李 悅， 計(jì) 紅Δ， 薛琳琳， 馬 莉， 楊煥民， 連 帥， 郭文晉，張宇辰， 翟俊飛， 郭景茹， 劉艷芝， 甄 莉

(1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 大慶 163319； 2. 黑龍江職業(yè)學(xué)院， 雙城 150025)

不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)雞卵泡顆粒細(xì)胞孕酮、雌激素分泌水平及FSHR、LHR基因表達(dá)的影響*

李 悅1， 計(jì) 紅1Δ， 薛琳琳2， 馬 莉1， 楊煥民1， 連 帥1， 郭文晉1，張宇辰1， 翟俊飛1， 郭景茹1， 劉艷芝1， 甄 莉1

(1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 大慶 163319； 2. 黑龍江職業(yè)學(xué)院， 雙城 150025)

目的：研究培養(yǎng)不同時(shí)間雞卵泡顆粒細(xì)胞孕酮和雌激素的分泌水平，促卵泡素受體(FSHR)和促黃體素受體(LHR)的基因表達(dá)水平，推斷體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)顆粒細(xì)胞激素分泌及相關(guān)受體基因表達(dá)的影響。方法：通過(guò)細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法，分別于0 h、24 h、48 h、72 h、96 h收集雞卵泡顆粒細(xì)胞上清液，采用ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清液內(nèi)的孕酮及雌激素分泌水平，并采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)顆粒細(xì)胞內(nèi)FSHR和LHR基因表達(dá)情況。結(jié)果：在培養(yǎng)初期0 h～48 h孕酮和雌激素分泌量顯著降低(P<0.05)，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加到72 h兩種激素的分泌量又開(kāi)始增加，并達(dá)到培養(yǎng)初期水平，培養(yǎng)至96 h細(xì)胞內(nèi)孕酮和雌激素分泌量再次降低；顆粒細(xì)胞FSHR和LHR mRNA的表達(dá)水平則隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而降低(P<0.05)。結(jié)論：體外培養(yǎng)的卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)孕酮和雌激素的分泌量隨體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈先降低后升高的趨勢(shì)，可能與體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)相關(guān)，從整體上看隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)孕酮和雌激素的分泌量均降低，可能與兩種促性腺激素受體FSHR和LHR基因表達(dá)量下降相關(guān)。

蛋雞；卵泡顆粒細(xì)胞；孕酮；雌激素；促卵泡素受體；促黃體素受體

【DOI】 10.12047/j.cjap.5458.2017.044

家禽的產(chǎn)蛋性能主要取決于卵巢中卵泡的生長(zhǎng)和發(fā)育水平，卵泡是生長(zhǎng)最快的組織之一，處于產(chǎn)蛋期的家禽的卵巢中存在陸續(xù)成熟、大小不等的卵泡，而卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞與內(nèi)膜細(xì)胞的分化則是卵泡生長(zhǎng)的主要原因[1]。禽類(lèi)產(chǎn)蛋性能主要由發(fā)育至等級(jí)發(fā)育階段的卵泡數(shù)決定，而體內(nèi)激素的分泌決定著卵泡發(fā)育的等級(jí)與階段[2]。卵泡顆粒細(xì)胞層和內(nèi)膜細(xì)胞層是禽體內(nèi)雌激素、孕酮等重要的分泌組織。顆粒細(xì)胞作為卵泡的體細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞間的相互作用，對(duì)卵泡膜細(xì)胞和卵母細(xì)胞的發(fā)育、成熟及功能起重要的調(diào)控作用，進(jìn)而影響卵泡的啟動(dòng)、發(fā)育、成熟及閉鎖的全過(guò)程[3]。

研究表明，禽類(lèi)卵泡的發(fā)育主要受垂體促卵泡素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH) 和促黃體素(luteinizing hormone，LH) 的控制，前者促進(jìn)小卵泡進(jìn)入等級(jí)發(fā)育階段，后者促進(jìn)類(lèi)固醇激素合成和分泌[4]。FSH與LH要發(fā)揮作用必須依賴(lài)于相應(yīng)受體FSHR和LHR的表達(dá)，所以FSHR、LHR的表達(dá)調(diào)控對(duì)于FSH和LH實(shí)現(xiàn)自身功能是非常重要的。本實(shí)驗(yàn)主要研究培養(yǎng)不同時(shí)間雞卵泡顆粒細(xì)胞孕酮和雌激素的分泌能力及兩種促性腺激素受體基因表達(dá)水平，為提高禽類(lèi)的產(chǎn)蛋機(jī)能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

產(chǎn)蛋期(8月齡)蛋雞20只，本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)提供，飼養(yǎng)條件：21℃～23℃適宜溫度，自由攝食?？茖W(xué)飼養(yǎng)同時(shí)記錄每天產(chǎn)蛋情況。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雞顆粒細(xì)胞剝離培養(yǎng) 選用正在產(chǎn)蛋的蛋雞，取等級(jí)卵泡，通過(guò)參考Gillbert等[5]的方法并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)加以改進(jìn)，剝離顆粒細(xì)胞層。將剝離出的顆粒細(xì)胞膜在濃度為0.75%的鹽水中清洗3～4次，去除膜內(nèi)所包含的卵黃物質(zhì)，清洗后放入裝有10 ml生理鹽水的培養(yǎng)皿中。再用小剪刀將顆粒細(xì)胞膜剪成約1～3 mm3的小塊，加入2.5 μg/ml Ⅳ型膠原酶置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)消化3 min。200目濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞膜混合液，制備得到粗制的顆粒細(xì)胞懸液。將濾液以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心8 min棄上清。用含有血清的M199培養(yǎng)液清洗細(xì)胞2次以去除殘存的膠原酶，以及細(xì)胞碎片。沉淀的顆粒細(xì)胞中加入含10.0%胎牛血清的M199培養(yǎng)液1 ml充分混勻，制備成顆粒細(xì)胞懸液。取5 μl混勻的細(xì)胞懸液加入0.1%臺(tái)盼藍(lán)5 μl，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并計(jì)算出1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液中的細(xì)胞量，12孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔8×105細(xì)胞接種，隨后將細(xì)胞板放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，在37℃，5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 顆粒細(xì)胞樣品收集與凍存 顆粒細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至24 h時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)板取出，在鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，選取生長(zhǎng)狀態(tài)優(yōu)良的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，加入PBS液洗滌細(xì)胞，重復(fù)洗滌兩次，棄掉PBS液。再向每孔中加入0.3 ml胰蛋白酶，置于37℃培養(yǎng)箱中消化2 min，鏡下觀察分成為單個(gè)細(xì)胞即可加入一定量的M199培養(yǎng)液以終止消化。反復(fù)吹打孔內(nèi)細(xì)胞液，將其吹打?yàn)轭w粒細(xì)胞懸液后轉(zhuǎn)移到15 ml離心管中離心(1 000 r/min，4 min)，棄上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，密封，-80℃凍存待測(cè)。按照如上方法在分別收集培養(yǎng)0 h、48 h、72 h、96 h的細(xì)胞上清液，并在 -80℃凍存待測(cè)。

1.2.3 ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中孕酮和雌激素濃度 按照ELISA檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)中具體步驟操作，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處各孔的OD值。在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)，按照曲線(xiàn)方程計(jì)算出培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞上清液內(nèi)孕酮、雌激素濃度值。

1.2.4 顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中總RNA的提取 從-80℃冰箱中取出凍存的細(xì)胞液，室溫解凍后置于低溫離心機(jī)中1 000 r/min離心10 min，去上清。每3孔細(xì)胞中加入1 ml Trizol，充分混勻，室溫靜置5 min后，10 000 r/min離心5 min。取上清液，加入200 μl氯仿，用力振搖15 s，室溫靜置2～3 min，置于低溫離心機(jī)中進(jìn)行12 000 r/min離心15 min。離心后，管中液體分為三層，小心吸取上層無(wú)色水樣液體，于另一個(gè)離心管中，再加入500 μl異丙醇，室溫下靜置10 min后，12 000 r/min，離心10 min。棄去上清，可見(jiàn)管底白色小塊沉淀，加入75% 乙醇1 ml，振蕩30 s后，7 500 r/min，離心5 min。棄上清，干燥沉淀約3～5 min。

1.2.5 總RNA質(zhì)量的檢測(cè) 檢測(cè)總RNA完整性：應(yīng)用1% 瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)，取1 μl總RNA，檢測(cè)5S、18S和28S三條帶是否完整，從而確定提取的總RNA 是否能用于下一步試驗(yàn)。檢測(cè)總RNA濃度：將提取出的總RNA 1 μl溶解于20 μl DEPC處理水中，反復(fù)混勻后，取1 μl混合液應(yīng)用核酸定量分析儀測(cè)定出總RNA的OD值，測(cè)定的OD260/280比值應(yīng)在1.8～2.0之間。

1.2.6 PCR引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GeneBank中原雞FSHR和綠頭鴨LHR和GAPDH的基因序列，在保守區(qū)利用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)擴(kuò)增FSHR、LHR以及GAPDH基因的引物。內(nèi)參基因GAPDH的上游引物為5′-GCTGATGCTCCCATGTTCGTGAT-3′，下游引物為5′-GTGGTGCAAGAGGCATTGCTGAC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為86 bp。 FSHR的上游引物為5′-TCCTGTGCTAACCCTTTCCTCTA-3′，下游引物為5′-AACCAGTGAATAAATAGTCCATC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為207 bp。LHR的上游引物為5′-GTAACACTGGAATAAGGGAAT-3′，下游引物為5′-GAAGGCTTGACTGTGGATA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為191 bp。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.7 RT-PCR反應(yīng) 將提取的各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞中總RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的反應(yīng)體系反轉(zhuǎn)為cDNA，并進(jìn)行PCR反應(yīng)。擴(kuò)增條件分別為：FSHR為95℃ 5 min預(yù)變性，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min；LHR為95℃ 5 min預(yù)變性，95℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 20 s，30個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。50 μl PCR反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer 5 μl，cDNA模板1 μl，dNTP (2.5 mmol/L)8 μl，Taq酶(5 U/μl,)0.5 μl，上下游引物(20 pmol/μl)各1 μl，加水至總體積50 μl。GAPDH在以上兩個(gè)PCR反應(yīng)條件下均能反應(yīng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果采用多重比較中的字母標(biāo)記法表示。

2 結(jié)果

2.1 卵泡顆粒細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

顆粒細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色在倒置顯微鏡下觀察到培養(yǎng)初始的卵泡顆粒細(xì)胞形狀呈圓形，細(xì)胞中心可見(jiàn)黑色的點(diǎn)狀物；培養(yǎng)至24 h時(shí)，細(xì)胞逐漸開(kāi)始貼壁、增殖，貼壁良好，生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞與細(xì)胞之間有延長(zhǎng)的絲狀突起相互連接，呈多角形。培養(yǎng)至48 h時(shí)鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞形態(tài)完整，邊緣清晰。卵泡顆粒細(xì)胞在培養(yǎng)第96 h后，細(xì)胞開(kāi)始逐漸走向退化，產(chǎn)生發(fā)亮空泡狀細(xì)胞即為死亡的顆粒細(xì)胞(圖1)。

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間卵泡顆粒細(xì)胞孕酮、雌激素的分泌水平

由0 h培養(yǎng)至48 h，細(xì)胞上清液內(nèi)孕激素的濃度降低；培養(yǎng)至72 h時(shí)，分泌量升高，與培養(yǎng)24 h、48 h的細(xì)胞上清液內(nèi)孕酮濃度相比均差異顯著(P<0.05)；繼續(xù)培養(yǎng)至96 h 細(xì)胞上清液內(nèi)孕酮的濃度再次降低，與培養(yǎng)0 h、72 h的細(xì)胞上清液內(nèi)孕酮濃度相比均差異顯著(P<0.05)。而細(xì)胞內(nèi)雌激素分泌量則在培養(yǎng)24 h時(shí)降低，且與0 h相比差異顯著(P<0.05)；培養(yǎng)至48 h后，雌激素分泌量開(kāi)始逐漸升高，且培養(yǎng)72 h、96 h與培養(yǎng)24 h的細(xì)胞內(nèi)孕酮分泌量相比均差異顯著(P<0.05)。

Fig. 1 The follicular granulosa cell morphological observation in different culture time(×100) A: 0 h B: 24 h C: 48 h D: 96 h

Tab. 1 The progesterone and estrogen concentration of Granulosa cell supernatant in different culture time

Culturetime(h)Progesterone(ng/ml)Estrogen(pg/ml)00.31±0.0665.70±4.66240.21±0.05*45.65±7.67*480.17±0.02*53.86±4.12720.34±0.01#△62.32±4.53#960.22±0.07*▲57.73±3.72#

*P<0.05vs0 h;?#P<0.05vs24 h，△P<0.05vs48 h；?▲P<0.05vs72 h

2.3 細(xì)胞中總RNA的變化

提取培養(yǎng)不同時(shí)間卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)的總RNA(圖2)，經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示：總RNA條帶完整，其中28S rRNA條帶最亮，18S rRNA條帶較亮，5S rRNA最暗，說(shuō)明RNA提取完整，符合繼續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求?？俁NA經(jīng)核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定的OD260/280值在1.80～2.00之間，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.4 RT-PCR擴(kuò)增目的片段結(jié)果

將反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA作為模板擴(kuò)增目的片段后，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證目的基因。將凝膠置于紫外燈下觀察，觀察到PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物條帶清晰，目的條帶(86 bp、207 bp和191 bp)與預(yù)期大小相符，證明引物序列設(shè)計(jì)特異性較高，滿(mǎn)足后續(xù)熒光定量PCR要求(圖3)。

2.5 熒光定量檢測(cè)FSHR mRNA表達(dá)情況

應(yīng)用熒光定量?jī)x檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間FSHR mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：在0 h時(shí)，F(xiàn)SHR mRNA表達(dá)量較高，且顯著高于其他各組；隨著培養(yǎng)時(shí)間增加mRNA表達(dá)量逐漸降低。其中與培養(yǎng)48 h、72 h、96 h相比，培養(yǎng)24 h FSHR mRNA的表達(dá)量均差異顯著(P<0.05，圖4)。

Fig. 2 Total RNA of uterin、ovarian and infundibulum

Fig. 3 GAPDH, FSHR, LHR gene PCR products M: DNA Maker DL2 000; 1: GAPDH(86 bp); 2: FSHR(207 bp); 3: LHR(191 bp)

Fig. 4 The FSHR mRNA expression of granulosa cells in different culture time*P<0.05vs0 h;?#P<0.05vs24 h

2.6 熒光定量檢測(cè)LHR mRNA表達(dá)情況

應(yīng)用熒光定量?jī)x檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間LHR mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：在剛培養(yǎng)時(shí)LHR mRNA表達(dá)量較高，且顯著高于其他各組。隨著培養(yǎng)時(shí)間增加LHR mRNA表達(dá)量降低，但在培養(yǎng)48 h時(shí)LHR mRNA 的表達(dá)量升高且與培養(yǎng)24 h、72 h、96 h LHR mRNA的表達(dá)量相比均差異顯著(P<0.05，圖5)。

3 討論

雌禽卵泡發(fā)育除受FSH和LH調(diào)控外，還受到雌激素、孕酮等的其他激素的影響。雌激素由卵泡內(nèi)膜細(xì)胞分泌，它既可以促進(jìn)卵泡的發(fā)育成熟，抑制

Fig. 5 LHR mRNA expression of Granulosa cells in different culture time*P<0.05vs0 h;?#P<0.05vs24 h;?△P<0.05vs48 h

卵泡閉鎖，又可以使促性腺激素受體增多；而卵泡顆粒細(xì)胞分泌的孕酮在卵泡將要成熟時(shí)，含量不斷增多，同時(shí)又會(huì)促使LH分泌量達(dá)到高峰[6]。

顆粒細(xì)胞是內(nèi)胚層起源的上皮細(xì)胞，也是一種典型的類(lèi)固醇激素內(nèi)分泌細(xì)胞。它的主要功能是分泌孕酮，并把孕酮運(yùn)輸給細(xì)胞膜，然后再合成雌激素和雄激素[7]。孕酮是許多類(lèi)固醇激素(雌激素、雄激素和腎上腺皮質(zhì)激素)生物合成的重要前驅(qū)體。在排卵前，卵泡液中含有一定濃度的孕酮。有研究者推測(cè)，卵泡成熟的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能需要特殊的卵泡內(nèi)孕酮濃度[8]。在體外培養(yǎng)過(guò)程中顆粒細(xì)胞內(nèi)孕酮分泌量降低時(shí)雌激素分泌量也降低，而當(dāng)孕酮分泌量升高時(shí)雌激素分泌量也有所升高。這表明在體外培養(yǎng)卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)孕酮對(duì)雌激素的分泌也具有重要的調(diào)控作用。雌激素主要是在膜層分泌，而顆粒細(xì)胞內(nèi)也可以分泌少量雌激素。Richards等認(rèn)為雌激素可以通過(guò)促進(jìn)LHR表達(dá)從而促進(jìn)顆粒細(xì)胞發(fā)育[9]。當(dāng)卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)至24 h～48 h時(shí)，顆粒細(xì)胞間縫隙連接的數(shù)量增多，細(xì)胞內(nèi)雌激素分泌量顯著升高，且LHR mRNA的表達(dá)量升高，說(shuō)明此時(shí)顆粒細(xì)胞發(fā)育速度較快，且體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞內(nèi)雌激素分泌能力可通過(guò)調(diào)控LHR表達(dá)量進(jìn)而影響顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及功能。

FSHR 基因的表達(dá)依賴(lài)于不同激素的刺激。研究顯示，F(xiàn)SH對(duì)FSHR基因的表達(dá)起主要調(diào)控作用，而雌激素可以協(xié)同F(xiàn)SH促進(jìn)顆粒細(xì)胞FSHR的表達(dá)，但是單獨(dú)進(jìn)行雌激素處理時(shí)，并不能增加顆粒細(xì)胞中FSHR的表達(dá)[10]。顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)24 h～72 h時(shí)，細(xì)胞內(nèi)分泌的雌激素含量逐漸升高，但FSHR mRNA的表達(dá)量并未隨之升高，且在培養(yǎng)48 h時(shí)FSHR mRNA的表達(dá)量明顯降低。由此可見(jiàn)，顆粒細(xì)胞內(nèi)分泌的雌激素雖然與細(xì)胞內(nèi)FSHR mRNA的表達(dá)具有相關(guān)性，但并非直接調(diào)控作用。LH是垂體分泌的一種糖蛋白激素，是誘發(fā)排卵的主要因素之一。LH 的生理功能是通過(guò)分布于性腺細(xì)胞膜上的特異性受體(LHR)所介導(dǎo)的。研究發(fā)現(xiàn)，LHR 是由雌激素與FSH協(xié)同誘導(dǎo)形成的[11]，LHR分化反過(guò)來(lái)又會(huì)增強(qiáng)卵泡內(nèi)雌激素合成的能力。在卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)雌激素分泌量降低，細(xì)胞內(nèi)LHR mRNA表達(dá)量也會(huì)降低；當(dāng)LHR mRNA表達(dá)量較高時(shí)，雌激素的分泌量也會(huì)升高。因此推測(cè)，體外培養(yǎng)的卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)雌激素與LHR之間也具有相互作用。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，體外培養(yǎng)的卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)孕酮和雌激素的分泌水平降低，這可能與細(xì)胞內(nèi)兩種促性腺激素受體FSHR和LHR基因表達(dá)量下降相關(guān)，并受到體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)的影響。通過(guò)對(duì)體外培養(yǎng)不同時(shí)間內(nèi)卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)孕酮和雌激素分泌水平及相關(guān)激素受體基因表達(dá)量的檢測(cè)，為其他關(guān)于卵泡顆粒細(xì)胞分泌、功能的研究提供了理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)。

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The research of the progesterone and estrogen secretion level and the FSHR, LHR gene quantitative in granular cells culturedinvitroin different time of laying hens

LI Yue1， JI Hong1Δ， XUE Lin-lin2， MA Li1， YANG Huan-min1， LIAN Shuai1， GUO Wen-jin1，ZHANG YU-chen1， ZHAI Jun-fei1， GUO Jing-ru1， LIU Yan-zhi1， ZHEN Li1

(1. College of Animal Science and Technology, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319；2. Heilongjiang Polytechnic， Shuangcheng 150111， China)

Objective: To research the hormone secretion levels of progesterone and estrogen and the gene expression levels of two gonadotropin receptors follicle stimulating hormone receptor (FSHR) and luteinizing hormone receptor (LHR) in granular cells of laying hen, and the effect of culture time on the levels of hormone secretion and expression of related receptor gene in granulosa cells was inferred. Methods: The experiment using the method of cells culture in vitro, the granular cells supernatants of hens were collected at 0 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, the progesterone and estrogen concentrations in cell supernatants were determined by ELISA kits, and detected the expression of FSHR and LHR gene in granular cells by real-time fluorescent quantitative PCR. Results: The results showed that the progesterone and estrogen secretion reduced in the early culture of 0 h～48 h(P<0.05), with the culture time increases to 72 h, the secretion of two hormones began to increase, and reaching the level of the initial level of culture. When the cells were cultured to 96 h, the rogesterone and estrogen secretion was reduced again. The lower levels of FSHR and LHR mRNA expression in granular cells appeared with the increase of culture time, compared with the group of cell culture to 0 h, the mRNA expression levels of each groups reduced obviously(P<0.05). Conclusion: The amount of progesterone and estrogen in the cultured follicular granulosa cells decreased with the increase of in vitro culture time, and then increased. This might be related to the growth state of cells cultured in vitro. But on the whole, with the extension of the training time, the secretion of progesterone and estrogen in the cells decreased. This may be related to the decreased expression of the FSHR and LHR genes in the two gonadotropin receptors.

laying hens； granular cells； progesterone； estrogen； follicle-stimulating hormone receptor； luteinizing hormone receptor

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31302052)；黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZD201116)

2016-05-26

2016-11-28

S835

A

1000-6834(2017)02-174-05

△【通訊作者】Tel： 13936967552； E-mail： jihonghljbynd@aliyu.com