何媛媛，韓紅園，李二文，代一航，索亞然，林瑞超

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥品質(zhì)評價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100102)

不同產(chǎn)地意大利牛舌草中蘆丁和山奈酚的含量測定及其抗補(bǔ)體活性研究

何媛媛，韓紅園，李二文，代一航，索亞然，林瑞超*

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥品質(zhì)評價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100102)

目的：測定不同產(chǎn)地意大利牛舌草中蘆丁和山奈酚的含量和其抗補(bǔ)體活性研究。方法：采用UPLC法，色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm)；流動(dòng)相為甲醇(A)- 0.4%甲酸(B)；洗脫程序(0～3 min, 5%～31% A； 3～10 min, 31%～37% A；10～12 min, 37%～40% A；12～30 min, 40%～40% A)，柱溫30℃；檢測波長366 nm。通過溶血試驗(yàn)評價(jià)蘆丁和山奈酚的抗補(bǔ)體活性。結(jié)果：意大利牛舌草中蘆丁和山奈酚的含量分別在1.25-3.34 mg/g和2.86-6.05 mg/g范圍內(nèi)，且蘆丁和山奈酚均具有較好的抗補(bǔ)體活性。結(jié)論：意大利牛舌草中2種主要活性成分的含量同地區(qū)之間差異較小，不同地區(qū)之間存在差異，且這兩種成分均具有較好的抗補(bǔ)體活性。

意大利牛舌草；含量測定；蘆丁；山奈酚；抗補(bǔ)體活性

意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz.)為紫草科牛舌草屬多年生草本植物地上部分，維文名為高孜萬，主要分布于地中海和熱帶地區(qū)[1-2]，主要功效具有生濕生熱、調(diào)節(jié)異常黑膽質(zhì)、生濕補(bǔ)腦、祛寒補(bǔ)心、爽心悅志、潤燥消炎、止咳平喘等作用?，F(xiàn)代研究表明，意大利牛舌草具有抗腫瘤[3-4]、抗氧化[5-6]、抗菌[7]等生物活性，臨床上主要用于治療干寒性或黑膽質(zhì)性疾病，如平性腦虛、心悸、抑郁癥、干性腦膜炎、高血壓、肺炎及結(jié)核疾病、寒性咳嗽、感冒、氣喘等[8]。意大利牛舌草中主要化學(xué)成分有黃酮類、脂肪酸類、三萜類和揮發(fā)油類，其中黃酮類含量較高[9]。各種藥效成分的含量和活性對其藥效具有顯著影響。目前，各個(gè)產(chǎn)地的意大利牛舌草活性成分的含量是否存在差別，以及其主要代表性化合物蘆丁和山奈酚的抗補(bǔ)體活性都沒有相關(guān)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用UPLC法對不同產(chǎn)地意大利牛舌草中的代表性化合物蘆丁和山奈酚進(jìn)行含量測定，并對蘆丁和山奈酚進(jìn)行抗補(bǔ)體活性研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

RJ-LD-IIB型低速大容量多管離心機(jī)(無錫市瑞江分析儀器有限公司)；低溫高速離心機(jī)(Sigma公司)；EPOCH型酶標(biāo)儀(Bio Tek，美國)；Waters Acquity UPLC H-Class超高效液相色譜儀(Waters公司)；BP 211D 型1 /10 萬電子天平(Sartorious 公司)；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)；KQ-500型數(shù)控超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

豚鼠(體質(zhì)量250～300 g，北京華阜康生物科技股份有限公司)；無菌抗凝綿羊血(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20160525)；抗SRBC抗體(溶血素,北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20160429)。

6批意大利牛舌草藥材(表1)購自新疆麥迪森維藥有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)林瑞超教授鑒定為紫草科牛舌草屬植物意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz.)的干燥全草。

蘆丁(批號(hào)PS160113-02)和山奈酚(批號(hào)PS0207-0020)對照品均購自成都普思生物科技有限公司;甲醇：色譜醇(Fisher公司，美國);其他均為分析純試劑;水為屈臣氏蒸餾水。

表1 實(shí)驗(yàn)用意大利牛舌草藥材的來源

2 方法與結(jié)果

2.1 兩種成分的含量測定

2.1.1 液相色譜條件及系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm)；柱溫：30℃;流動(dòng)相：甲醇(A)- 0.4%甲酸(B)。洗脫程序(0～3 min，5～31% A；3～10 min，31%～37% A；10～12 min，37%～40% A；12～30 min，40%～40% A);進(jìn)樣量：2 μL；檢測波長366 nm。采用上述條件分別得到對照品和意大利牛舌草藥材的色譜圖，如圖1所示。樣品中蘆丁和山奈酚的保留時(shí)間分別為11.475 min和22.268 min，其色譜峰與相鄰色譜峰達(dá)到基線分離。

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁和山奈酚對照品適量，分別置于10 mL容量瓶中。然后加入適量甲醇制成蘆丁和山奈酚濃度分別為0.030 3 mg/mL和0.010 0 mg/mL的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

取本品粗粉(粉碎，過40目篩)，精密稱定1.000 0 g，置250 mL圓底燒瓶中，加甲醇40 mL、25% HCl溶液10 mL，85℃回流提取1.5 h，過濾，定容于10 mL容量瓶中，搖勻，用0. 22 μm的微孔濾膜濾過，即得[10]。

圖1 蘆丁對照品(A)、山奈酚對照品(B)和意大利牛舌草樣品(C)UPLC圖注：1：蘆??；2：山奈酚。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別取蘆丁和山奈酚對照品溶液各100 μL，用甲醇倍比稀釋得到0、2、4、8、16、32倍稀釋的6份標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別進(jìn)樣2 μL，按上述色譜條件測定，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。得回歸方程蘆丁：Y=1×107X+1 250(r=0.999 4)；山奈酚：Y=2×108X-2 125(r=0.999 8)。結(jié)果表明，蘆丁和山奈酚分別在0.947～15.2 μg/mL和0.313～10.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn)

取同一意大利牛舌草樣品供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量均為2 μL。測定蘆丁和山奈酚的峰面積，計(jì)算蘆丁和山奈酚的RSD分別為 0.33%和0.34%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批意大利牛舌草供試品，分別在0、2、4、8、10、12、24 h進(jìn)樣2 μL。分別根據(jù)峰面積考察樣品的穩(wěn)定性，計(jì)算得到蘆丁和山奈酚的RSD分別為0.76%和1.92%，結(jié)果表明供試品至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批意大利牛舌草供試品6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣2 μL測定。結(jié)果顯示，蘆丁和山奈酚的RSD分別為1.20%和1.74%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 定量限和檢測限試驗(yàn)

取上述各對照品溶液，逐步稀釋進(jìn)樣，直至S/N=3和S/N=10，此時(shí)的進(jìn)樣量即分別為檢測限(LOD)和定量限(LOQ)。測定得蘆丁和山奈酚的檢測限分別為0. 32 ng和0.20 ng；定量限分別為1.05 ng和0.71 ng。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取同一批供試品6份，每份1.000 0 g，分別定量加入兩種對照品，測定樣品中相應(yīng)的化合物的含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.1.10 意大利牛舌草中兩種成分的含量測定

取購自不同產(chǎn)地6批意大利牛舌草藥材，每批3份，按上述方法測定其中蘆丁和山奈酚的含量，計(jì)算平均值，結(jié)果見表3。

2.2 補(bǔ)體經(jīng)典途徑的溶血活性(CH50)測定[11]

2.2.1 溶液配制

巴比妥緩沖鹽(BBS)，包含0.5 mol/L鎂(Mg2+)和0.15 mol/L鈣(Ca2+)。取溶血素適量，加入BBS,配制成為1∶1 000溶血素溶液。

表2 意大利牛舌草中兩種成分的加樣回收率測定結(jié)果

表3 6批意大利牛舌草藥材中兩種成分的含量

2.2.2 補(bǔ)體的效價(jià)測評定

取補(bǔ)體(豚鼠血清)0.1 mL，加入BBS配制成1∶5溶液，用BBS對倍稀釋成1∶10，1∶20，1∶40，1∶80,1∶160，1∶320，1∶640。取1∶1 000溶血素、各濃度補(bǔ)體及2% SRBC各0.1 mL溶于0.3 mL BBS中，混勻，37℃水浴溫育30 min后放入低溫高速離心機(jī)，在5 000 rpm、4℃條件下離心10 min。分別取每管上清0.2 mL于96孔板，在405 nm處測定吸光度。以三蒸水溶血管的吸光度作為全溶血標(biāo)準(zhǔn)(0.1 mL 2% SRBC溶于0.5 mL三蒸水中)，選擇達(dá)到相似吸光度的最低補(bǔ)體溶液作為正常溶血所需要的臨界補(bǔ)體濃度。

2.2.3 藥物經(jīng)典途徑抗補(bǔ)體活性測定

取臨界濃度的補(bǔ)體分別與不同濃度的供試品混勻，加入適量的BBS、溶血素和2% SRBC。37℃水浴溫育30 min，離心后取上清液在405 nm處測定吸光度。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置中藥對照組(將等量的供試品加入BBS緩沖液中，用于測定中藥本底A值)、補(bǔ)體組(取臨界質(zhì)量濃度的補(bǔ)體加入BBS緩沖鹽、2% SRBC，用于測定臨界質(zhì)量濃度補(bǔ)體所造成紅細(xì)胞溶血的A值)和全溶血組(將2% SRBC加入水中使之全溶血，用于觀察補(bǔ)體組是否達(dá)到或接近全溶血水平)。計(jì)算溶血抑制率。

溶血抑制率=1-(A中藥組-A中藥對照組)/A補(bǔ)體組

2.3 蘆丁和山奈酚抗補(bǔ)體活性測定結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)測定了蘆丁和山奈酚的體外抗補(bǔ)體活性，雖然均小于陽性藥肝素鈉(0.048 ± 0.012)mg/mL，但對經(jīng)典途徑的補(bǔ)體激活都有一定的抑制作用，結(jié)果見表4。

表4 蘆丁和山奈酚抗補(bǔ)體活性測定結(jié)果

3 結(jié)論

本研究建立了同時(shí)測定意大利牛舌草中蘆丁和山奈酚UPLC含量的方法。通過方法學(xué)考察證明，該方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。采用該方法成功地測定了來自巴基斯坦、四川、新疆等地6批意大利牛舌草藥材中兩種成分的含量。

意大利牛舌草中兩種主要活性成分的含量同地區(qū)之間差異較小，不同地區(qū)之間存在差異，提示其質(zhì)量也可能存在差異。因此，為了更好的控制意大利牛舌草的質(zhì)量，需要進(jìn)行不同產(chǎn)地的生存條件與活性成分含量以及藥效學(xué)的相關(guān)性研究。

本實(shí)驗(yàn)對意大利牛舌草的2個(gè)黃酮類成分蘆丁和山奈酚進(jìn)行了抗補(bǔ)體活性評價(jià)，發(fā)現(xiàn)蘆丁和山奈酚均具有較好的抗補(bǔ)體活性，且山奈酚的抗補(bǔ)體活性強(qiáng)于蘆丁，表明蘆丁和山奈酚是意大利牛舌草抗補(bǔ)體活性的主要藥效組分。

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Content Determination of Rutin and Kaempferol inAnchusaItalicaRetz.from Different Regions and Its Anti-complement Activity

HE Yuan-yuan, HAN Hong-yuan, LI Er-wen, DAI Yi-hang, SUO Ya-ran, LIN Rui-chao*

(Beijing Key Laboratory of Traditional Chinese Quality Evaluation, School of Chinese Pharmacy,Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

Objective: To determine the content of rutin and kaempferol inAnchusaitalicaRetz. from different regions and its anti-complement activity. Methods: UPLC was used, and the analysis was performed on a ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm)with methanol (A) - 0.4% formic acid solution (B) as the mobile phases with gradient elution (0-3 min, 5-31% A; 3-10 min, 31%-37% A; 10-12 min, 37%-40% A; 12-30 min, 40%-40% A). The column temperature was set at 30℃, and the UV detection wavelength was 366 nm. Anti-complement activity of rutin and kaempferol was evaluated by hemolysis test. Results: The contents of rutin and kaempferol in Anchusa italica Retz were in the range of 1.25-3.34 mg/g and 2.86-6.05 mg/g, respectively. Rutin and kaempferol had a good anti-complement activity. Conclusion: There is no significant difference in the contents of two components in Anchusa italica Retz from the same region, but has differences in different regions. The two components have a good anti-complement activity.

AnchusaitalicaRetz.; Content determination; Rutin; Kaempferol; Anti-complement activity

國家中醫(yī)藥管理局公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目(No.201507004)

何媛媛(1990-)，女，北京中醫(yī)藥大學(xué)2014級(jí)民族藥學(xué)專業(yè)碩士研究生，主要研究方向：民族藥藥效與化學(xué)成分研究。

林瑞超*(1954-)，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥與民族藥的品質(zhì)評價(jià)研究。

2016-11-01

R284

A

1002-2406(2017)03-0020-04

修回日期：2016-11-30