王蕾,張語凡,王鑫,彭詩濤,袁金鳳,張先靈,陳炯,李飛*
(1.北京中醫(yī)藥大學,北京 100102;2.河北省中醫(yī)院,河北 石家莊 050011)
生川烏片炮制過程中5-HMF含量隨炮制時間的變化規(guī)律研究
王蕾1,張語凡1,王鑫1,彭詩濤1,袁金鳳1,張先靈1,陳炯2,李飛1*
(1.北京中醫(yī)藥大學,北京 100102;2.河北省中醫(yī)院,河北 石家莊 050011)
目的:考察生川烏片炮制過程中5-羥甲基糠醛(5-HMF)含量隨炮制時間的變化規(guī)律。方法:按照2015版《中華人民共和國藥典》(一部)制川烏項下的蒸與煮法,分別制備不同炮制時間的制川烏片,采用HPLC法測定川烏各炮制品中5-HMF的含量。結果:生川烏片中5-HMF含量為4.45 μg/g;煮制品及蒸制品在6 h之內(nèi),5-HMF的含量變化規(guī)律基本一致,均隨加熱時間延長呈非線性增加。在相同的時間點,蒸制品含量顯著高于煮制品。 結論:首次建立了HPLC法測定川烏中5-HMF含量的方法,該法穩(wěn)定、可靠;生川烏片在蒸、煮兩種加熱方式下5-HMF含量的變化規(guī)律與加熱時間有關,該結果對川烏飲片中5-HMF的檢測及其質(zhì)量控制提供參考。
生川烏片;炮制;HPLC;5-羥甲基糠醛
川烏為毛茛科植物烏頭(AconitumcarmichaeliiDebx.)的干燥母根,味辛、苦,性熱,有大毒,歸心、肝、脾經(jīng),具有祛風除濕、溫經(jīng)止痛功效[1]。川烏中主要含有生物堿類及多糖類成分。在炮制過程中,川烏中的多糖可能發(fā)生糖苷鍵的水解和糖的脫水反應,生成5-羥甲基糠醛(5-HMF)。目前,尚未見炮制對川烏中5-HMF影響的相關研究報道。因此,作者建立了川烏中5-HMF的含量測定方法,并對生川烏片及不同煮制時間和蒸制時間的制川烏片中5-HMF的含量進行檢測,分析其含量隨煮制和蒸制時間的變化規(guī)律,為川烏飲片的質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。
1.1 儀器
Agilent1100高效液相色譜儀(DAD檢測器、自動進樣器、在線脫氣機、四元泵,Agilent公司);Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(5 μm,4.6 mm×250 mm); BS210S型電子天平(德國Sartorius公司,Max 210 g,d=0.1 mg);超聲波清洗器(SB22-12DTDN型,寧波新芝生物科技股份有限公司)。
1.2 試藥
川烏片(購于四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司,經(jīng)中國食品藥品檢定研究院張繼主任藥師鑒定為毛茛科植物烏頭(AconitumcarmichaeliiDebx.)的母根);5-羥甲基糠醛(批號MUST-15051212,成都賽思特生物科技有限公司,純度>98%);甲醇(色譜純,美國Fisher公司);其他試劑均為分析純。
2.1 炮制品的制備
生川烏片:取生川烏片,凈制,備用。
煮制川烏片:參照2015版《中國藥典》制川烏項下煮法炮制。取生川烏片,用水浸泡約5 h達內(nèi)無干心,取出,加寬水分別沸水煮40 min、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h,取出,干燥。
蒸制川烏片:參照2015版《中國藥典》制川烏項下蒸法炮制。取生川烏片,用水浸泡約5 h達內(nèi)無干心,取出加水分別蒸1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h,取出,干燥。
觀察上述炮制品的外觀性狀,均達到內(nèi)無白心的質(zhì)量要求,但麻舌感程度不同,結果見表2。以上樣品分別粉碎,過3號篩,備用。
2.2 對照品溶液的制備
精密稱取對照品適量于10 mL容量瓶中,加入甲醇溶解并定容,即得含5-羥甲基糠醛662 μg/mL的對照品母液。精密吸取一定量母液,加甲醇定容配制成濃度為0.066 2,0.662,1.986,3.31,4.634,5.985,7.282 μg/mL的系列對照品溶液,備用。
2.3 供試品溶液的制備
分別精密稱取各炮制品粉末約1 g,置50 mL具塞錐形瓶中,精密加入體積分數(shù)80%甲醇25 mL,密塞,稱定重量,超聲提取20 min,放冷,再稱定重量,用體積分數(shù)80%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液適量,微孔濾膜(0.45 μm)濾過,即得。
2.4 色譜條件
Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(5 μm,4.6 mm×250 mm);甲醇為流動相A,以0.1%甲酸溶液為流動相B。洗脫梯度:0~5 min,5%A;5~20 min,5%~20%A;20~21 min,20%~80%A;21~35 min,20%A。檢測波長284 nm;柱溫25℃,流速1.0 mL/min;進樣量10 μL。
2.5 標準曲線的繪制
精密吸取5-HMF的系列濃度對照品溶液各10 μL,進樣測定,以峰面積y對濃度x進行線性回歸。線性回歸方程為:y=74.906x+15.667(R2=0.999 6,n=7),5-羥甲基糠醛在0.066 2~7.282 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。標準曲線見圖1。
圖1 5-羥甲基糠醛標準曲線
2.6 精密度試驗
精密吸取濃度為2.648 μg/mL的 5-HMF對照品溶液,連續(xù)6次進樣10 μl,依法測定峰面積,測得5-HMF峰面積的RSD為0.74%(n=6),表明該方法精密度良好。
2.7 重復性試驗
精密稱取已知含量為48.78 μg/g的制川烏粉末1 g,平行共6份,按“2.3”項下方法制備供試品溶液,依法測定,測得5-HMF峰面積的RSD為1.90%(n=6)。結果表明,該方法的重復性良好。
2.8 穩(wěn)定性試驗
取已知含量為48.78 μg/g的制川烏粉末1 g,按“2.3”項下制備供試品溶液,在制備后0,2,4,8,12 h分別進樣10 μL,測定峰面積,計算得到5-HMF的RSD為1.58%。結果表明,供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.9 加樣回收率試驗
稱取已知含量為48.78 μg/g的制川烏粉末0.5 g,精密稱定,平行共6份, 加入一定量的5-HMF對照品溶液,按“2.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.4”項下色譜條件進行測定,計算5-羥甲基糠醛的平均回收率為98.58%,RSD為1.90%(n=6),結果見表1。
表1 5-HMF加樣回收率試驗結果(n=6)
2.10 樣品的含量測定
將川烏的各炮制品按照“2.3”項下方法制備供試品溶液,每批次樣品平行操作2份,按“2.4”項下色譜條件依法測定,計算生川烏片及不同炮制時間的制川烏片中5-HMF含量。結果見表2,色譜圖見圖2,5-HMF含量隨煮制時間變化見圖3。
表2 川烏各樣品中5-HMF的含量(n=2)
圖2 5-HMF對照品、生川烏片、不同煮制、蒸制時間的制川烏片HPLC圖
圖3 5-HMF含量隨炮制時間的變化規(guī)律
傳統(tǒng)直接以生川烏為原料浸泡達到同等程度約36 h[2],本文采用生川烏片制備制川烏,其中浸泡至“內(nèi)無干心”的時間約5 h;川烏產(chǎn)地切片雖使其成分有流失,但在制備制川烏過程中可大幅度縮短浸泡時間,節(jié)約工時,并在一定程度上減少成分流失。
本文建立了川烏中5-HMF的HPLC含量測定方法,該方法操作簡單,結果穩(wěn)定可靠,可作為制川烏飲片的質(zhì)量控制的檢測方法。
5-HMF是炮制過程中糖類美拉德反應產(chǎn)生的中間產(chǎn)物。結果表明,生川烏片炮制前后5-HMF的含量變化明顯,且含量高低與炮制時間和加熱方式有關。在6 h內(nèi),蒸或煮川烏片中的5-HMF的含量變化規(guī)律基本一致,均隨著炮制時間的延長而呈非線性增加。加熱1 h時,蒸或煮制川烏片中含量約為生品的5~6.3倍;加熱在2~4 h之間,含量波動很小,煮制品的含量約為生品的10.9~11.7倍,蒸制品的含量約為生品的15.6~17.5倍;5~6 h,煮制品5-HMF含量急劇增加,約為生品的12.1~20.1倍;蒸制品含量則在4~5 h急劇增加,約為生品的34.4~41.3倍。同時,蒸制及煮制川烏片的顏色亦隨著炮制時間的延長而加深,麻舌感逐漸減弱或消失。當制川烏片的外觀顏色基本一致時,同一加熱方式下的炮制品中的5-HMF含量也基本一致。此外,蒸制6 h之后,5-HMF含量呈波動變化,但無麻舌感,飲片片型皺縮,飲片顏色呈黑褐色,傳統(tǒng)性狀不符合《中國藥典》要求。比較相同加熱時間下的蒸制川烏和煮制川烏,結果發(fā)現(xiàn)蒸制川烏片中5-HMF的含量均明顯高于煮制川烏片,可能與5-HMF易溶于水[3],在煮制過程中大量流失在水煮液中有關。該研究結果可為制川烏片的炮制工藝及質(zhì)量評價指標的選擇和質(zhì)量標準的制定提供借鑒。
體內(nèi)外藥理實驗結果顯示,5-HMF對CCl4急性肝損傷組織有保護作用;亦對由H2O2和葡萄糖所致血管內(nèi)皮細胞損傷后的細胞均具有保護作用[4]。同時,5-HMF具有抗氧化、抗心肌缺血等對人體有益的作用[5-6],但亦有研究表明5-HMF對人體橫紋肌和內(nèi)臟有毒副作用[7]。因此,炮制過程中5-HMF的含量變化對制川烏的質(zhì)量評價具有一定意義,但尚須進一步研究,結合其藥理、毒理作用及其對制川烏的外觀性狀、生物堿含量的影響等進行綜合評價,以保障制川烏的安全性、有效性。
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Changes of 5-hydroxymethylfurfuraldehyde Content in Radix Aconiti Tablets Processed at Different Time Points
WANG Lei1,ZHANG Yu-fan1,WANG Xin1,PENG Shi-tao1,YUAN Jin-feng1,
ZHANG Xian-ling1,CHEN Jiong2,LI Fei1*
(1.Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China; 2. Hebei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shijiazhuang 050011, China)
Objective: To find the changing regularity of 5-Hydroxymethylfurfuraldehyde (5-HMF) content in Radix Aconiti tablets processed at different time points.Methods: HPLC was used to determine the changes of 5-HMF content in different processed products of Radix Aconiti.Results: The content of 5-HMF of the raw product was 4.45 μg/g. The content of 5-HMF was increased within the first six hours of heating. At the same processing time, the content of steamed products was significantly higher than that of boiled products. Conclusion: An HPLC method for determining the content of 5-HMF has been established. The proposed method is stable and reliable. The changes of the content of 5-HMF of Radix Aconiti tablets are processed by steaming and boiling for two kinds, which were associated with the heating time. It provides a reference for the quality control of Radix Aconiti.
Radix Aconiti tablets; Processing; HPLC; 5-hydroxymethylfurfural
國家中醫(yī)藥行業(yè)科研專項資助項目(No.201107008);科技部科技基礎性工作專項資助項目(No.2014FY111100-3)
王蕾(1992-),女,北京中醫(yī)藥大學2014級在讀碩士研究生,主要研究方向:中藥炮制。
李飛*(1963-),女,教授,碩士研究生導師,主要研究方向:中藥炮制工藝、原理及其質(zhì)量標準的研究。
2016-10-25
R285.5
A
1002-2406(2017)03-0017-03
修回日期:2016-11-01