胞凋亡，達到抗心肌缺血損傷的作用。

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Experimental Study of Qigui Yimailing on ICAM-1,VCAM-1 and p38 Pathway in Rat Models with Acute Myocardial Ischemia-reperfusion Injury

ZHAO Long1,XU Jing-yu2, ZHANG Chao-yue1,ZANG Meng3*

(1.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China;2.The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China;3.Jiamusi University,Jiamusi 154007,China)

Objective: To study the effect of QGYML on ICAM-1,VCAM-1 and p38 pathway in rat models with acute myocardial ischemia-reperfusion injury.Methods:50 SD male rats were randomly divided into normal group(N),sham operation group(SH),pure ischemia reperfusion group(I/R),QGYML low dose group(QL) and QGYML high dose group(QH). Fill the stomach after one hour; ligate the left anterior descending artery for 60 minutes with 180 minutes of reperfusion; determine VCAM 1, ICAM - 1, p38 and p-p38 protein expressions.Results:There was no statistically significant difference of p38(P>0.05). I/R group was compared with SH group and VCAM-1,ICAM-1 and p-p38 expressions were increased.Compared with I/Q,in QGYML group VCAM-1,ICAM-1 and p-p38 were decreased significantly(P<0.05),and the effect of QH was better.Conclusion:QGYML can cut VCAM-1 and ICAM-1 in endothelial cell membranes, inhibit p38MAPK pathway and inhibit acute myocardial ischemia-reperfusion injury.

Qigui Yimailing;ICAM-1;VCAM-1;Reperfusion injury;p38MAPK

《中醫(yī)藥信息》2016年版中國科技期刊引證報告(擴刊版)

黑龍江省自然科學基金項目(No.H201326)

趙龍(1990-),男，黑龍江中醫(yī)藥大學中醫(yī)內科學心血管專業(yè)碩士研究生。

臧萌*(1989-)，男，佳木斯大學醫(yī)學院2014級外科學專業(yè)碩士研究生。

2016-11-22

R285.6

A

1002-2406(2017)03-0051-04

修回日期：2016-12-03