楊建飛，魏來，張婧懿*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

蘇木乙酸乙酯提取物對動脈粥樣硬化模型大鼠血脂及MMP-9的影響

楊建飛1，魏來2，張婧懿1*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：應(yīng)用蘇木乙酸乙酯提取物對動脈粥樣硬化(AS)大鼠模型進(jìn)行干預(yù)，測定大鼠血脂及血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的水平，進(jìn)而為蘇木乙酸乙酯提取物抗AS化作用提供客觀依據(jù)。方法:采用腹腔注射維生素D3建立AS模型。將SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、蘇木低、中、高劑量組、辛伐他汀組，蘇木低、中、高劑量組分別給予蘇木乙酸乙酯提取物溶液10 ml/(kg·d)灌胃，分別相當(dāng)于生藥量1.15 g/(kg·d)、2.30 g/(kg·d)、3.45 g/(kg·d)；辛伐他汀組灌服辛伐他汀溶液4.20 g/(kg·d)，空白組與模型組灌服等體積的羧甲基纖維素鈉溶液。4周后取各組大鼠胸主動脈及腹主動脈采血，取得血清，測定血脂水平，應(yīng)用ELISA法檢測各組大鼠血清MMP-9的水平。結(jié)果：與空白組相比，模型組的TG、LDL-C、MMP-9水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與辛伐他汀組相比，蘇木高、中、低劑量組TG、LDL-C、MMP-9表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05)；與模型組相比，蘇木高、中、低劑量組和辛伐他汀組的TG、LDL-C、MMP-9水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：蘇木乙酸乙酯提取物能夠降低AS模型大鼠血脂及MMP-9的表達(dá)水平，其作用與辛伐他汀相當(dāng)。

動脈粥樣硬化；甘油三酯；低密度脂蛋白膽固醇；蘇木；基質(zhì)金屬蛋白酶-9

隨著人們生活水平的不斷改善，心腦血管疾病的患病率在逐年增長，并且嚴(yán)重威脅人類健康以及生活質(zhì)量，而其真正的幕后推手正是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)。其致病原因尚未完全明確，但是細(xì)胞外基質(zhì)的降解、脂質(zhì)浸潤、血流動力學(xué)的改變等多種原因在其形成和發(fā)展過程中起到了重要的作用。已有研究表明，炎癥反應(yīng)貫穿AS始終，且發(fā)揮著不可替代的重要作用，其中基質(zhì)金屬蛋白酶組(Matrix Metalloproteinases，MMPs)在降解和重構(gòu)細(xì)胞外基質(zhì)過程中起決定性作用，導(dǎo)致斑塊穩(wěn)定性遭到破壞，因而加速了AS進(jìn)程，而在MMPs中占重要地位的MMP-9應(yīng)得到足夠的重視，其參與了細(xì)胞外基質(zhì)降解以及重構(gòu)的全過程，在AS的斑塊形成、血管重構(gòu)、斑塊穩(wěn)定性失衡、斑塊破裂過程中其表達(dá)過度和活性增強(qiáng)，是心血管事件中較為重要的的預(yù)測因子之一[1-2]。目前經(jīng)研究證實(shí)部分活血化瘀類中藥單體及復(fù)方能在不同程度上降低AS動物模型的血脂水平，對內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能具有保護(hù)作用。而中藥蘇木作為活血化瘀藥應(yīng)用于臨床已有數(shù)千年的歷史，近年來更發(fā)現(xiàn)其還具有免疫抑制、抗腫瘤、抗炎及抗氧化等藥理作用[3-8]。因此我們再此基礎(chǔ)上提出假說，蘇木乙酸乙酯提取物作為蘇木的有效部位，可通過調(diào)節(jié)血脂，調(diào)整內(nèi)皮功能，發(fā)揮其抗炎免疫作用從而抑制動脈粥樣硬化的進(jìn)展。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級近交系SD大鼠55只，成年雄性，體質(zhì)量200～250 g，選取通風(fēng)、溫度、濕度都比較適宜的動物室內(nèi)飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動物購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號:SCXK(京)2015-0001。

1.2 蘇木乙酸乙酯提取物的制備

蘇木，產(chǎn)地云南，購自黑龍江省藥材公司，經(jīng)生藥鑒定制成蘇木粗粉(40目)。用乙醇浸泡，加熱，回流，過濾，將合并后的濾液水浴蒸干，烘干制成乙醇提取干粉。使用雙蒸水混懸乙醇提取干粉，之后用乙酸乙酯萃取，回收溶劑得到乙酸乙酯提取物。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物

辛伐他汀片(杭州默沙東制藥有限公司)；維生素D3(江蘇吳中醫(yī)藥集團(tuán)有限公司)；烏拉坦(上海浩然生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；福爾馬林(江蘇凱茂石化科技有限公司)；羧甲基纖維素鈉(河北石家莊森隆化工有限公司)；ELISA試劑盒(上?？道缮锛夹g(shù)有限公司)。

辛伐他汀片溶于羧甲基纖維素鈉10 ml中，稀釋成濃度為0.42 mg/ml的懸濁液；蘇木乙酸乙酯提取物溶于羧甲基纖維素鈉10 ml中，配制成濃度為0.115 g/ml的蘇木乙酸乙酯提取物懸濁液，室溫留存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 AS模型的建立

大鼠腹腔內(nèi)注射維生素D370萬IU/(kg·d)，連續(xù)3天。之后飼喂高脂飼料(配方為0.5%膽酸鈉、3%膽固醇、5%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶、91.3%普通飼料)12周，造模大鼠分籠飼養(yǎng)，飲用潔凈水。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周之后隨機(jī)分為6組(空白組、模型組、蘇木乙酸乙酯低劑量組、蘇木乙酸乙酯中劑量組、蘇木乙酸乙酯高劑量組、辛伐他汀組)，每組8只。空白組給予普通飼料喂養(yǎng)(配方為麩皮24.5%、魚粉6%、豆餅12%、玉米24.5%、大麥21%、其他輔料12%)，其余組大鼠應(yīng)用上述方法復(fù)制AS模型。蘇木乙酸乙酯低、中、高劑量組分別按1.15 g/(kg·d)、2.30 g/(kg·d)、3.45 g/(kg·d)給予蘇木乙酸乙酯提取物溶液灌胃;辛伐他汀組的劑量按體表面積等效劑量比換算，灌服4.2 mg/(kg·d)；空白組及模型組灌服等體積羧甲基纖維素鈉10 ml/(kg·d)。

1.6 標(biāo)本取材

造模12周后處死3只大鼠，應(yīng)用電子顯微鏡觀察腹主動脈血管壁是否有AS的血管內(nèi)皮損傷形成。待給藥28天后，進(jìn)行腹主動脈采血，離心，取血清，-20℃冰箱內(nèi)冷藏，進(jìn)行血脂檢測及ELISA法檢測；采集腹主動脈，縱行剪開，固定、包埋、切片，進(jìn)行HE染色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 病理形態(tài)學(xué)觀察

在電鏡下觀察，腹主動脈血管壁呈AS內(nèi)皮損傷改變，提示造模成功。本次研究發(fā)現(xiàn)模型組、辛伐他汀組、蘇木組血管內(nèi)皮發(fā)生病理性改變，經(jīng)給予藥物干預(yù)后蘇木組及辛伐他汀組病理改變較模型組減輕，而辛伐他汀組與蘇木組病理改變程度相當(dāng)。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠病理形態(tài)學(xué)結(jié)果(HE染色)

2.2 血脂檢測比較

結(jié)果顯示：高脂飼料飼養(yǎng)下的模型組血清中的TG、LDL-C水平升高，與正常飼料飼養(yǎng)下的空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；蘇木低劑、中、高劑量組、辛伐他汀組血清中的TG、LDL-C水平降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與辛伐他汀組比較，蘇木高、中、低劑量組血清TG、LDL-C的水平無差異(P>0.05)。見表1。

2.3 大鼠血清MMP-9含量測定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組、辛伐他汀組、蘇木低、中、高劑量組MMP-9水平升高，與空白組比較有顯著性差異(P<0.05)；與模型組比較，蘇木低、中、高劑量組及辛伐他汀組血清MMP-9的水平降低，與空白組比較有顯著性差異(P<0.05)；與辛伐他汀組比較，蘇木低、中、高劑量組MMP-9水平無顯著性差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠血脂檢測結(jié)果

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與辛伐他汀組比較，▲P>0.05。

表2 各組大鼠血清MMP-9水平的變化

注:與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與辛伐他汀組比較，▲P>0.05。

3 討論

據(jù)《中國心血管病報(bào)告2013》的報(bào)道顯示，目前全國心血管病的患者高達(dá)2.9億人，也就是說平均每5人中有1人患心血管病。而心血管疾病的始動環(huán)節(jié)即為動脈粥樣硬化，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其與脂質(zhì)代謝異常關(guān)系最為密切，是急性冠脈綜合征及腦卒中等心腦血管事件的主要病理基礎(chǔ)。尋找和探索有關(guān)AS的治療新策略對于降低心血管疾病的死亡率意義重大。血脂代謝異常是AS發(fā)生發(fā)展最重要且與之關(guān)系最緊密的因素之一，經(jīng)生化學(xué)證實(shí)其沉積于動脈內(nèi)膜的脂質(zhì)成分以游離膽固醇和膽固醇酯為主，其中LDL被確定為AS的獨(dú)立危險因素之一。有研究表明[9-11]，許多具有活血祛瘀活性的中藥均可對血脂代謝產(chǎn)生影響，通過改善血脂代謝，降低TG、LDL-C水平產(chǎn)生抗AS的作用。關(guān)于AS形成的明確病因尚未確定，除脂質(zhì)浸潤學(xué)說外，血流動力學(xué)說、炎癥反應(yīng)學(xué)說、內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說等多種學(xué)說存在已久，炎癥反應(yīng)學(xué)說目前被人們普遍關(guān)注，認(rèn)為AS的進(jìn)程就是炎癥反應(yīng)的過程[12]。炎癥反應(yīng)在AS形成、發(fā)展及演變過程中起重要作用，血清MMP-9是反映機(jī)體炎癥反應(yīng)比較敏感的指標(biāo)，細(xì)胞外基質(zhì)是血管壁的重要組成部分，其降解和重塑過程參與了AS的形成與發(fā)展的全過程，而參與降解的炎癥因子主要是MMPs，臨床上細(xì)胞外基質(zhì)的過度降解使AS斑塊易于破裂出血引起急性冠脈綜合征的發(fā)生等情況[13]。解冰川等[14]認(rèn)為,導(dǎo)致心、腦血管疾病發(fā)生率增加的重要危險因素是AS斑塊形成及破裂出血，MMP-9始終存在并長期作用，MMP-9對細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑均有重要意義，在出血性腦卒中及缺血性腦卒中的生理、病理變化過程中均起著重要作用，對于前者來說MMP-9可使血腦屏障遭到破壞，使腦水腫加重從而加重腦損害。所以對AS的抗炎治療包括抑制MMP-9的活性，可能是防治心腦血管疾病的新的突破口。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給予高、中、低劑量蘇木乙酸乙酯提取物或辛伐他汀治療可不同程度降低AS模型大鼠血清MMP-9水平，同時能調(diào)節(jié)血脂。所以我們可以得出結(jié)論:蘇木乙酸乙酯提取物能夠降低動脈粥樣硬化模型大鼠TG、LDL-C及MMP-9的水平，可能是其抗動脈粥樣硬化作用的原因之一。

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國家科技重大專項(xiàng)課題(No.2009ZX09103425)；黑龍江省中醫(yī)藥科研項(xiàng)目(No.ZHY16-002)

楊建飛(1984-)，女，主治醫(yī)師，博士，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合流動站在站博士后，主要從事中醫(yī)內(nèi)科心血管方向臨床、科研及教學(xué)工作。

張婧懿*(1984-)，女，工程師，碩士，主要從事中醫(yī)診療數(shù)字化、數(shù)據(jù)挖掘、統(tǒng)計(jì)等方面的研究工作。

2017-01-06

R285.5

A

1002-2406(2017)03-0014-03

修回日期：2017-01-30