楊炳友，周永強(qiáng)，劉艷，匡海學(xué)

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040)

洋金花果皮中生物堿成分及抗腫瘤活性研究

楊炳友，周永強(qiáng)，劉艷，匡海學(xué)*

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：研究洋金花果皮中生物堿成分及抗腫瘤活性。方法：采用硅膠、Sephadex-LH20及HPLC等色譜方法對(duì)化合物進(jìn)行分離和純化，并利用1H-NMR、13C-NMR及MS波譜方法鑒定化合物的結(jié)構(gòu)，以肝癌HepG-2、肺癌A549及胃癌SGC-7901腫瘤細(xì)胞為受試細(xì)胞，采用MTT法評(píng)價(jià)化合物的抗腫瘤活性。結(jié)果：該研究從洋金花果皮70%乙醇回流提取物的乙酸乙酯部位中共分離得到10個(gè)生物堿類化合物，分別鑒定為cyclo(PheTyr)(1)、9-hydroxycanthin-6-one(2)、(2,5-dioxo-4-imidazolidinyl)-carbamic acid(3)、1-ribityl-2,3-diketo-1, 2,3,4-tetrahydro-6,7-dimethyl-quinoxaline(4)、grossamide(5)、cannabisin F(6)、hyoscyamine(7)、trans-N-p-coumaroyl tyramine(8)、N-trans-feruloyloctopamine(9)和(2S,E)-N-[2-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]ferulamide(10)；體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明,1～10號(hào)化合物均具有潛在腫瘤細(xì)胞抑制活性。結(jié)論：化合物1～4首次從茄科植物中分離得到，且化合物1、2、5、6和8表現(xiàn)為較強(qiáng)的抗腫瘤活性。

茄科；果皮；生物堿；洋金花；抗腫瘤活性

洋金花為茄科植物白曼陀羅(DaturametelL.)，其蒴果圓球形，表面有疏短刺，成熟后淡褐色[1]。洋金花的藥用歷史悠久，2015版《中國(guó)藥典》記載其性味辛、溫，有小毒；具平喘止咳、鎮(zhèn)痛解痙、麻醉之功效[2-5]。目前從洋金花中分離的生物堿主要為東莨菪堿、莨菪堿、曼陀羅堿及阿樸東莨菪堿等莨菪烷類生物堿[6]。這些化學(xué)成分通常具有抗菌、抗炎和抗腫瘤等活性。然而，關(guān)于洋金花果皮中生物堿成分的文獻(xiàn)鮮有報(bào)道。因此，為了深入探討洋金花果皮中的化學(xué)成分、尋找其多種生物活性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本文對(duì)洋金花果皮的乙酸乙酯萃取部位化學(xué)成分深入研究，共分離鑒定了10個(gè)生物堿。

1 儀器與材料

2695-2996型分析HPLC(美國(guó)Waters公司)；Shimadzu，LC-6AD型制備HPLC(日本島津)；SunFireC18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)Waters公司)；SunFireC18色譜柱(250 mm×10 mm，5 μm，美國(guó)Waters公司)；Bruker-400超導(dǎo)核磁共振光譜儀(德國(guó)Bruker公司)；Acquity Ultra Performance LCTM液質(zhì)聯(lián)用色譜儀(美國(guó)Waters公司)；ELx800酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)；150i型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；色譜用硅膠(青島海洋化工廠)；Sephadex-LH20(GE Healthcare公司)；提取分離用試劑均為分析純；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；DMEM(Sigma公司)；10 000 U/mL青霉素/鏈霉素(美國(guó)Corning公司)；噻唑藍(lán)(MTT Biotopped公司)；DMSO(Sigma公司)；紫杉醇(Sigma公司)；96孔板(美國(guó)Corning公司)。

實(shí)驗(yàn)所用的肝癌HepG-2、肺癌A549及胃癌SGC-7901細(xì)胞株均購(gòu)于中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

洋金花果實(shí)采收于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥用植物教研室樊銳鋒鑒定為茄科曼陀羅屬植物白曼陀羅(DaturametelL.)的果實(shí)。原植物標(biāo)本(20140905)保存于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)教研室。

2 提取與分離

干燥的洋金花果皮(35 kg)，用70%乙醇提取3次，每次3 h，減壓回收溶劑，得提取物5.6 kg。提取物加水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取。乙酸乙酯部分(110 g)經(jīng)正相硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)(300:1-0:1)梯度洗脫，得到A～H 8個(gè)部分。E通過(guò)硅膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)，60:1-0:1)，得到10個(gè)流分。流分5直接析出白色沉淀即得化合物4(37 mg)。流分2、3、4、7經(jīng)HPLC分離即得化合物1(28 mg)、2(14 mg)、3(13 mg)、5(17 mg)、6(10 mg)、7(13 mg)、8(12 mg)和9(12 mg)。C通過(guò)硅膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)，30:1-0:1)，得6個(gè)流分。流分3經(jīng)HPLC分離即得化合物10(22 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

3.1 化合物1

無(wú)色針狀結(jié)晶(甲醇)。ESI-MS m/z：311.131 7 [M+H]+，分子式為C18H18N2O3。1H-NMR (400 MHz, CD3SOCD3)δ：3.94(1H, t, J=5.4 Hz, H-2)，3.91(1H, t, J=5.4 Hz, H-12)，2.18(2H, m, H-3)，2.57(2 H, m, H-13)，6.83(2H, d, J=8.4 Hz, H-15, 19)，6.67(2H, d, J=8.4 Hz, H-16, 18)，7.03(2H, d, J=7.0 Hz, H-5, 9)，7.24(2H, m, H-6, 7, 8)。13C-NMR (100 MHz, CD3SOCD3)δ：55.4(C-2)，38.5(C-3, 13)，136.6(C-4)，129.7(C-5, 9)，128.2(C-6, 8)，126.4(C-7)，166.2(C-10)，55.7(C-12)，126.4(C-14)，130.8(C-15, 19)，115.0(C-16, 18)，156.1(C-17)，166.1(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[7]數(shù)據(jù)對(duì)比，鑒定化合物1為cyclo(PheTyr)。

3.2 化合物2

無(wú)定形粉末(甲醇)。ESI-MS m/z：257.084 8 [M+H]+，分子式為C14H12N2O3。1H-NMR (400 MHz, CD3SOCD3)δ：8.15(1H, d, J=5.2 Hz, H-3)，7.75(1H, d, J=5.2 Hz, H-4)，7.94(1H, d, J=8.5 Hz, H-5)，6.69(1H, dd, J=8.5 Hz, J=2.1 Hz, H-6)，6.89(1H, d, J=1.9 Hz, H-8)，2.83(1H, t, J=7.3 Hz, H-1′)，3.26(1H, t, J=7.3 Hz, H-2′)，11.3(1H, br.s, NH)。13C-NMR (100 MHz, CD3SOCD3)δ：142.8(C-1)，137.3(C-3)，111.8(C-4)，122.5(C-5)，109.7(C-6)，158.2(C-7)，96.6(C-8)，142.3(C-9)，113.8(C-10)，127.7(C-11)，133.9(C-12)，31.4(C-1′)，27.8(C-2′)，174.1(C-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[8]數(shù)據(jù)對(duì)比，鑒定化合物2為9-hydroxycanthin-6-one。

3.3 化合物3

白色粉末(甲醇)。ESI-MS m/z：160.028 0 [M+H]+，分子式為C4H5N3O4。1H-NMR (400 MHz, CD3SOCD3)δ：10.5 (1H, s, 7-COOH)，5.2(1H, dd, J=1.2 Hz, J=8.2 Hz, H-4)，5.8(1H, s, 3-NH)，6.9(1H, d, J=8.2 Hz, 6-NH)，8.0(1H, s, 1-NH)。13C-NMR (100 MHz, CD3SOCD3)δ：173.5(C-7)，157.4(C-5)，156.7(C-2)，62.4(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[9]數(shù)據(jù)對(duì)比，鑒定化合物3為(2,5-dioxo-4-imidazolidinyl)-carbamic acid。

3.4 化合物4

無(wú)色結(jié)晶(甲醇)。ESI-MS m/z：325.329 1 [M+H]+，分子式為C15H20N2O6。1H-NMR (400 MHz, CD3SOCD3)δ：11.86(1H, s, 4-NH)，6.92(1H, s, H-5)，7.33(1H, s, H-8)，2.19(3H, s, H-11)，2.22(3H, s, H-12)，4.52(1H, d, J=3.8 Hz, H-1′a)，3.99(1H, d, J=2.1 Hz, H-1′b)，4.05(1H, m, H-2′,)，3.58(1H, m, H-3′)，3.61(1H, m, H-4′)，3.44(1H, m, H-5′a)，3.58(1H, m, H-5′b)；13C-NMR (100 MHz, CD3SOCD3)δ：155.7(C-2)，153.8(C-3)，116.0(C-5)，131.2(C-6)，130.9(C-7)，116.5(C-8)，124.9(C-9)，123.3(C-10)，19.3(C-11)，18.7(C-12)，44.5(C-1′)，68.1(C-2′)，73.6(C-3′)，72.7(C-4′)，63.4(C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[10]數(shù)據(jù)對(duì)比，鑒定化合物4為1-ribityl-2,3-diketo-1,2,3,4-tetrahydro-6,7- dimethyl-quinoxalin。

3.5 化合物5

棕色膏狀物(甲醇)。ESI-MS m/z：625.247 2 [M+H]+，分子式為C36H36N2O8。13C-NMR (100 MHz, CD3SOCD3)δ：169.4(C-10″)，165.2(C-10′)，155.6(C-4′)，155.6(C-4″)，148.7(C-4)，147.6(C-3?)，146.8(C-4?)，144.0(C-3)，138.7(C-7)，130.5(C-1?)，129.5(C-2′, 6′)，129.4(C-2″, 6″)，129.2(C-1′, 1″)，128.5(C-1)，128.5(C-5)，119.6(C-8)，118.8(C-6?)，115.9(C-6)，115.4(C-5?)，115.1(C-3′, 5′)，115.1(C-3″, 5″)，111.7(C-2)，110.3(C-2?)，87.6(C-7?)，55.8(C-8?)，55.7(3-OCH3)，55.6(3?-OCH3)，40.8(C-8′)，40.7(C-8″)，34.3(C-7′)，34.1(C-7″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[11]數(shù)據(jù)對(duì)比，鑒定化合物5為grossamide。

3.6 化合物6

白色無(wú)定形粉末(甲醇)。ESI-MS m/z：625.247 2 [M+H]+，分子式為C36H36N2O8。13C-NMR (100 MHz, CD3SOCD3)δ：125.5(C-1)，112.5(C-2)，148.9(C-3)，147.5(C-4)，115.2(C-5)，122.3(C-6)，126.3(C-7)，141.6(C-8)，168.8(C-9)，56.1(3-OCH3)，130.8(C-1′)，130.7(C-2′)，116.3(C-3′)，157.0(C-4′)，116.3(C-5′)，130.7(C-6′)，35.6(C-7′)，42.2(C-8′)，131.9(C-1″)，113.8(C-2″)，150.5(C-3″)，149.5(C-4″)，116.3(C-5″)，125.3(C-6″)，141.1(C-7″)，121.0(C-8″)，165.5(C-9″)，56.5(3?-OCH3)，131.3(C-1?)，130.7(C-2?)，116.3(C-3?)，156.9(C-4?)，116.3(C-5?)，130.7(C-6?)，35.8(C-7?)，42.6(C-8?)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[12]數(shù)據(jù)對(duì)比，鑒定化合物6為cannabisin F。

3.7 化合物7

無(wú)定形粉末(甲醇)。ESI-MS m/z：290.167 8 [M+H]+，分子式為C17H23NO3。13C-NMR (100 MHz, CD3SOCD3)δ：59.9(C-1)，34.1(C-2)，65.6(C-3)，34.2(C-4)，60.0(C-5)，23.9(C-6)，24.2(C-7)，38.3(C-8)，171.2(C-9)，54.3(C-10)，63(C-11)，136.2(C-12)，128.6(C-13)，128(C-14)，127.3(C-15)，128(C-16)，128.6(C-17)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[13]數(shù)據(jù)對(duì)比，鑒定化合物7為hyoscyamine。

3.8 化合物8

無(wú)定形粉末(甲醇)。ESI-MS m/z：284.120 8 [M+H]+，分子式為C17H17NO3。13C-NMR(100 MHz, CD3OD)δ：127.7(C-1)，130.6(C-2)，116.3(C-3)，160.5(C-4)，116.3(C-5)，130.6(C-6)，141.8(C-7)，118.4(C-8)，169.3(C-9)，131.3(C-1′)，130.7(C-2′)，116.7(C-3′)，157.0(C-4′)，116.7(C-5′)，130.7(C-6′)，35.8(C-7′)，42.6(C-8′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[14]數(shù)據(jù)對(duì)比，鑒定化合物8為T(mén)rans-N-p-coumaroyltyramine。

3.9 化合物9

白色晶體(甲醇)。 ESI-MS m/z：330.126 3[M+H]+，分子式為C18H19NO5。13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ：128.3(C-1)，111.6(C-2)，149.9(C-3)，149.3(C-4)，116.5(C-5)，123.4(C-6)，142.4(C-7)，118.7(C-8)，169.6(C-9)，134.7(C-1′)，128.5(C-2′)，116.2(C-3′)，158.1(C-4′)，116.2(C-5′)，128.5(C-6′)，73.5(C-7′)，56.4(3-OCH3)，48.3(C-8′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[15]數(shù)據(jù)對(duì)比，鑒定化合物9為N-trans-feruloyloctopamine。

3.10 化合物10

不定形粉末(甲醇)。ESI-MS m/z：330.126 3 [M+H]+，分子式為C18H19NO5。13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ：128.3(C-1)，111.6(C-2)，149.9(C-3)，149.3(C-4)，116.1(C-5)，123.3(C-6)，142.2(C-7)，118.7(C-8)，169.5(C-9)，134.7(C-1′)，128.4(C-2′)，116.5(C-3′)，158.1(C-4′)，116.5(C-5′)，128.4(C-6′)，73.4(C-7′)，48.3(C-8′)，56.4(3-OCH3)。將數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[16]數(shù)據(jù)對(duì)比，鑒定化合物10為(2S,E)-N-[2-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]ferulamide。

4 抗腫瘤細(xì)胞活性測(cè)試

參照文獻(xiàn)方法[17]檢測(cè)化合物1～10在5、10、20、40和80 μg/mL濃度下對(duì)腫瘤細(xì)胞株肝癌HepG-2、肺癌A549及胃癌SGC-7901的抑制活性。紫杉醇作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 化合物1～10的抗腫瘤活性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物1～10均表現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性。其中，化合物1、2、5、6和8表現(xiàn)為較強(qiáng)的抗腫瘤活性。

[1] Nisar M,Kaleem WA,Qayum M, et al. Biological screening of Zizyphus oxyphylla Edgew stem[J].Pak J Bot,2011,43(1):311-317.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015.

[3] 劉艷,楊炳友,劉滌航,等.洋金花中黃酮類化合物研究[J].中醫(yī)藥信息,2015,32(3):1-3.

[4] 潘娟,楊炳友,王欣.洋金花甾體類化學(xué)成分研究[J].中醫(yī)藥信息,2015,32(4):23-25.

[5] 劉艷,楊炳友,劉滌航,等.洋金花倍半萜類化合物的分離與鑒定[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2015,43(2):7-9.

[6] Salimuzzaman Siddiqui, Naheed Sultana,Salman Ahmed S,et al.Isolation and structure of a new alkaloid datumetine from the leaves ofDatura metel[J].Journal of Nature Product,1986,49(3):511-513.

[7] Cheng ZH,Wu T,Yu BY.Chemical Constituents in the Tubers ofOphiopogon japonicas[J]. Natural Product Research and Development,2005,17(1):1-3.

[8] Tripetch Kanchanapoom,Ryoji Kasai,Phannipha Chumsri,et al. Canthin-6-one andβ-carboline alkaloids from Eurycoma harmandiana[J].Phytochemistry,2001,56(3):383-386.

[9] Xu ZH,Yang JS,Lu RM,et al.A New Natural Product from Cistanche deserticola Y.C.Ma[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences,1999,8(2):61-63.

[10] Li F,He ZS,Ye Y.Riboflavin and its degradation product fromCarthamus tinctorius[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs,2004,35(3): 247-249.

[11] Zhu LH, Huang XS,Ye WC, et al. Study on Chemical Constituents of Alocasia macrorrhiza(L.) Schott[J].Chinese Pharmaceutical Journal,2012,47(13):1029-1031.

[12] Zhu LH, Meng LJ,Ye WC, et al.Study on Chemical Constituents of Alocasia macrorrhiza[J].Lishizhen Medicine and Materia Medica Research,2013,24(12):2859-2860.

[13] Shao JJ,Peng Y,He CN,et al.Isolation and identification the chemical constituents of Przewalskia tangutica Maxim [J].Journal of Shenyang Pharmaceutical University,2013,30(11):840-845.

[14] Dae Keun Kim,Kieseung Lee.Inhibitory effect of Trans-N-p-coumaroyl tryamine from the twigs of Celtis chinensis on the acetylcholinesterase[J]. Archives of Pharmacal Research,2003,26(9):735-738.

[15] Li LH,Ren FZ,Chen SH,et al.New homoisoflavanones from Polygonatum odoratum(Mill.) Druce[J].Acta Pharmaceutica Sinica,2009,44(7):764-767.

[16] Marina DellaGreca,Lucio Previtera,Raffaella Purcaro,et al.Cinnamic acid amides and lignanamides from Aptenia cordifolia[J].Tetrahedron,2006,62(12):2877-2882.

[17] 司徒鎮(zhèn)強(qiáng),吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)[M].西安:世界圖書(shū)出版公司,1996.

Alkaloids with Antitumor Activities from Pericarps ofDaturametelL.

YANG Bing-you,ZHOU Yong-qiang,LIU Yan,KUANG Hai-xue*

(Key Laboratory of Chinese Materia Medica of Ministry of Education, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

Objective：To study the alkaloids from pericarps ofDaturametelL. and screen the antitumor activities of the isolated compounds. Methods：The separation and purification were taken by silica gel column chromatography, Sephadex-LH20 and semi-preparative HPLC, and the structural identification was based on physicochemical property,1H-NMR and13C-NMR as well as HR-MS data. The isolated compounds were evaluated according to antitumor activities of HepG-2, A549 and SGC-7901 by MTT method. Results：Ten alkaloids were obtained from the ethyl acetate of 70% ethanol extract of pericarps of D. metel L. and the structures were identified as cyclo(PheTyr)(1), 9-hydroxycanthin-6-one(2), (2,5-dioxo-4-imidazolidinyl)-carbamic acid(3), 1-ribityl-2,3-diketo-1,2,3,4-tetrahydro-6,7-dimethyl-quinoxaline(4), grossamide(5), cannabisin F(6), hyoscyamine(7), Trans-N-p-coumaroyl tyramine(8), N-trans-feruloyloctopamine(9) and (2S,E)-N-[2-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]ferulamide(10), respectively. All isolated possessed the potential anti-tumor activity in vitro. Conclusion：Compounds 1-4 are isolated from the plants of Solanaceae for the first time, and compounds 1, 2, 5, 6 and 8 exhibit a strongly antitumor activity.

Solanaceae; Pericarps; Alkaloids;DaturametelL.; Antitumor activity

黑龍江省高校長(zhǎng)江學(xué)者后備支持計(jì)劃(No.2013CJHB006)；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目(No.yjscx2016010)

楊炳友(1970-)，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥及復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

匡海學(xué)*(1955-)，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥及復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

2017-01-21

R28

A

1002-2406(2017)03-0005-04

修回日期：2017-02-07