梁穎，李冀，郭盛磊，李大然，徐放，蔡文輝

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

熟地黃多糖對荷瘤小鼠腫瘤組織Cyt-C及Caspase-3基因表達(dá)的影響

梁穎，李冀*，郭盛磊，李大然，徐放，蔡文輝

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：探討熟地黃多糖對荷瘤小鼠腫瘤組織細(xì)胞色素C(Cytochrome C,Cyt-C)及天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinases,Caspase-3)基因表達(dá)的影響。方法：采用Real-time PCR法檢測腫瘤組織中Cyt-C mRNA及Caspase-3 mRNA的表達(dá)情況，采用Western blot法檢測Cyt-C及Caspase-3蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。結(jié)果：熟地黃多糖低劑量組、中劑量組、高劑量組、陽性對照組和聯(lián)合用藥組腫瘤組織中Cyt-C和Caspase-3 mRNA的表達(dá)量分別是模型對照組的0.46、0.76；4.82、1.26；0.43、0.60；13.91、4.65；20.17、9.23倍。Cyt-C和Caspase-3蛋白質(zhì)的表達(dá)量分別是模型對照組的0.31、0.90；1.82、1.46；0.62、0.87；2.60、1.54；2.80、1.60倍。結(jié)論：熟地黃多糖能促進(jìn)腫瘤組織中Cyt-C和Caspase-3基因的表達(dá)。

熟地黃多糖；細(xì)胞色素C；天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶

扶正固本是中醫(yī)學(xué)治療腫瘤的治則之一，熟地黃是常用的補(bǔ)益藥，具有補(bǔ)血養(yǎng)陰、填精益髓之功效。熟地黃多糖是熟地黃經(jīng)水提醇沉的提取物，實(shí)驗(yàn)研究表明熟地黃多糖具有抑制腫瘤生長[1-4]、抗突變[5]、提高機(jī)體免疫力[6]等作用。本研究用不同濃度的熟地黃多糖作用于荷瘤小鼠的腫瘤組織，探討熟地黃多糖對Cyt-C及Caspase-3表達(dá)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

S180細(xì)胞株(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫)；熟地黃多糖(陜西慈緣生物技術(shù)有限公司)；ICR小鼠(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物中心)；TaKaRa PrimeScript?RT reagent KIT(日本TaKaRa公司)；Power SYBR?Green Master Mix(Applied Biosystems公司)；RNeasy@ Mini Kit(美國QIAGEN公司)；Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination(Sigma)； Goat anti Mouse IgM (Santa Cruze)；The Mid/Low Protein Molecular Weight Markers(14.4kDa～97.4 kDa)(AMRESCO)；WesternProTMHorseradish Peroxidase Chromogenic Detection Kit(Genlantis)；Hybond蛋白雜交膜Hybond-P(低熒光PVDF膜)(GE Healthcare)；Anti-Cytochrome C antibody(abcam)；Western and IP cell lysate、PMSF(100 mM)、BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(Beyotime)；微量加樣器(德國Eppendorf公司)；光學(xué)發(fā)光八連管(美國Axygen公司)；Applied Biosystems step one plus定量PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；微量掌式離心機(jī)(德國SIGMA公司)；高速冷凍離心機(jī)sigma 3K30(德國SIGMA公司)；引物設(shè)計軟件Perkin Elmer ABI 7700 Sequence Detection System引物合成(中國上海捷瑞生物工程有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 腫瘤模型的制備

無菌條件下抽取腹腔傳代7天的小鼠腹水，生理鹽水調(diào)節(jié)濃度為2×107個/ml，每只鼠于右腋下接種0.2 ml，4天后可以觸到實(shí)體瘤，接瘤率100%。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

將60只小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g隨機(jī)平均分為6組：熟地黃多糖高劑量組、熟地黃多糖中劑量組、熟地黃多糖低劑量組、環(huán)磷酰胺陽性對照組、環(huán)磷酰胺熟地黃多糖聯(lián)合用藥組、模型組。各組接種24 h后給藥，各組連續(xù)給藥10 d。熟地黃多糖給藥組分別按1.0 g/kg、0.5 g/kg、0.25 g/kg劑量灌胃給藥；環(huán)磷酰胺組按40 mg/kg劑量腹腔注射給藥，隔天1次；聯(lián)合用藥組按照熟地黃多糖中劑量組濃度給藥，結(jié)合環(huán)磷酰胺腹腔注射；模型組給予0.2 ml生理鹽水。

2.3 檢測方法

末次給藥24 h后處死小鼠，留取瘤組織。

2.3.1 Real-time PCR法檢測Cyt-C和Caspase-3 mRNA的表達(dá)

引物序列：β-actin上游引物序列為5′-AAGGCCAACCGTGAAAAGATG-3′，下游引物序列為5′- AATGCCAGTGGTACGACCAGA -3′；Cyt-C上游引物序列為5′- AACTGGCCTCTGACAGGCAAT -3′，下游引物序列為5′- TCAGTGGTGAAAGGCAGCATC -3′；Caspase-3上游引物序列為5′-GAAACTGTACGCGCACAAGCT -3′,下游引物序列為5′-TTGCATGGAAAGTGGCGTC-3′。提取腫瘤組織總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒用TaKaRa進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件：42℃30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min，1個循環(huán)。SYBR?Green I嵌合熒光法進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，1個循環(huán)，95℃ 15 sec，60℃ 1 min，40個循環(huán)。Real-time PCR所有數(shù)據(jù)均采用2-ΔΔCt法計算[7]。

ΔΔCt=(對照組目的基因平均Ct值-對照組管家基因平均Ct值)-(處理組目的基因平均Ct值-處理組管家基因平均Ct值)

2.3.2 Western blot法檢測Cyt-C和Caspase-3蛋白質(zhì)的表達(dá)

將腫瘤組織剪成碎片，充分裂解后離心取上清液，用BCA試劑盒對蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行測定，SDS-PAGE電泳。電泳后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上封閉過夜。一抗孵育、二抗孵育后用DAB試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)顯色，顯色終止后避光放置20 min，將膜置于掃描儀中掃描，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析條帶分子量和凈光密度值。

3 結(jié)果

3.1 Real-time PCR法對Cyt-C和Caspase-3的測定結(jié)果

如圖1、圖3和圖5所示，Real-time PCR溶解曲線出現(xiàn)單一峰，擴(kuò)增良好。圖2、圖4和圖6顯示擴(kuò)增曲線重復(fù)性良好。實(shí)驗(yàn)各組的CT值對照管家基因β-actin進(jìn)行均一化處理。經(jīng)藥物干預(yù)后中劑量組、陽性對照組和聯(lián)合用藥組的Cyt-C mRNA的表達(dá)量分別是模型對照組的4.82、13.91和20.17倍(見表1)。Caspase-3 mRNA的表達(dá)量模型組為1，低劑量組是0.76，中劑量組是1.26，高劑量組是0.60，陽性對照組是4.65，聯(lián)合用藥組是9.23(見表1)。即濃度為50 mg/ml的熟地黃多糖、環(huán)磷酰胺能提高荷瘤小鼠腫瘤組織中Cyt-C和Caspase-3 mRNA的表達(dá)，且二者聯(lián)合使用表達(dá)率更高。

3.2 Western blot法檢測Cyt-C和Caspase-3蛋白質(zhì)的測定結(jié)果

利用凝膠圖像處理系統(tǒng)對Western blot所得條帶進(jìn)行灰度測定，將待測蛋白條帶的灰度值比上相應(yīng)各組的內(nèi)參蛋白β-actin的灰度值作為蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量，模型對照組的比值設(shè)為“1”，計算各組小鼠腫瘤細(xì)胞的Cyt-C和Caspase-3蛋白表達(dá)量。結(jié)果如圖7、圖8，Cyt-C蛋白熟地黃多糖低劑量組表達(dá)量是模型組小鼠的0.31倍，中劑量組是模型組的1.82倍，高劑量組是模型組的0.62倍，陽性對照組是模型組的2.60倍，聯(lián)合用藥組是模型組的2.80倍。Caspase-3蛋白表達(dá)量熟地黃多糖低劑量組是模型組的0.90倍，中劑量組是模型組的1.46倍，高劑量組是模型組的0.87倍，陽性對照組是模型組的1.54倍，聯(lián)合用藥組是模型組的1.60倍。

圖2 β-actin擴(kuò)增曲線

圖3 Cyt-C溶解曲線

圖4 Cyt-C擴(kuò)增曲線

圖5 Caspase-3溶解曲線

圖6 Caspase-3擴(kuò)增曲線

組別CTMeanΔCtΔΔCtCyt-C2-ΔΔCtβ-actinCyt-CCaspase-3Cyt-CCaspase-3Caspase-3Cyt-CCaspase-3模型組17.689±0.03428.961±0.02530.846±0.14111.272±0.05913.157±0.1360011低劑量組16.972±0.06029.350±0.16330.535±0.17812.378±0.19613.563±0.2281.1060.4050.460.76中劑量組18.591±0.04727.596±0.04231.413±0.0939.005±0.05812.822±0.135-2.268-0.3354.821.26高劑量組16.542±0.06329.033±0.03530.430±0.11312.493±0.09713.888±0.0661.2190.7310.430.60陽性對照組19.419±0.00426.894±0.05930.358±0.0477.475±0.05510.939±0.048-3.798-2.21813.914.65聯(lián)合用藥組22.769±0.52029.708±0.13332.720±0.0746.939±0.0929.951±0.049-4.334-3.20720.179.23

圖7 Cyt-C蛋白的表達(dá)情況

圖8 Caspase-3蛋白的表達(dá)情況

4 討論

細(xì)胞凋亡也稱為細(xì)胞程序性死亡，是由基因決定的細(xì)胞主動結(jié)束生命的過程。細(xì)胞凋亡是一種生理性保護(hù)機(jī)制，能夠清除體內(nèi)多余、受損或危險的細(xì)胞而不對周圍的細(xì)胞或組織產(chǎn)生損害。細(xì)胞凋亡主要有三個途徑:死亡受體途徑、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。

Cyt-C是位于線粒體膜間腔中構(gòu)成電子傳遞呼吸鏈的組成成分之一，負(fù)責(zé)將電子由復(fù)合物Ⅲ傳遞給復(fù)合物Ⅳ。Cyt-C由核基因編碼的多肽及線粒體編碼的亞鐵血紅素組成。多種凋亡刺激造成線粒體外膜通透化(mitochondrial outer membrane permeabilization,MOMP)，MOMP導(dǎo)致膜間腔中的可溶性蛋白擴(kuò)散到細(xì)胞質(zhì)中，其中與凋亡關(guān)系最密切的是Cyt-C。Cyt-C由線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)是線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性步驟。在ATP供能的情況下，擴(kuò)散到細(xì)胞質(zhì)中的Cyt-C與細(xì)胞凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1)結(jié)合，并將其活化。Apaf-1空間結(jié)構(gòu)包含與Caspase結(jié)合的結(jié)構(gòu)域及與核苷酸結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。Apaf-1自身與ATP/dATP結(jié)合力弱，當(dāng)Apaf-1與Cyt-C結(jié)合成復(fù)合物后，該復(fù)合物與ATP/dATP結(jié)合的能力大大提高。此時結(jié)合有ATP/dATP的Apaf-1/Cyt-C復(fù)合物暴露出與Caspase-9的結(jié)合位點(diǎn)，并與Caspase-9前體結(jié)合，形成稱為凋亡體的Apaf-1、Cyt-C、Caspase-9復(fù)合物。活化的Caspase-9進(jìn)一步激活下游的Caspase，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡作用[8]。Caspase是細(xì)胞凋亡的指揮中樞之一。通過切斷細(xì)胞與周圍的聯(lián)絡(luò)、重組細(xì)胞骨架、解體核纖層、破壞DNA結(jié)構(gòu)、關(guān)閉DNA復(fù)制與修復(fù)、誘導(dǎo)細(xì)胞形成凋亡小體等方式，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。Caspase家族成員分為三類：參與細(xì)胞凋亡起始類，如Caspase-9；參與細(xì)胞凋亡執(zhí)行的，如Caspase-3；輔助促炎癥反應(yīng)的，如Caspase-1;Caspase-3在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，Caspase-3的最重要的作用底物是多聚(ADP-核糖)聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase, PARP)，PARP與DNA的修復(fù)、基因完整性監(jiān)護(hù)有關(guān)。當(dāng)細(xì)胞凋亡啟動時，Caspase-3將PARP水解成31 kD和85 kD的兩個片段，PARP與DNA結(jié)合的鋅指結(jié)構(gòu)與羧基端的催化區(qū)域分離，不能發(fā)揮正常功能。進(jìn)而使受PARP負(fù)調(diào)控的核酸內(nèi)切酶活性增高，裂解核小體間的DNA，引起細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)研究以S180肉瘤小鼠為模型，給予熟地黃多糖灌胃給藥。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型對照組相比較，濃度為0.5 g/kg的熟地黃多糖能夠提高Cyt-C、Caspase-3基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。其轉(zhuǎn)錄水平分別是模型對照組的4.82和1.26倍，蛋白質(zhì)翻譯的量分別是模型對照組的1.82和1.46倍。說明熟地黃多糖的抗腫瘤作用可能是通過促進(jìn)誘發(fā)腫瘤細(xì)胞發(fā)生線粒體途徑的細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的。另外，熟地黃多糖與環(huán)磷酰胺聯(lián)合用藥組的Cyt-C、Caspase-3的基因表達(dá)情況高于環(huán)磷酰胺陽性對照組，說明熟地黃多糖與化療藥物環(huán)磷酰胺聯(lián)合使用可以加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的凋亡作用。

[1] 吳勃巖,王雪,王君龍,等.熟地黃多糖對H22、S180荷瘤小鼠抑瘤作用及存活時間的影響[J].中醫(yī)藥信息,2012,29(6):19-21.

[2] 吳勃巖,車艷新,孫陽,等.熟地黃多糖對H22荷瘤小鼠細(xì)胞色素C和Caspase-3蛋白的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報,2015,43(6):34-36.

[3] 王雪.熟地黃多糖對荷瘤小鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的實(shí)驗(yàn)研究[D].哈爾濱:黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),2015.

[4] 董靜,吳勃巖,車艷新,等.熟地黃多糖誘導(dǎo)H22荷瘤小鼠細(xì)胞凋亡作用的研究[J].中醫(yī)藥信息,2015,32(4):32-34.

[5] 梁穎,徐紹娜.熟地黃多糖對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠的抗突變作用研究[J].中醫(yī)藥信息,2010,27(4):110-112.

[6] 鄭小珂,侯委位.熟地黃提取物體外免疫調(diào)節(jié)作用實(shí)驗(yàn)研究[J].中國藥學(xué)雜志,2012,47(24):1995-1999.

[7] Schmittgen TD,Livak KJ.Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method[J].Nat Protoc,2008,3(6):1101-1108.

[8] 謝洪婷,沈陽,曾常茜.蛇床子素對海人酸致癇大鼠神經(jīng)元Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)的影響[J].中醫(yī)藥信息,2015,32(2):16-18.

Effect of Radix Rehmanniae Polysaccharide on the Expression of Cyt-C, Caspase-3 Genes in Tumor Tissue of Tumor-bearing Mice

LIANG Ying, LI Ji*, GUO Sheng-lei,LI Da-ran,XU Fang,CAI Wen-hui

(Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

Objective: To study the effect of radix rehmanniae polysaccharide on the expression of Cytochrome c (Cyt-C) and cysteinyl aspartate specific proteinases (Caspase-3) genes in tumor-bearing mice. Methods: Real Time-PCR was used to analyze the expression of Cyt-C and Caspase-3 mRNA in tumor tissue. Western blot was used to analyze the expression of Cyt-C and Caspase-3 proteins in tumor tissue. Results: The mRNA expression of Cyt-C and Caspase-3 in the mice treated by low-, mid-, high-dose Radix rehmanniae polysaccharide, positive control and drug combination was 0.46, 0.76; 4.82, 1.26; 0.43, 0.60; 13.91, 4.65; 20.17, 9.23 times respectively than that of control mice. The protein expression of Cyt-C and Caspase-3 in these five groups was 0.31, 0.90; 1.82, 1.46; 0.62, 0.87; 2.60, 1.54; 2.80, 1.60 times higher than that of control mice. Conclusion:Radix rehmanniae polysaccharide can promote the expression of Cyt-C and Caspase-3 mRNA and proteins in tumor tissues.

Radix rehmanniae polysaccharide; Cyt-C; Caspase-3

國家重點(diǎn)研發(fā)計劃子課題(No.2016YFC0500303-10);黑龍江省博士后資助項目(No.LBH-Z12251);黑龍江省中醫(yī)藥科研項目(No.ZHY10-W13))

梁穎(1978-)，女，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)在站博士后，副教授，主要從事中藥抗突變、中藥抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)的研究工作。

李冀*(1960-)，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)方劑學(xué)研究工作。

2016-11-20

R285.5

A

1002-2406(2017)03-0024-04

修回日期：2016-11-30