周秋鋒，趙志剛，岳雙磊，平金良，祁水琴

（1.安吉縣人民醫(yī)院，浙江 安吉313300；2.湖州市中心醫(yī)院，浙江 湖州313000）

p16、CK 17在宮頸ASC-US細胞蠟塊中的表達及臨床價值

周秋鋒1，趙志剛1，岳雙磊1，平金良2，祁水琴1

（1.安吉縣人民醫(yī)院，浙江 安吉313300；2.湖州市中心醫(yī)院，浙江 湖州313000）

目的 探討p16、CK17在宮頸ASC-US細胞蠟塊及組織活檢標本中的表達及其臨床意義。 方法 選取120例宮頸ASC-US的細胞蠟塊及組織活檢標本，分別采用EnVision免疫組化法測定p16、CK17的表達，并分析這兩種標記物在蠟塊和活檢組織中的表達情況。 結(jié)果 p16、CK17在ASC-US細胞蠟塊及組織活檢標本中的表達一致（P＞0.05）；p16陽性與宮頸CIN的發(fā)生密切相關(guān)，而CK17陽性提示宮頸不成熟鱗狀上皮化生。 結(jié)論 在宮頸ASCUS的細胞蠟塊中聯(lián)合檢測p16、CK17表達，可進一步對ASC-US行病理診斷分類，有較好的臨床應(yīng)用價值。

宮頸ASC-US；p16；CK17；免疫組織化學(xué)染色；TCT

宮頸不典型鱗狀上皮細胞不能明確意義（atypicalsquamouscellsofundetermined significance，ASC-US）是宮頸TCT檢查中最常見的診斷結(jié)果，約占陽性病例的50%，是指鱗狀細胞有異常改變，但尚未達到鱗狀上皮內(nèi)病變（squamous intraepithelial lesion，SIL）的程度，包括增生活躍的良性病變、潛在惡性病變及惡性病變，在TCT中不能對其進行明確的分類，只是一種排除性診斷。因此，尋找對ASC-US有診斷價值的生物標志物，進一步完善和改進宮頸癌前病變的篩查和診斷方法具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年1月1日～12月30日經(jīng)TCT檢查診斷為ASC-US的病例共120例，包括安吉縣人民醫(yī)院40例、湖州市中心醫(yī)院80例，年齡28～65歲，平均44.2歲。所有病例均進行組織學(xué)活檢，活檢結(jié)果為宮頸炎49例，良性再生性病變9例，未成熟鱗化（IM）12例，CIN50例。

1.2 方法

1.2.1 細胞蠟塊制作 收集TCT保存液中剩余標本 （肉眼可見組織碎屑），于離心管中離心沉淀（2500r/min）10分鐘，棄上清液，將沉淀物集中于濾紙，置于包埋盒中，按常規(guī)方法固定及脫水，石蠟包埋切片。

1.2.2 主要試劑 鼠抗人p16、CK17單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，EnVision免疫組化試劑盒購自丹麥DAKO公司，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 120例ASC-US病例的細胞蠟塊和對應(yīng)組織切片均進行免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)采用EnVision二步法，按產(chǎn)品說明書操作，操作步驟簡述如下：組織切片經(jīng)脫蠟、脫二甲苯、水化后，0.3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶15分鐘，檸檬酸鈉緩沖液（0.01mol/L，pH6.0）微波抗原修復(fù)10分鐘，冷卻至常溫，滴加一抗（p16工作濃度1:100，CK17工作濃度1:200），37℃孵育40分鐘，滴加酶標抗鼠/兔聚合物，室溫下孵育30分鐘，滴加二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木精復(fù)染細胞核，常規(guī)脫水，透明，封片，光鏡下觀察。以PBS代替一抗作陰性對照，已知陽性宮頸上皮內(nèi)病變切片作為陽性對照。

1.3 結(jié)果判定 由2名高年資病理醫(yī)師采用雙盲法閱片進行判定，陽性為棕黃色顆粒狀，p16陽性定位于細胞核和/或胞漿，CK17陽性定位于細胞漿，上皮細胞無任何著色為（-），有上皮細胞著色為（+），腺上皮生發(fā)上皮的CK17著色視為陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 在細胞蠟塊和組織活檢標本中的表達 120例中，p16和CK17在細胞蠟塊和組織活檢標本中的陽性表達率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），即在ASC-US病例的細胞蠟塊和組織活檢標本中，p16和CK17的表達是一致的。詳見表1、圖1～4。2.2 p16、CK17在ASC-US中表達 p16診斷為CIN的陽性率細胞蠟塊為 96.0%，活檢標本為100.0%，而在其他宮頸良性病變中不表達或少量表達；CK17的陽性表達更多見于不成熟化生的病例（細胞蠟塊的陽性率為91.6%，活檢標本的陽性率為100.0%），在其他良性病變及宮頸CIN中CK17的表達均較少。這些結(jié)果提示，p16陽性與宮頸CIN的發(fā)生密切相關(guān)，而CK17陽性提示宮頸不成熟鱗狀上皮化生。

表1 細胞蠟塊和病理組織學(xué)p16、CK17陽性表達比較（%）

圖1 細胞蠟塊中p16陽性表達，呈棕黃色（EnVision×200）

圖2 組織活檢中p16陽性表達（EnVision×200）

圖3 細胞蠟塊中CK17陽性表達（EnVision×200）

圖4 組織活檢中CK17陽性表達（EnVision×200）

3 討論

p16是1994年6月由Kamb[1]報道的一種新型抑癌基因，又稱MTSl（多腫瘤抑制基因），為細胞周期依賴性激酶（CDK）抑制蛋白，通過與細胞周期素D（CyclinD）競爭CDK4、CDK6，阻止細胞由G1期進入S期，從而抑制細胞增殖[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)，p16陽性表達與HPV感染密切相關(guān)，可預(yù)測HPV陽性女性發(fā)生高級別宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變或更差臨床狀況的風(fēng)險[3-4]。本次統(tǒng)計也表明p16在宮頸CIN病變中的表達量明顯高于其他良性病變，因此，若將p16檢測與宮頸TCT檢查相結(jié)合，可用于判斷患者宮頸病變的程度及預(yù)后。

CK17目前主要用于宮頸鱗癌的診斷，CK17的表達會隨著宮頸病變的進展逐漸增高。它在宮頸早期鱗癌組織和CIN中表達率逐漸升高，在宮頸鱗癌中顯著表達，表達部位主要是瘤栓和浸潤的前沿部位，它在腺上皮細胞、成熟鱗化細胞中不表達[5]，而在不成熟鱗化細胞中呈陽性表達[6-8]。多數(shù)研究認為，CK17可作為高級別宮頸癌和CIN預(yù)測及診斷病變發(fā)展方向的標志物[9-10]。CK17表達的陽性率及強度隨CIN級別增高而逐漸增高。周滿紅[11]的實驗指出，CIN中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級的陽性表達率分別為14.3%、52.9%、68.2%，CIN III組CK17表達的陽性率明顯高于CINⅠ組。

宮頸不成熟鱗化是一種描述性診斷，在組織學(xué)診斷中有時也易與CIN病變混淆，在TCT細胞學(xué)中更易造成過診斷或診斷不明，而p16、CK17的聯(lián)合檢測，在一定程度上可有助于區(qū)分這兩種病變，指導(dǎo)臨床作出正確的處理。

TCT技術(shù)比組織活檢更適合宮頸病變的篩查工作，提高了宮頸癌的檢出率，降低了病死率，但由于取材、制片及判讀主觀性等多方面存在不足之處，如出現(xiàn)假陰性、假陽性的結(jié)果及該檢測本身具有不可重復(fù)性。行TCT檢查后剩余的細胞可用于制作細胞蠟塊，目前運用較成熟的細胞蠟塊技術(shù)可最大程度地富集細胞量，使細胞形態(tài)完整、結(jié)構(gòu)清晰，且可長期保存，重復(fù)切片進行相關(guān)實驗室檢查如免疫組化標記等，并可有效防止脫片，提高實驗的準確性[12]。本實驗發(fā)現(xiàn)，p16、CK17在ASC-US病例的細胞蠟塊和組織活檢標本中的表達是一致的，因此臨床上可以選擇使用細胞蠟塊檢查代替組織活檢，既方便、經(jīng)濟，又能避免創(chuàng)傷。

[1] Lee ES，Kim LH，Abdullah WA，et al.Expression and alteration of p16 in diffuse large B cell lymphonm.Pathobiology，2010，77（2）:96

[2] 劉微，瞿全新．細胞角蛋白與p16INK4a在宮頸癌前病變及宮頸癌中的研究進展．國際婦產(chǎn)科學(xué)雜志，2012，39（3）:262

[3] 孟慶更，蔡茹藝．宮頸癌及其癌前病變中HPV感染與p16INK4a蛋白表達的關(guān)系．北京醫(yī)學(xué)，2009，31（7）:434

[4] Carozzi Francesca，Gillio-Tos Anna，Confortini Massimo，et al.Risk of high-grade cerdcal intraepithelial neoplasia during follow-up in HPV-positive women according to baseline p16-INK4a results:a prospective analysis of a nested substudy of the NTCC randomised controlled trial.LancetOncol，2013，14（2）:168

[5] Ikeda K，Tate G，Suzuki T，et al.Coordinate expression of eytokeratin 8 and cytokeratin 17 immunohistochemical staining in cervical intraepithelial neoplasia and cervical squamous cellcarcinoma：all immunohistoehemical analysis and review of the literature.Gyneeol Oneol，2008，108（3）:598

[6] Regauer S，Reich O.CK 17 and p16 expression patterns distinguish（atypical）immature sqnamousmetaplasia from highgrade cervical intraepithelial neoplasia（CIN3）.Histopathology，2007，50（5）:629

[7] 丁嵐，楊永國，梅霞.CK17和p16在宮頸鱗狀上皮不成熟化生和宮頸上皮內(nèi)瘤變中的表達及意義.診斷病理學(xué)雜志，2009，16（3）:174

[8] 段志珍，程艷香.p16INK4a聯(lián)合CK17在宮頸上皮內(nèi)瘤變中的表達意義.華南國防醫(yī)學(xué)雜志，2014，28（9）:843

[9] 王為民，汪建華，候洪春.CK17在宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌組織中的表達及意義.實用癌癥雜志，2012，27（1）:38

[10]田迅，楊光之，田延龍，等.宮頸上皮內(nèi)瘤變和浸潤性鱗狀細胞癌中CK8、CK17的表達.診斷病理學(xué)雜志，2010，6（3）:173

[11]周滿紅.CK17和p16在宮頸CIN和宮頸早期鱗狀細胞癌中的表達及其意義.延安大學(xué)，2015

[12]吳倩，易韋，張著學(xué)，等.IMP3及p16在宮頸癌篩查脫落細胞塊中的表達和意義.中國婦幼保健，2014，29（26）:4206

安吉縣科技計劃項目（201421）