馬偉，劉振鵬，孫麗英，張開(kāi)雪，徐姣，溫東，趙銳，劉秀波

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

454測(cè)序方法對(duì)人參種子內(nèi)生真菌種類的研究

馬偉，劉振鵬，孫麗英*，張開(kāi)雪，徐姣，溫東，趙銳，劉秀波

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：研究人參內(nèi)生真菌的生物多樣性。方法：采用454測(cè)序技術(shù)對(duì)人參種子內(nèi)生真菌進(jìn)行分析。結(jié)果：測(cè)試的樣品中,樣品4與其他樣品內(nèi)生真菌區(qū)系差異較大，而其他四份樣品之間存在的差異較小。子囊菌門真菌在人參種子內(nèi)生真菌中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，平均百分比為32.7%；針對(duì)歸類到屬而言，共鑒定到屬的種類為46個(gè)屬，其中鐮刀菌屬序列數(shù)所占比列最大，為優(yōu)勢(shì)菌屬。結(jié)論：人參種子中的內(nèi)生真菌具有多樣性，內(nèi)生菌的分布在種子個(gè)體中也存在差異性。

人參種子；454測(cè)序技術(shù)；宏基因組學(xué)；內(nèi)生菌；生物多樣性

人參是名貴中藥材[1-2]，藥食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值并存，人們對(duì)于人參上品的追求，自古有之。清代以后，東北地區(qū)已成為我國(guó)野生人參的主要產(chǎn)地，更有“東北三寶”之稱，可見(jiàn)野山參的珍貴性。

內(nèi)生菌與寄主植物種類有一定的專一性[3-5]。這種專一性可能是因?yàn)閮?nèi)生菌在人參的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起到了重要作用[6]。目前研究可以證明植物內(nèi)生菌可以括加快植物生長(zhǎng)、固氮、提高寄生植物抗病、蟲害、抗鹽、旱等作用[7-13]。

454測(cè)序法作為一種高通量的測(cè)序方法,近年來(lái)已被廣泛應(yīng)用于內(nèi)生菌測(cè)序等微生物研究中。人參作為一種名貴中藥材，內(nèi)生菌能夠影響人參的生長(zhǎng)發(fā)育，454測(cè)序技術(shù)能夠?qū)θ藚?nèi)生菌有更加深入的了解，有利于人參的進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 植物材料

取樣人參種子來(lái)自撫松人參種植基地，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院馬偉研究員課題組鑒定，保存于-80℃冰箱中待用。

1.2 DNA的提取，PCR和焦磷酸測(cè)序

采用天根植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA 提取。在紫外分光光度計(jì)條件下對(duì)DNA進(jìn)行濃度及純度檢測(cè)，然后根據(jù)濃度檢測(cè)結(jié)果，在電壓120 V，電泳時(shí)間約20 min的條件下，采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA樣品的完整性。

以DNA為模板，對(duì)內(nèi)生真菌18S V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序，真菌18S V4區(qū)全長(zhǎng)rDNA通用引物序列為F：5′-GGCAAGTCTGGTGCCAG-3′；R：5′-ACGGTATCTRATCRTCTTCG-3′，合成融合引物為：F：5′-454adapter-mid-GGCAAGTCTGGTGCCAG-3′；R：5′-454adapter-ACGGTATCTRATCRTCTTCG-3′，引物PAGE純化。本實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增條件：循環(huán)數(shù)為27cycles，模板為2 μl，退火溫度55℃。

使用AMPure Beads或膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，使用PicoGreen dsDNA Assay Kit在酶標(biāo)儀上對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量。emPCR擴(kuò)增，通過(guò)乳液滴定或測(cè)序滴定確定emPCR擴(kuò)增中所需的DNA文庫(kù)的量，使用DNA Capture Beads將DNA文庫(kù)捕獲，乳化，擴(kuò)增，回收DNA Capture Beads，富集含DNA文庫(kù)的DNA Capture Beads。Roche 454 GS FLX+測(cè)序儀上機(jī)測(cè)序。本實(shí)驗(yàn)的454測(cè)序工作由中國(guó)上海派森諾生物公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 原始數(shù)據(jù)的整理、過(guò)濾及質(zhì)量評(píng)估

為了保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)有效序列運(yùn)用Qiime[14](version 1.7.0，http://qiime.org/)進(jìn)行序列過(guò)濾和運(yùn)用mothur[15](version 1.31.2，http://www.mothur.org/)軟件中uchime[16]的方法去除嵌合體序列，得到最終用于后續(xù)分析優(yōu)質(zhì)序列。

2.2 組裝結(jié)果

五個(gè)樣品組裝的有效序列共151 694條，其中優(yōu)質(zhì)序列占78.37%，共118 879條。五個(gè)樣品中樣品2的有效序列最多為42 263條，樣品1的有效秩序列中含有優(yōu)質(zhì)序列的比例最高為80.58%。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。組裝產(chǎn)生的151 694條序列的長(zhǎng)度分布在171～731 bp之間，集中分布的范圍在333～704 bp之間，其中含有序列最多的長(zhǎng)度是561 bp，此長(zhǎng)度含有18 801條有效序列。具體見(jiàn)圖1。

表1 樣品序列數(shù)統(tǒng)計(jì)表

2.3 OTU聚類分析

OUT聚類分析采用Qiime軟件平臺(tái)，在Qiime中調(diào)用uclust[17]的方法對(duì)優(yōu)質(zhì)序列按相似度0.97進(jìn)行聚類，對(duì)每類序列中的最長(zhǎng)序列進(jìn)行OTU的聚類分析；在Qiime中采用blast的方法對(duì)五個(gè)樣品的序列信息進(jìn)行比對(duì)，獲得每個(gè)OTU分類學(xué)信息。

圖1 優(yōu)質(zhì)序列長(zhǎng)度分布圖

圖2 OTU 代表序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖3 OTU維恩圖

通過(guò)對(duì)五個(gè)樣品的151 694條序列進(jìn)行分類，共分為149個(gè)OTU，對(duì)這149個(gè)OTU構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖2。

由圖3可知，共形成149個(gè)OTU分類單元，其中五個(gè)樣品共有OTU有17個(gè)。說(shuō)明5個(gè)樣品間內(nèi)生真菌區(qū)系差異較小。樣品4有25個(gè)不同于其他四份樣品的OTU，說(shuō)明樣品4的物種豐富度較高。

2.4 基于物種豐度分析結(jié)果

2.4.1 稀釋曲線分析

稀釋曲線[18]是指從每個(gè)樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的序列，統(tǒng)計(jì)這些序列所代表的OTU數(shù)目，以隨機(jī)抽取的序列數(shù)與OTU數(shù)來(lái)構(gòu)建的曲線。

圖4 樣品稀釋曲線

由圖4可知，隨著對(duì)樣品測(cè)序深度的增加，各樣品曲線增長(zhǎng)速度變緩，逐漸趨于飽和，數(shù)據(jù)量增加對(duì)于獲得新的OUT效果已經(jīng)不是很明顯，說(shuō)明曲線的數(shù)據(jù)量合理可信。有圖可知樣品1、2、3、5差異較小。而與樣品4的區(qū)別較明顯。

2.4.2 豐度分布曲線

樣品豐度分布曲線將試驗(yàn)樣品的物種分豐富度以及均勻度等信息反映出來(lái)，通過(guò)對(duì)比樣品之間的信息，能夠得出樣品之間的差異性。

圖5 樣品豐度分布曲線

由圖5可知：樣品1的物種豐富度最差；樣品2、3、5的物種豐富度和均勻程度相近；樣品4的物種豐富度和均勻度最好。

表2 生物多樣性指數(shù)表

注：Chao，Ace， Shannon，Simpson：分別表示各個(gè)指數(shù)；*_lci *_hci ：分別表示統(tǒng)計(jì)學(xué)中的下限和上限值。

2.4.3 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性指數(shù)是反映豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)。因此，我們對(duì)內(nèi)生菌的種類數(shù)目(豐富度)以及種類中個(gè)體分配上的均勻性作為Alpha多樣性分析的指數(shù)。即為群落豐富度(Community richness)的指數(shù)和群落多樣性(Community diversity)的指數(shù)。

由表2可知：樣品1的物種豐富度最差；樣品2、3、5的物種豐富度和均勻程度相近；樣品4的物種豐富度和均勻度最好。

2.5 基于群落結(jié)果分析結(jié)果

2.5.1 樣品群落組成分析

根據(jù)OTU表的結(jié)果，可以得到各個(gè)樣品在分類水平上群落結(jié)構(gòu)的比例情況，反映樣品在不同分類學(xué)水平上的群落結(jié)構(gòu)。

樣品群落分析使用統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析方法，觀測(cè)樣品在不同分類水平上的群落結(jié)構(gòu)。樣品群落組成分析通常使用較直觀的餅圖或柱狀圖等形式呈現(xiàn)[19]。對(duì)OTU表利用Qiime生成不同分類水平上(門、綱、目、科、屬、種)的物種豐度表和多樣品物種分布圖。

圖6 多樣品物種分布圖

由圖6可知，五份樣品中均含有子囊菌門真菌和接合菌門真菌，在樣品3中含有擔(dān)子菌門，而在其他樣品中未發(fā)現(xiàn)。子囊菌門真菌在各樣品內(nèi)生真菌所占百分比的范圍是8.3%～64.8%，平均百分比為32.7%，表明子囊菌門真菌在人參種子內(nèi)生真菌中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。由于目前對(duì)真菌的研究較少，導(dǎo)致結(jié)果中未被鑒定的真菌平均占到總數(shù)的67%，表明還有很多內(nèi)生真菌未被發(fā)現(xiàn)，有待接下來(lái)進(jìn)一步的研究。

2.5.2 含進(jìn)化樹(shù)的物種豐度圖分析結(jié)果

將實(shí)驗(yàn)中得到的內(nèi)生菌，根據(jù)NCBI提供的分類信息學(xué)方法，采用進(jìn)化樹(shù)的方式對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，利用應(yīng)用軟件MEGAN5[20](http://ab.inf.uni-tuebingen.de/software/megan/)得到物種進(jìn)化及豐度信息圖。由此可得到各內(nèi)生菌的進(jìn)化關(guān)系及豐度的差異性。

圖7 物種進(jìn)化及豐度信息圖

由圖7可知，在綱級(jí)別分類上，在座囊菌綱 (Dothideomycetes)中樣本4的序列數(shù)最多，糞殼菌綱 (Sordariomycetes)和銀耳綱 (Tremellomycetes)中樣本3的序列數(shù)最多。在屬級(jí)別分類上，在鐮刀菌屬(Fusarium)中的序列數(shù)最多且五份樣品中均有分布，樣品4和樣品5中序列數(shù)所占比重最大，其次為樣品1、樣品2，樣品3在鐮刀菌屬中所占比例最?。活^囊菌(Cephalotheca)和柄孢殼菌屬(Podospora)中的序列數(shù)較多且各樣品之間序列數(shù)所占比例差異較小。

2.5.3 聚類分析結(jié)果

Heat map(熱點(diǎn)圖)根據(jù)需要將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，將分析結(jié)果用heat map圖來(lái)進(jìn)行呈現(xiàn)，通過(guò)heat map圖來(lái)反映多個(gè)樣品群落組成結(jié)構(gòu)的相似性和差異性。圖8表示在屬的水平上，五份樣品的真菌群落大致相似，但在這些樣品的種類略有不同。圖中一個(gè)色塊代表一個(gè)樣品的一個(gè)屬的豐度，縱向是樣品的聚類情況，反映多個(gè)樣品在屬水平上群落組成的相似性。

圖8 聚類分析的熱圖

由圖8可知，五份樣品的相似程度總體較高。樣品1、樣品2和樣品5三份樣品相似程度最高，而樣本3中沃德霉屬(Wardomyces)的豐度較高，樣本4中白赤殼屬(Haematonectria)的豐度較高。這些結(jié)果可能是由于樣品的個(gè)體差異造成的。

3 結(jié)論

五份樣品中，都存在內(nèi)生菌的多樣性，而鐮刀菌屬序列數(shù)所占比列最大，為優(yōu)勢(shì)菌屬。樣品中各菌屬的分布及豐度不同，說(shuō)明內(nèi)生菌在人參種子的分布存在差異性，鐮刀菌屬(Fusarium)中的序列數(shù)最多且五份樣品中均有分布，且各樣品中的分布差異較大，有可能是受到樣品或者種子生存環(huán)境的影響；頭囊菌(Cephalotheca)和柄孢殼菌屬(Podospora)中的序列數(shù)較多且各樣品之間序列數(shù)所占比例差異較小，可能是人參種子的專一性決定的，受到的影響較小。

4 討論

人參為名貴中藥材，各樣品人參種子內(nèi)生真菌存在大致相同，說(shuō)明人參種子內(nèi)的內(nèi)生菌可能為專一性菌屬，在人參的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起到了重要作用。本實(shí)驗(yàn)材料采用來(lái)自吉林撫松人參種植基地的人參種子，黑龍江人工種植人參的種子大部分來(lái)自吉林，由于經(jīng)費(fèi)的原因沒(méi)有進(jìn)行更多種子內(nèi)生菌的測(cè)序工作。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)454測(cè)序技術(shù)對(duì)人參種子進(jìn)行內(nèi)生菌進(jìn)行鑒別，是對(duì)課題組前期研究工作的驗(yàn)證與補(bǔ)充。課題組前期在PDA培養(yǎng)基，高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基上對(duì)人參葉子進(jìn)行內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，分離出人參內(nèi)生真菌18種，青霉屬所占比例居多，5種，枝頂孢屬4種，枝孢屬、毛殼屬各2種，曲霉屬、棒囊殼屬、黑球孢屬、盾殼霉屬、Zymonema各1種。與人參種子測(cè)序分析得到46個(gè)屬相比較，測(cè)序得到的內(nèi)生真菌屬的覆蓋面廣，且二者未見(jiàn)重復(fù)的種屬，其原因可能由人工分離方法的有限性，造成分離菌株總數(shù)較少，不能完全將人參內(nèi)生真菌分離出來(lái)；這也是內(nèi)生真菌寄主專一性所造成的。深入研究?jī)?nèi)生菌的生物多樣性分析有利于進(jìn)一步了解內(nèi)生菌對(duì)人參的生長(zhǎng)影響。

[1] 張薇.人參根際土壤真菌與內(nèi)生真菌的多樣性及人參皂苷生物催化活性菌株的篩選[D].大連:遼寧師范大學(xué),2011:2.

[2] 張中朋,劉張林.2007年我國(guó)人參出口形勢(shì)分析及展望[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥,2008,10(3):44-45.

[3] 陳暉奇.茶樹(shù)內(nèi)生真菌的初步研究[D].福州:福建師范大學(xué),2007:11-12.

[4] 高劍.內(nèi)生真菌多樣性及其生態(tài)分布[D].湛江:廣東海洋大學(xué),2013:5-6.

[5] 袁志林.疣粒野生稻(Oryza granulate)內(nèi)生真菌資源挖掘、系統(tǒng)發(fā)育分析和功能初探[D].杭州:浙江大學(xué),2010:6-7.

[6] 吳令上.南方紅豆杉內(nèi)生真菌多樣性、次生代謝產(chǎn)物及其與宿主的相關(guān)性研究[D].上海:第二軍醫(yī)大學(xué),2012:71.

[7] 王衛(wèi)霞.新疆幾種典型荒漠植物根際微生物特征及內(nèi)生固氮菌的分離、促生性能研究[D].烏魯木齊:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué),2009:8-9.

[8] 陳寶.內(nèi)生細(xì)菌促進(jìn)東南景天Zn/Cd的提取效應(yīng)及其機(jī)制研究[D].杭州:浙江大學(xué),2015:30-31.

[9] 周永強(qiáng),程玉鵬,劉丹丹,等.藥用植物內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的活性研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息,2014,31(3):158-161.

[10] 程玉鵬,李天聰,林進(jìn)華,等.內(nèi)生真菌與藥用植物宿主間的交流[J].中醫(yī)藥信息,2016,33(6):120-122.

[11] 楊中鐸,魏博,薛鵬輝.一株半夏內(nèi)生青霉屬真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物及生物活性的研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2015,43(2):27-30.

[12] 孫景云,楊中鐸,于海濤.雷公藤等10種植物分得49種內(nèi)生真菌的發(fā)酵提取物殺蟲活性研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2016,44(6):9-12.

[13] 徐姣,常越,劉振鵬,等.5種人參內(nèi)生真菌對(duì)6種人參病害拮抗作用的研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2016,44(6):16-18.

[14] Caporaso JG, Kuczynski J,Stombaugh J,et al.QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J].Nature Methods,2010,7(5):335-336.

[15] Schloss PD,Westcott SL,Ryabin T,et al.Introducing mothur:Open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities[J].Appl Environ Microbiol,2009,75(23):7537-7541.

[16] Edgar RC,Haas BJ,Clemente JC,et al.UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection[J].Bioinformatics,2011,27(16):2194-2200.

[17] Edgar RC.Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST[J].Bioinformatics,2010,26(19):2460-2461.

[18] Amato KR,Yeoman CJ,Kent A,et al.Habitat degradation impacts black howler monkey (Alouatta pigra)gastrointestinal microbiomes[J].The ISME Journal,2013,7(7):1344-1353.

[19] Oberauner L,Zachow C,Lackner S,et al.The ignored diversity: complex bacterial communities in intensive care units revealed by 16S pyrosequencing[J].Scientific Reports,2013,3(3):1413.

[20] Huson DH, Mitra S,Ruscheweyh H,et al.Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4[J].Genome Research,2011,21(9):1552-1560.

Endophytic Fungi Diversity of Ginseng Seeds by Using 454 GS FLX

MA Wei，LIU Zhen-peng, SUN Li-ying*，ZHANG Kai-xue, XU Jiao,WEN Dong， ZHAO Rui, LIU Xiu-bo

(Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

Objective: To study the biodiversity of the endophytic fungi of ginseng seeds. Methods: Use 454 sequencing technology to analyze the diversity of endophytic fungi from the ginseng seeds. Results: Ascomycota had the overwhelming superiority,and its average percentage was 32.7%. 46 genera were identified and Fusarium was the dominant genera. Conclusion: Endophytic fungi of Ginseng seeds has the biological diversity, and the distribution of the endophytic fungi of ginseng seeds has some differences.

Ginseng seeds；454 GS FLX；Metagenomics；Endophytic fungi；Biodiversity

農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(No.201303111-04)；哈爾濱市優(yōu)秀學(xué)科帶頭人基金項(xiàng)目(No.2014RFXXJ122)；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(No.12541743)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81274010)；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)“優(yōu)秀創(chuàng)新人才支持計(jì)劃”項(xiàng)目(No.2012001)

馬偉(1969-)，女，研究員，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：藥用植物生物工程。

孫麗英*(1966-)，女，研究員，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事教學(xué)、科研及臨床工作。

2016-11-18

R28

A

1002-2406(2017)03-0028-04

修回日期：2016-12-10