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        中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇抗乳腺癌MCF-7細(xì)胞作用的研究

        2017-06-05 15:18:54王曉文張北山張麗巖路曉光唐勁天李利亞
        關(guān)鍵詞:紫杉醇乳腺癌

        謝 青,王曉文,汪 悅,張北山,張麗巖,路曉光,毛 昀,唐勁天,李利亞?

        (1.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029;2.中日友好醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合腫瘤科,北京 100029;3.清華大學(xué)工程物理系 醫(yī)學(xué)物理與工程研究所醫(yī)療新技術(shù)實(shí)驗(yàn)室,北京 100084)

        中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇抗乳腺癌MCF-7細(xì)胞作用的研究

        謝 青1,2,王曉文3,汪 悅3,張北山3,張麗巖3,路曉光2,毛 昀2,唐勁天3,李利亞2?

        (1.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029;2.中日友好醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合腫瘤科,北京 100029;3.清華大學(xué)工程物理系 醫(yī)學(xué)物理與工程研究所醫(yī)療新技術(shù)實(shí)驗(yàn)室,北京 100084)

        目的:研究中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇抗人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的作用。方法:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞分別暴露于電刺激、紫杉醇、電刺激與紫杉醇聯(lián)合作用下,采用cck8法檢測(cè)細(xì)胞存活率,并運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)分析各組實(shí)驗(yàn)作用下對(duì)細(xì)胞凋亡/死亡、細(xì)胞周期的影響。結(jié)果:中頻交變電流(100kHz,110mA,30min)作用MCF-7細(xì)胞后,細(xì)胞存活率為70±5.24%,聯(lián)合紫杉醇(IC50)治療后,細(xì)胞存活率為24±1.81%(P<0.01);中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇能夠增加細(xì)胞凋亡率,阻滯細(xì)胞于S期、G2/M期。結(jié)論:中頻交變電流單獨(dú)使用可以抑制MCF-7細(xì)胞增殖,聯(lián)合紫杉醇應(yīng)用時(shí)能表現(xiàn)出協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

        中頻交變電流;紫杉醇;人乳腺癌MCF-7細(xì)胞;細(xì)胞周期;凋亡

        Author’s addressBeijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China

        中頻交變電場(chǎng)(100~300kHz,1~2V/cm),亦稱腫瘤治療電場(chǎng)(tumor treating fields,TTFields),在抗腫瘤作用領(lǐng)域具有獨(dú)特的生物學(xué)機(jī)制和效應(yīng),如引起Septin 2、6、7蛋白定位障礙[1],干擾α/β微管聚合,影響紡錘體的形成,使腫瘤細(xì)胞有絲分裂中期異常中斷[2,3],減少 CD34(+)細(xì)胞,抗血管生成[4,5]和p53依賴,引起腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡,且副反應(yīng)較低,已被FDA批準(zhǔn)正式應(yīng)用于臨床治療復(fù)發(fā)腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[6,7]。而交變電流不僅具有抗腫瘤作用[8],還可以減少耐藥蛋白在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá),增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的攝取,協(xié)同化療藥物抑制腫瘤細(xì)胞增殖[9]。電流和電場(chǎng)具有的生物學(xué)效應(yīng),在醫(yī)學(xué)上的運(yùn)用越來(lái)越廣[10]。目前已針對(duì)不同類型腫瘤,如腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[11]、非小細(xì)胞肺癌[12]、胰腺癌[13]、前列腺癌[14]等開(kāi)展了一系列基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床研究,并取得一定的抗腫瘤效果。

        本實(shí)驗(yàn)室自2008年開(kāi)始,首次將中頻電場(chǎng)和電流結(jié)合,即中頻交變電流(alternating current at intermediate frequency,ACIF)。已證實(shí)中頻交變電流對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞、BEL-7402細(xì)胞、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、乳腺癌MCF-7細(xì)胞等具有不同程度的抑制作用[15]?;熕幬镒仙即寄軌蛞种萍?xì)胞微管解聚,促進(jìn)微管聚合并穩(wěn)定微管,阻滯細(xì)胞于G2/M期,達(dá)到抗腫瘤目的。然而,近年來(lái)腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥性逐漸增加,迫切需要找到新的方法與紫杉醇聯(lián)合使用,增加抗腫瘤療效。因此,本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步研究ACIF聯(lián)合紫杉醇抗人乳腺癌MCF-7細(xì)胞作用效果。

        1 材料

        1.1 細(xì)胞株

        人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株,由北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)提供。

        1.2 儀器設(shè)備

        中頻交變電流治療儀,清華大學(xué)醫(yī)療新技術(shù)實(shí)驗(yàn)室研發(fā);電極:鉑金材質(zhì)。多功能讀數(shù)儀-酶標(biāo)儀,美國(guó)Thermo Scientific公司;BD FACSCalibur型流式細(xì)胞分析儀,美國(guó)BD公司。

        1.3 藥品與試劑

        紫杉醇(紫素),批號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H10980069,購(gòu)自北京協(xié)和藥廠;cck8試劑盒,日本同仁化學(xué)研究所;RPMI-1640培養(yǎng)基,美國(guó)Gibco公司;胎牛血清(FBS),美國(guó)Hyclone公司;細(xì)胞DNA含量(細(xì)胞周期)即時(shí)檢測(cè)試劑盒,南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒,南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

        2 方法

        2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

        將人乳腺癌MCF-7細(xì)胞以1×104/ml濃度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中,加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,放置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí),將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用PBS洗3次,胰酶消化后,加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基終止消化,吹打混勻(避免氣泡產(chǎn)生),吸入到離心管中離心,倒掉上清液,加入適量的培養(yǎng)基,調(diào)整所需細(xì)胞濃度至1.5×104/ml。

        2.2 不同中頻交變電流對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的研究

        設(shè)置對(duì)照組:正常培養(yǎng)細(xì)胞;電刺激組:選取中頻交變電流參數(shù)100kHz、30min,分別予50mA、70mA、90mA、110mA、130mA、150mA的電流刺激細(xì)胞,每個(gè)電刺激組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104/ml,每孔2ml,接種于24孔板中,37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,分別予中頻交變電流刺激MCF-7細(xì)胞,每隔24h刺激1次,共3次。刺激結(jié)束后,棄去培養(yǎng)基,每孔避光加入 0.5ml的cck8工作液,37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中避光孵育2h,用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm波長(zhǎng)處各孔的OD值。細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD×100%。

        2.3 不同紫杉醇藥物濃度抑制MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)情況

        設(shè)置對(duì)照組:正常培養(yǎng)細(xì)胞;紫杉醇組:調(diào)整紫杉醇的藥物培養(yǎng)基濃度分別為:0.01、0.1、1、10、100、1000nmol/L,每一物質(zhì)的量濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104/ml,每孔2ml,接種于24孔板中,37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24h后,換上含有上述紫杉醇的藥物培養(yǎng)基避光培養(yǎng)。培養(yǎng)72h后,測(cè)定各組的OD值(方法同“2.2”項(xiàng))。

        2.4 中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響

        設(shè)置對(duì)照組:正常培養(yǎng)細(xì)胞;電刺激組:刺激參數(shù)為100kHz,110mA,30min;紫杉醇組:物質(zhì)的量濃度為31nmol/L(IC50);聯(lián)合組:電刺激+紫杉醇組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104/ml,每孔2ml,接種于24孔板中,每組4個(gè)復(fù)孔,37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24h后,紫杉醇組與聯(lián)合組分別換上31nmol/L的紫杉醇藥物培養(yǎng)基。每隔24h分別予中頻交變電流作用于電刺激組與聯(lián)合組1次,共3次。刺激結(jié)束后,測(cè)定各組的OD值(方法同“2.2”項(xiàng))。

        2.5 中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇抑制MCF-7細(xì)胞后的恢復(fù)時(shí)間研究

        分組方法同“2.4”項(xiàng)。各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別在24h內(nèi)暴露于電刺激、紫杉醇藥物及聯(lián)合作用,再換上正常培養(yǎng)基。分別于24、48、72h檢測(cè)各組的OD值(方法同“2.2”項(xiàng))。

        2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞凋亡/死亡及細(xì)胞周期

        分組方法同“2.4”項(xiàng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至1.5×104/ml,每孔2ml,接種于24孔板中,每組8個(gè)復(fù)孔,37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24h后,紫杉醇組與聯(lián)合組分別換上31nmol/L的紫杉醇藥物培養(yǎng)基。每隔24h分別予中頻交變電流作用于電刺激組與聯(lián)合組1次,獨(dú)立實(shí)驗(yàn)共3次。

        表1 不同ACIF刺激后腫瘤細(xì)胞的存活率(%)

        表2 不同濃度紫杉醇對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響

        2.6.1 細(xì)胞凋亡/死亡

        各組細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化搜集到離心管,于2000r/min離心10min,棄去上清液,用PBS洗滌2次,加入500滋l的Binding Buffer懸浮細(xì)胞,予5滋l Annexin V-FITC混勻后,再加入5ul Propidium Iodide混勻,室溫避光反應(yīng)10 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

        2.6.2 細(xì)胞周期

        各組細(xì)胞用胰酶消化搜集到離心管,于2000r/min離心10min,棄去上清液,用PBS洗滌細(xì)胞1次,于2000r/min離心5min,搜集并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml,取1ml單細(xì)胞懸液離心,棄去上清液,在細(xì)胞中加入體積分?jǐn)?shù)為70%的冷乙醇500ul固定2h,4℃保存。2000r/min離心10min,棄去上清液,加入100滋l RNase A 37℃水浴30min,再加入400滋l PI染色混勻,4℃避光30min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

        2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件,數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)。

        3 結(jié)果

        3.1 不同中頻交變電流對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響

        隨著電流增加,乳腺癌MCF-7細(xì)胞的存活率越來(lái)越低,表明中頻交變電流對(duì)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞具有較好的抑制作用(見(jiàn)表1)。

        3.2 不同紫杉醇藥物濃度抑制MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)情況

        隨著紫杉醇藥物濃度的增加,其對(duì)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的抑制率越來(lái)越強(qiáng),紫杉醇對(duì)MCF-7細(xì)胞的IC50為31nmol/L(見(jiàn)表2)。

        3.3 中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響

        中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇(IC50)作用于MCF-7細(xì)胞,細(xì)胞存活率為24±1.81%,相對(duì)于紫杉醇組:52±3.97%,MCF-7人乳腺癌細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01)。由此可知,中頻交變電流(ACIF)聯(lián)合紫杉醇對(duì)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞具有協(xié)同殺傷作用。

        3.4 對(duì)MCF-7細(xì)胞治療24h后恢復(fù)時(shí)間過(guò)程的影響

        各實(shí)驗(yàn)組在24h內(nèi)治療后,均可見(jiàn)對(duì)MCF-7細(xì)胞有不同程度的抑制作用。其中與對(duì)照組相比,電刺激組及紫杉醇組的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞減少近30%,聯(lián)合組的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞減少近50%,達(dá)到半數(shù)抑制量。在接下來(lái)的48h期間,電刺激組相對(duì)于藥物組,細(xì)胞恢復(fù)較快;聯(lián)合組、藥物組恢復(fù)較慢;其中,聯(lián)合組細(xì)胞存活率最低,僅33%(見(jiàn)圖1)。

        3.5 對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡/死亡的影響

        圖1 各組作用24h內(nèi)的恢復(fù)時(shí)間

        圖2 中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡/死亡的影響(A:對(duì)照組;B:電刺激組;C:紫杉醇組;D:聯(lián)合組)

        流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示,單獨(dú)電刺激組及紫杉醇組能夠促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡,在中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇作用后,人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡率明顯增加,與其它3組相比有顯著性差異,說(shuō)明中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇能誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡(見(jiàn)圖2)。

        3.6 對(duì)MCF-7細(xì)胞周期的影響

        流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示,治療3d后,各實(shí)驗(yàn)組G0/G1期細(xì)胞明顯減少,S期細(xì)胞明顯增多,其中,聯(lián)合治療組G2/M期細(xì)胞明顯增多,說(shuō)明中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇能改變MCF-7細(xì)胞周期,將MCF-7人乳腺癌細(xì)胞阻滯于S期、G2/M期(見(jiàn)圖3,封二)。

        4 討論

        中頻交變電流(ACIF)結(jié)合了電流和電場(chǎng)的特性,是本實(shí)驗(yàn)室首創(chuàng)。研究表明[8,10],中頻交變電流可以影響人乳腺癌MCF-7細(xì)胞周期,使細(xì)胞分裂滯后,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,且對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有明顯的影響。另外,微管在細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程中有著重要的作用,中頻交變電場(chǎng)能夠干擾腫瘤細(xì)胞微管,影響紡錘體形成,抑制細(xì)胞有絲分裂[16]。大多數(shù)以微管為作用靶點(diǎn)的藥物,如紫杉醇類、長(zhǎng)春堿類、秋水仙堿、自念珠藻環(huán)肽,能阻止細(xì)胞分裂于G2/M期,Artelastin、龍葵素等干擾細(xì)胞于 S期[17,18],誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而紫杉醇是臨床指南推薦使用的治療復(fù)發(fā)乳腺癌的常用化療藥物,還沒(méi)有進(jìn)行中頻交變電流與紫杉醇聯(lián)合作用于乳腺癌MCF-7細(xì)胞的研究。因此,本實(shí)驗(yàn)為首次探究中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇抗人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的作用效果。

        本實(shí)驗(yàn)通過(guò)cck8法測(cè)得中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇 (IC50)對(duì)MCF-7細(xì)胞的存活率為24± 1.81%,表明中頻交變電流能協(xié)同紫杉醇增加細(xì)胞毒作用;流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示,經(jīng)中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇治療3d后,G0/G1期細(xì)胞百分比明顯減少,僅占18.53±3.25%,而S期細(xì)胞及G2/M期細(xì)胞百分比(分別為50.94±3.11%、30.53±2.09%,P<0.01)明顯增多,因此推斷中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇能將MCF-7細(xì)胞阻滯在S期、G2/M期。細(xì)胞周期的紊亂是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要特征[19]。研究發(fā)現(xiàn)[20,22],在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,細(xì)胞周期蛋白(cyclin)D1可以縮短G1期,使細(xì)胞進(jìn)入S期,過(guò)度表達(dá)可致乳腺導(dǎo)管增生和導(dǎo)管癌;cyclin E過(guò)度表達(dá)可以縮短G1期,形成不穩(wěn)定的染色體,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生成、惡化。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 (cyclin-dependent kinase,CDK)抑制劑p21、p27能夠與cyclin-CDK結(jié)合,抑制其催化活性,使細(xì)胞周期停滯[23]。我們猜測(cè),中頻交變電流聯(lián)合紫杉醇能將MCF-7細(xì)胞阻滯于S、G2/M期,可能與cyclin D1、E及CDK抑制劑p21、p27有一定的關(guān)系。在流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡/死亡中,聯(lián)合組正常細(xì)胞百分比僅占1.3±0.45%,而凋亡細(xì)胞百分比高達(dá)91.3±0.93%,可以看出,中頻交變電流能夠協(xié)同紫杉醇促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡。我們猜測(cè),中頻交變電流能夠協(xié)同紫杉醇促進(jìn)細(xì)胞微管聚合,防止其解聚,阻滯細(xì)胞于S期、G2/M期,使腫瘤細(xì)胞有絲分裂中斷,共同發(fā)揮著誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的作用。

        中頻交變電流(ACIF)無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)的療法,可顯著抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖,并提高化療效果,為乳腺癌的治療和乳腺癌化療的增敏提供了新的思路。

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        Inhibiting human breast cancer MCF-7 cells proliferation with alternating current at intermediate frequency combined with paclitaxel in vitro/

        /
        XIE Qing,WANG Xiao-wen,WANG Yue,et al//Journal of China-Japan Friendship Hospital,2017 Feb,31(1):26-30

        Objective:To investigate the effect of alternating current at intermediate frequency(ACIF)in combination with Paclitaxel on cell proliferation of MCF-7 cells in vitro.Methods:Cell proliferation in culture was studied in human breast MCF-7 cell lines exposed to ACIF,Paclitaxel separately and in combinations.The growth rate of MCF-7 cells was evaluated by cck8 assay;cell apoptosis/death and cycle of MCF-7 cells were analyzed by a flow cytometry.Results:The survival rate of MCF-7 cells exposed to ACIF(100kHz,110mA,30 min)was 70±5.24%,but significantly decreased to 24±1.81%in combination with Paclitaxel(P<0.01).Moreover,ACIF in combination with Paclitaxel could promote MCF-7 cells apoptosis and induce cell growth arrest in S phase and G2/M phase.Conclusion:ACIF alone could inhibit MCF-7 cells proliferation and enhance the inhibitory effect ofpaclitaxel.

        alternating current at intermediate frequency;Paclitaxel;human breast MCF-7 cells;cell cycle;apoptosis

        R730.59;R454.1

        A

        1001-0025(2017)01-0026-05

        10.3969/j.issn.1001-0025.2017.01.007

        國(guó)家自然科學(xué)基金(81372412)。

        2* 本文通訊作者。

        謝 青(1991-),男,碩士研究生。

        2016-08-17

        2016-12-08

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