李德輝,毛 毅

(重慶市開縣人民醫(yī)院 輸血科,重慶 開縣405400)

*通訊作者

MiR-29a和PTEN在腎缺血再灌注損傷中的臨床意義

李德輝,毛 毅*

(重慶市開縣人民醫(yī)院 輸血科,重慶 開縣405400)

目的 探討miR-29a和PTEN在腎缺血再灌注損傷中的表達(dá)以及臨床意義。方法 飼養(yǎng)SD大鼠50只，構(gòu)建腎缺血再灌注損傷模型，全自動生化分析儀檢測大鼠血清血肌酐、尿素氮水平，qRT-PCR檢測miR-29a的表達(dá)，western blot檢測PTEN的表達(dá)，分析miR-29a、PTEN和腎功能的相關(guān)性。結(jié)果 腎缺血再灌注損傷模型中大鼠血清血肌酐、尿素氮水平以及PTEN表達(dá)水平顯著升高，miR-29a的表達(dá)水平顯著降低。相關(guān)性分析表明miR-29a和PTEN、Scr和BUN均有顯著負(fù)相關(guān)性；而PTEN和Scr、BUN水平均有顯著正相關(guān)性。結(jié)論 在RIRI中，miR-29a和PTEN的表達(dá)和腎缺血再灌注損傷導(dǎo)致的腎功能損傷有顯著的聯(lián)系，為針對miR-29a及PTEN基因靶向治療RIRI提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

腎缺血再灌注損傷；miR-29a；PTEN；血清血肌酐；尿素氮

(ChinJLabDiagn,2017,21:0806)

腎缺血再灌注損傷(renal ischemia reperfusion injury，RIRI)是指腎組織在缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)供血以后導(dǎo)致組織器官的損傷程度反而加重的現(xiàn)象，是臨床上是急性腎損傷的常見原因之一。RIRI能夠?qū)δI小管上皮細(xì)胞(renal tubular epithelial cells，RTECs)造成不可逆性的損傷，明顯損害腎功能，影響移植腎早期功能的恢復(fù)和長期存活，嚴(yán)重影響治療效果和患者的健康[1,2]。RIRI是一個(gè)復(fù)雜的多因素調(diào)控的過程，近年來關(guān)于RIRI發(fā)生機(jī)制的研究頗多，但是確切的病理生理機(jī)制并沒有明確，還未找到理想的調(diào)控靶點(diǎn)。因此，探索RIRI的機(jī)制對臨床上RIRI的預(yù)防、診斷和治療顯得十分重要。

MicroRNA(miRNA)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼的單鏈小RNA，其和組織缺血再灌注損傷中有著密切的聯(lián)系[3-5]。最近研究表明miR-29在RIRI中的表達(dá)存在變化[6]，但是其和RIRI的進(jìn)展之間的關(guān)系還不明確。本研究通過分析miR-29以及其潛在靶基因PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)在RIRI中不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化，分析其和腎損傷的相關(guān)性，明確miR-29和PTEN在臨床上對RIRI的診斷意義。

1 材料與方法

1.1 材料

戊巴比妥鈉，北京普博斯生物科技公司；TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit購自invitrogen，SYBR Green購自Takara；引物合成于蘇州金唯智；PTEN、β-actin抗體購自Santa Cruz公司；二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物飼養(yǎng)以及RIRI模型構(gòu)建

清潔級雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量(200±20) g，鼠齡5周左右，飼養(yǎng)于21℃-25℃， 65%-70%濕度，自然光照周期環(huán)境中飼養(yǎng)，術(shù)前自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，各組大鼠均以同樣的飼養(yǎng)條件。大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(sham operation group，SO group)、RIRI組(RIRI group)，兩組有各分為5個(gè)時(shí)間點(diǎn)：0天、1天、2天、5天、7天，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只。參照文獻(xiàn)[7]的手術(shù)方式進(jìn)行RIRI模型構(gòu)建：3%戊巴比妥鈉按照1-1.5 ml/kg的比例進(jìn)行腹腔注射麻醉。經(jīng)腹正中切口，用眼科剪打開大鼠皮層，游離大鼠皮層肌層以及腹腔，切除大鼠左側(cè)腎臟，找到并游離分出右側(cè)腎蒂，用無損動脈夾夾閉腎蒂40 min后恢復(fù)灌注，RIRI模型構(gòu)建后腎臟立即由紅色變?yōu)楹谧仙?，SO group僅暴露腎蒂不夾閉。45 min后小心去除無損動脈夾恢復(fù)血流灌注，觀察腎臟顏色由暗紅色或蒼白色慢慢變?yōu)轷r紅色，表明成功恢復(fù)腎臟血流灌注；然后向腹腔注射1 ml滅菌生理鹽水以恢復(fù)腹腔環(huán)境。手術(shù)完畢，分層縫合關(guān)閉腹腔后將大鼠置于常規(guī)環(huán)境飼養(yǎng)，注意給大鼠保溫并恢復(fù)正常飲食，觀察大鼠生命體征。分別于0天、1天、2天、5天、7天斷頸法處死大鼠，取大鼠心臟血液5 ml。從大鼠背部正中取一手術(shù)切口切除腎臟，快速放入液氮中速凍備用。

1.3 腎功能檢測

經(jīng)大鼠心臟采血5 ml，室溫放置，2 500 r /min，離心10 min，留取上層血清，Olympus AU2700 全自動生化分析儀檢測大鼠血清血肌酐(Serum creatinine，Scr)、尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)水平。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

MiR-29a表達(dá)采用qRT-PCR檢測。收集組織樣品，液氮研磨，加入1 ml Trizol提取液提取組織總RNA。miRNA逆轉(zhuǎn)錄采用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit進(jìn)行。qPCR采用SYBR Green法檢測。反應(yīng)體系為：cDNA 5.0 μl；上游引物0.5 μl；下游引物0.5 μl；2× SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，ddH2O 4.0 μl，總體積為20 μl。qPCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，然后94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以GAPDH表達(dá)為內(nèi)參，相對表達(dá)水平采用2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。每個(gè)樣重復(fù)3次。檢測引物如表1。

表1 檢測引物序列

1.5 Western blot

收集組織樣品，利用全蛋白提取試劑盒抽提腎組織總蛋白。BCA法測定總蛋白濃度，10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)；一抗(PTEN稀釋比為1∶5 000，β-actin 為1∶5 000)，37℃孵育2 h，二抗室溫孵育1 h，暗室放X-光片夾中，曝光顯影、定影，用圖像分析軟件( Image Pro.Plus 6.0)對目的條帶的灰度進(jìn)行分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 大鼠的腎功能變化

Scr、BUN水平常用于反映腎功能的變化。和SOgroup相比，RIRIgroup的Scr水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。和SOgroup相比，RIRIgroup的BUN水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0h除外)均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Scr、BUN水平在1天后達(dá)到最大值，然后隨著時(shí)間的推移，Scr、BUN水平逐漸下降，7天后接近SOgroup。結(jié)果如表2所示。

2.2MiR-29a和PTEN在各組大鼠腎組織中的表達(dá)

MiR-29a的表達(dá)采用qRT-PCR檢測，結(jié)果如表3所示。和SOgroup相比，RIRIgroup的miR-29a水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MiR-29a的表達(dá)在1天后達(dá)到最小值，然后隨著時(shí)間的推移，miR-29a的表達(dá)水平逐漸上升，7天后接近SOgroup。PTEN的表達(dá)采用westernblot檢測，結(jié)果如圖1和表3所示。和SOgroup相比，RIRIgroup的PTEN水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0h除外)均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PTEN的表達(dá)在1天后達(dá)到最大值，然后隨著時(shí)間的推移，PTEN的表達(dá)水平逐漸下降，7天后接近SOgroup。

表2 各組中Scr、BUN水平

注：*表示P<0.05

表3 各組中miR-29a和PTEN表達(dá)水平

注：*表示P<0.05

圖1 PTEN在各組中的表達(dá)

2.3 實(shí)驗(yàn)組大鼠腎組織MiR-29a和PTEN表達(dá)的相關(guān)性以及和腎功能的相關(guān)性

由表1和表2可知：從RIRI各個(gè)時(shí)間點(diǎn)來看，Scr、BUN和PTEN水平在1天后達(dá)到最大值，然后隨著時(shí)間的推移，Scr、BUN和PTEN水平逐漸下降，7天后接近SO group，而miR-29a的表達(dá)在1天后達(dá)到最小值，然后隨著時(shí)間的推移，miR-29a的表達(dá)水平逐漸上升，7天后接近SO group，該結(jié)果表明在RIRI中Scr、BUN和PTEN的表達(dá)具有相同的變化趨勢，而和miR-29a的表達(dá)趨勢相反，推斷PTEN和Scr、BUN的表達(dá)可能具有正相關(guān)性，而miR-29a和Scr、BUN的表達(dá)可能具有負(fù)相關(guān)性。通過生物信息學(xué)分析表明PTEN可能為MiR-29a的潛在靶基因。相關(guān)性分析結(jié)果如表3所示，該結(jié)果表明MiR-29a的表達(dá)和PTEN、Scr和BUN的表達(dá)具有顯著負(fù)相關(guān)性(P<0.001)，PTEN的表達(dá)和Scr、BUN水平具有顯著正相關(guān)性(P<0.001)。

表3 相關(guān)性分析(相關(guān)系數(shù)r)

注：r值均為P<0.001

3 討論

RIRI能夠?qū)TECs造成不可逆性的損傷，明顯損害腎功能。Scr、BUN水平常用于反應(yīng)腎功能的變化，本研究表明RIRI中Scr和BUN水平顯著升高，其中在1天后升高達(dá)到最高點(diǎn)，隨后Scr、BUN說逐步降低，7天后Scr、BUN水平接近SO group，該結(jié)果表明RIRI能夠損傷腎功能，模型構(gòu)建成功。

MiR-29a是miR-29家族中的一個(gè)重要組成部分，在生物體內(nèi)發(fā)揮重要的作用。在糖尿病小鼠中，miR-29表達(dá)下調(diào)，和SCr和BUN水平呈負(fù)相關(guān)，過表達(dá)miR-29能夠抑制高糖環(huán)境導(dǎo)致的RTECs的損傷[8]。miR-29家族和缺血再灌注損傷也有著密切的聯(lián)系。有研究表明下調(diào)miR-29a的表達(dá)能夠保護(hù)心臟免受缺血再灌注損傷[6,9]。本研究表明miR-29a在RIRI中的表達(dá)降低，和李和文實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，李和文[10]采用基因芯片分析表明在RIRI中miR-29在RIRI中表達(dá)顯著下調(diào)。本研究還表明miR-29的表達(dá)在1天后降低到最低點(diǎn)，隨后miR-29a的表達(dá)逐步升高，7天后miR-29a的表達(dá)接近SO group， miR-29a的表達(dá)和Scr和BUN的水平呈顯著負(fù)相關(guān)，該結(jié)果提示miR-29a和腎功能損傷程度呈負(fù)相關(guān)。在RIRI中，RTECs的凋亡是RIRI的早期的病理生理變化和主要的病理表現(xiàn)特征。mir-29a在其他疾病研究中已被認(rèn)為是強(qiáng)有力的抗凋亡因子，它通過抑制靶基因的表達(dá)發(fā)揮其抗凋亡作用[11,12]，同時(shí)miR-29a能夠阻止其他原因?qū)е碌腞TECs的凋亡，保護(hù)腎組織和功能[13]。所以本研究認(rèn)為mir-29a可能能夠抑制由RIRI造成RTECs凋亡從而對腎組織起到保護(hù)作用，調(diào)控miR-29a的表達(dá)可能能夠改善RIRI導(dǎo)致的腎功能損傷。

MiRNA一般通過結(jié)合靶基因的3′-UTR調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。miR-29a的潛在靶基因有PUMA (P53 up-regulated modulator of apoptosis)[14]，Cdc42 (cell division control protein 42)和Srgap2 (SLIT-ROBO Rho GTPase-activating protein 2)[15]，PTEN等。本研究結(jié)果表明PTEN的表達(dá)和miR-29a的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說明在RIRI中miR-29a可能調(diào)控PTEN的表達(dá)。RIRI發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為可能與氧自由基生成、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎癥因子的激活、膜脂質(zhì)過氧化等多種因素有關(guān)。PTEN為一新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，通過阻止細(xì)胞生長、過快分裂或者分裂不受控制，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞分裂周期，在細(xì)胞生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用。下調(diào)PTEN能夠減少ROS和炎癥因子的表達(dá)，改善腸道缺血再灌注損傷[16]；在RIRI中，HIF-1/miR-687/PTEN信號通路通過下調(diào)PTEN的表達(dá)改善RIRI導(dǎo)致腎功能損傷[17]。本研究結(jié)果表明PTEN的表達(dá)和Scr和BUN的水平呈顯著正相關(guān)，該結(jié)果表明PTEN和腎功能損傷程度呈正相關(guān)，能夠作為臨床上RIRI的診斷基因，抑制PTEN的表達(dá)可能能夠減少ROS和炎癥因子的表達(dá)，減弱RIRI導(dǎo)致的腎功能損傷。

總之，在RIRI中，PTEN可能是miR-29a調(diào)控的靶基因，miR-29a和PTEN的表達(dá)和腎缺血再灌注損傷導(dǎo)致腎功能損傷有顯著的聯(lián)系，為針對miR-29a及PTEN基因靶向治療RIRI提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但是在RIRI中miR-29a對PTEN是否存在調(diào)控作用，參與調(diào)控的下游信號通路以及能否對RIRI的預(yù)防和治療有作用還待進(jìn)一步探討，下一步擬采用細(xì)胞和動物RIRI模型分析調(diào)控miR-29a和PTEN對RIRI的預(yù)防和治療作用，為RIRI的治療提供更多的實(shí)驗(yàn)思路。

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Clinical significance of miR-29a and PTEN in renal ischemia reperfusion injury

LIDe-hui,MAOYi*.

(ThePeople’sHospitalofKaixianCounty,Kaixian405400,China)

Objective To investigate the clinical significance of miR-29a and PTEN in renal ischemia-reperfusion injury (RIRI) in SD rat.Methods 50 SD rats were fed to structure the RIRI model.The level of serum creatinine (Scr) and blood urea nitrogen (BUN) were detected by fully automatic biochemical analyser.The expression of miR-29a were detected by qRT-PCR and the expression of PTEN were detected by western blot.The correlation of miR-29a,PTEN and renal function were analyzed.Results In RIRI rats,the level of Scr,BUN,and PTEN were significantly increased,and the level of miR-29a were significantly decreased.The expression levels of miR-29a and PTEN,Scr,BUN appeared to be negative correlation in RIRI rats,in contrast,the PTEN and Scr,BUN appeared to be positive correlation in RIRI rats.Conclusion In RIRI rats,the expression of miR-29 and PTEN had significant associated with RIRI-induce renal function injury.MiR-29 and PTEN could be a potential target genes to treat the RIRI.

renal ischemia-reperfusion injury;miR-29a;PTEN;serum creatinine;blood urea nitrogen

1007-4287(2017)05-0806-04

R446.8

A

2016-11-24)