桂瑩++肖曼麗++秦原

[摘要] 目的 建立快速有效的手足口病病原體檢測方法，并探討手足口病病原體在兒童中的影響因素及防控措施。 方法 選擇2015年3～11月在湖北大學醫(yī)院感染科確診的手足口病患兒為研究對象，從中隨機抽取200例進行研究。本研究采用熒光定量RT-PCR方法對200份手足口病患者標本進行腸道病毒71型（EV71）、柯薩奇病毒普通組16型（CVA16）檢測，同時，對病例進行Logistic回歸分析來確定危險因素。 結(jié)果 200例糞便標本檢測共檢出EV71和CoxA16陽性標本共計153例。其中，普通組感染46例，重型組感染66例，危重型組感染41例。EV71陽性標本感染91例，CoxA16陽性標本共78例。Logistic回歸分析顯示，在所有調(diào)查的影響因素中，體質(zhì)弱、早產(chǎn)、病例接觸史、居住環(huán)境差、個人衛(wèi)生差5個為手足口病危險因素（P < 0.05）。 結(jié)論 熒光定量RT-PCR方法具有特異性強，靈敏度高，重復率好的優(yōu)點，非常適合手足口病病原體的檢測；EV71病原體毒力更強，對患兒身體具有更大的破壞性，可引起嚴重并發(fā)癥；兒童監(jiān)護人應為兒童提供一個良好的居住環(huán)境和個人衛(wèi)生，注意兒童膳食營養(yǎng)，避免與手足口病患兒接觸，有相關(guān)癥狀應及時入院檢查。

[關(guān)鍵詞] 手足口?。籈V71；CVA16；熒光定量RT-PCR；影響因素

[中圖分類號]R725 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）04（c）-0105-05

[Abstract] Objective To establish a rapid and effective method for the detection of pathogens in hand-foot-mouth disease， and to explore the influencing factors and control measures of hand-foot-mouth disease pathogens in children. Methods 200 patients in children diagnosed with hand-foot-mouth disease in Hubei University Hospital from March to November 2015 were randomly selected. In this study， Enterovirus 71 （EV71） and Coxsackie virus 16 （CVA16） in 200 hand-foot-mouth disease patients were tested by Quantitative real-time PCR. Logistic regression analysis was also performed to determine the risk factor. Results The results showed that a total of 153 cases of EV71 and CoxA16 positive specimens were detected in 200 stool specimens. Among them， 46 cases of common group infection， 66 cases of heavy group infection， 41 cases of severe group infection. EV71 positive specimens were 91 cases， and CoxA16 positive specimens were 78 cases. Logistic regression analysis showed that among all the influencing factors， the 5 risk factors of hand-foot-mouth disease were poor health， premature delivery， history of contact patient， poor living condition， and poor personal hygiene （P < 0.05）. Conclusion The quantitative real-time PCR method has the advantages of strong specificity， high sensitivity and good repeatability， and is very suitable for the detection of pathogens of hand-foot-mouth disease； EV71 pathogen is more virulent and more destructive to the children， and can cause serious complications； children guardians should provide children with a good living environment and a good personal hygiene， pay attention to children's nutrition， avoid contact with children with hand-foot-mouth disease， if children have associated symptoms， they should be promptly admitted to hospital.

[Key words] Hand-foot-mouth disease； EV71； CVA16； Quantitative real-time PCR； Influencing factor

手足口病是一種受多種腸道病毒引起的傳染病，該傳染病可引起患者手、足、口腔等部位產(chǎn)生皮疹和潰瘍，并伴有發(fā)熱等一系列并發(fā)癥，多發(fā)生于5歲以下的嬰幼兒[1-4]。手足口病以柯薩奇A16（CoxA16）和腸道病毒71型（EV71）為主要病原體[5-7]。兩者引起的手足口病在臨床癥狀方面較為相似，但EV71感染除了引起手足口病外，還能引起多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的癥狀[8-10]。CoxA16型病原體先于EV71發(fā)現(xiàn)，至1969年美國首次確認EV71與手足口病有關(guān)后，EV71感染與CoxA16感染交替出現(xiàn)，蔓延至世界各地[11]。近年來，我國多個省份出現(xiàn)了兒童感染EV71病毒的狀況，嚴重影響兒童的身體健康。但是，目前對引起手足口病的腸道病毒既無有效疫苗，又無特效預防藥物本病的方法。

目前，手足口病實驗室檢測主要采用病毒分離培養(yǎng)、血清學方法和普通RT-PCR方法。病毒分離培養(yǎng)和血清學方法無法及時對暴發(fā)疫情作出診斷，因其自身具有耗時長、技術(shù)要求高等限制因素；而普通RT-PCR方法雖然具有敏感、特異等優(yōu)點，但步驟繁瑣、耗時長、易交叉污染等，熒光定量RT-PCR技術(shù)是新興針對病原體核酸的快速檢測技術(shù)，該方法具有定量檢測、快速、靈敏度高、特異性強以及自動化程度高的特點，已在其他領(lǐng)域被廣泛應用，但在手足口病病原體檢測方面應用較少[12-13]。

因此，為了建立快速有效的手足口病病原體檢測方法，用于手足口病的精準檢測，并探討手足口病病原體在兒童中的影響因素及有效防控措施。本研究采用熒光定量RT-PCR方法對200份病例進行檢測，并通過對病例進行Logistic回歸分析，以期為兒童手足口病病原體的檢測和防控提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取湖北大學醫(yī)院感染科2015年3～11月收治的200例患兒作為研究對象，其中男110例，女90例，年齡<3歲143例，≥3歲57例。參考《手足口病診療指南》（2010年版）中記錄的診斷標準，依據(jù)不同患病程度和類型將病例分為普通組、重型組和危重型組。普通組發(fā)病情況較輕，主要是手足口等部位出現(xiàn)皮疹；重型組患兒有頭痛、嗜睡、身體無力、嘔吐等神經(jīng)系統(tǒng)損傷癥狀；危重型組有神經(jīng)系統(tǒng)損傷癥狀并且伴有呼吸困難、頻繁抽出、咳血等嚴重并發(fā)癥狀。最終確定普通組66例，重型組84例，危重型組50例。采集普通組、重型組和危重型組患者的糞便標本，每份4～10 g，采集后放入無菌采便管內(nèi)，記錄編號、發(fā)病日期、采集日期信息，-20℃保存。

1.2 實驗試劑與儀器

無水乙醇；生理鹽水；氯仿；Trizol（北京百奧森泰生物技術(shù)有限公司）；腸道病毒71型核酸檢測試劑盒、柯薩奇病毒A16型核酸檢測試劑盒、PCR檢測試劑、陰性及EV71和CoxA16陽性質(zhì)控品（上海貝西生物科技有限公司）；ABI-7300型PCR儀（Roche 公司）等。

1.3 標本處理

將水樣糞便標本混勻，取100 μL置于1.5 mL離心管中，加入200 μL Trizol試劑及100 μL氯仿，震蕩30 s后靜置5 min，10 000 r/min離心3 min（離心半徑7.7 cm），取出上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL滅菌離心管中，加入10 μL RNA提取液，充分混勻，10 000 r/min離心3 min，棄去所有液體；加入酸提取試劑中的溶液C 400 μL，振蕩混勻，8000 r/min離心2 min，棄去液體后將裝有沉淀的離心管風干15 min，加入30 μL DPEC H2O，混勻，即得白色懸濁液。

1.4 PCR擴增體系的構(gòu)建

在3個PCR反應管中分別加入20 μL RT-PCR反應液、2 μL逆轉(zhuǎn)錄酶、4 μL Taq酶系，然后依次分別加入5 μL處理后的陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品和1.3所得待測懸濁液，8000 r/min離心50 s，然后放入PCR擴增儀進行擴增。PCR反應循環(huán)設(shè)置：45℃ 30 min，90℃ 5 min，（90℃ 20 s，50℃ 50 s）×45 cycles。

標本的EV71和CoxA16檢測步驟同上。引物及探針序列由中國疾病預防控制中心提供，EV71和CA16檢測試劑擴增目的片段位于病毒的VP1基因保守區(qū)。

1.5 方法學考察

靈敏度試驗：通過以10倍濃度梯度來稀釋樣品，至熒光定量PCR不能檢出為止，并計算最低模板拷貝數(shù)；重復性試驗：取同一份陽性樣品，分10個重復分別檢測，并計算獲得的目的基因拷貝數(shù)的變異系數(shù)；特異性試驗：提取并檢測甲型肝炎病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒RNA，來考察特異性。

1.6 問卷調(diào)查

自制調(diào)查問卷，由經(jīng)過培訓的工作人員對病例及法定監(jiān)護人進行調(diào)查，調(diào)查內(nèi)容包括患兒和家庭基本情況、出生情況、發(fā)病就診治療情況、托幼機構(gòu)所在、有無既往病史、臨床表現(xiàn)、個人衛(wèi)生情況、發(fā)病前2周手足口病患者接觸史等內(nèi)容，并抽取10%回訪進行質(zhì)量控制。病例發(fā)病相關(guān)信息通過查閱病史獲得。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，采用Logistic回歸分析對致病影響因素進行分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 標準曲線制備及標準品檢測

利用病毒載量已知的標準品（107、106、105、104拷貝/mL）進行熒光定量RT-PCR檢測，標準曲線結(jié)果顯示，Ct值與病毒拷貝數(shù)的對數(shù)相關(guān)性較好，相關(guān)系數(shù)為0.997，陰性質(zhì)控品在本試驗中未檢測出病毒（圖1）。標準曲線線性公式為Y=2.133X+34.107（圖2）。

2.2 方法學考察分析

靈敏度檢測結(jié)果顯示，最低模板拷貝數(shù)在熒光定量PCR儀上顯示為1.2×102拷貝/mL，表明靈敏度良好。甲型肝炎病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒RNA經(jīng)上述RT-PCR檢測，結(jié)果均為陰性，本試驗特異性良好。利用上述方法，重復檢測同一陽性樣本10次，每次結(jié)果均在同一Ct值內(nèi)，變異系數(shù)為3.6%，說明本次檢測重復性良好。

2.3 糞便標本檢測

200例糞便標本共檢出EV71和CoxA16陽性標本153例。其中，普通組感染46例，包括EV71 12例，CoxA16 30例，混合感染4例；重型組共感染66例，包括EV71 37例，CoxA16 24例，混合感染5例；危重型組共感染41例，其中，EV71 26例，CoxA16 8例，混合感染7例（表1）。其中未檢出的47例可能感染除EV71和CoxA16以外的其他手足口病致病病毒。

對手足口病患兒EV71和CoxA16檢測數(shù)據(jù)進行分析，200例檢測標本中，EV71陽性標本感染91例，包含了混合感染的病例，其中，普通組17例，重型組41例，危重型組33例（表2）；CoxA16陽性標本共78例，包含了混合感染的病例，其中，普通組34例，重型組30例，危重型組14例（表3）。

三組EV71陽性檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；重型組和危重型組EV71陽性檢出率高于普通組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。三組CoxA16陽性檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；危重型組CoxA16陽性檢出率高于普通組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表2、表3。對于造成上述差異的原因，推測是EV71較CoxA16對兒童身體功能具有更大的破壞性，可引起多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的癥狀[8-9]。

2.4 Logistic回歸分析

對可能引起手足口病的若干因素逐一進行單因素Logistic回歸分析。通過單因素分析篩選出8個可疑影響因素，其中，4個因素可能引起EV71感染。統(tǒng)計結(jié)果顯示，普通組、重型組、危重型組在體質(zhì)弱（1年內(nèi)看病≥5次）、早產(chǎn)、個人衛(wèi)生差、病例接觸史、通風情況差、家長缺乏手足口防病知識、居住環(huán)境衛(wèi)生差、居住環(huán)境差等8項上差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）（表4～5）。利用多因素Logistic回歸模型向前逐步剔除法進行分析，最終確定體質(zhì)弱、早產(chǎn)、病例接觸史、居住環(huán)境差、個人衛(wèi)生差5個為手足口病危險因素，其中，早產(chǎn)、病例接觸史、居住環(huán)境差為兒童手足口病最主要的致病危險因素（表6）。

3 討論

手足口病病原體是一種或多種腸道病毒，EV71和CoxA16是該病的主要病原體。手足口病具有傳染性，傳播途徑主要包括分泌物傳播、與患者密切接觸等，主要發(fā)病部位為手、足、口腔部位，癥狀多為皰疹和潰瘍，嚴重時可引起腦部和肺部等多種嚴重并發(fā)癥，多發(fā)生于5歲以下兒童[14-15]。目前，手足口病因較高的致殘率和致死率，已被列為丙類傳染病。快速、精準、便捷的病原體診斷對于臨床治療尤為重要。患者咽喉部分分泌物和糞便中均可檢出病毒，有研究表明，糞便因排出病毒時間可達3～5周，標本的病毒檢出率高于咽拭子[16]，因此，本研究選取糞便進行病毒核酸檢測。傳統(tǒng)手足口病病原體檢測方法，諸如病毒分離培養(yǎng)和血清學方法和普通RT-PCR方法，因其耗時長、易受污染等缺點在快速精準方面受到了限制，而熒光定量RT-PCR方法恰好克服了以上缺點，此外，本研究結(jié)果顯示，該法還具有特異性強，靈敏度高，重復率好的優(yōu)點，非常適合手足口病病原體的檢測[17-20]。

本研究對200例糞便標本檢測檢出EV71和CoxA16陽性標本共計153例。普通組感染46例，重型組感染66例，危重型組感染41例。EV71陽性標本感染91例，CoxA16陽性標本共78例。從上述研究結(jié)果可知，EV71和CoxA16病毒是兒童手足口病的主要致病病毒，所占總感染數(shù)的76.50%。此外，感染EV71的患兒數(shù)量多于感染CoxA16，且重型組和危重型組的EV71感染檢出率均顯著高于普通組，而普通組CoxA16感染檢出率僅高于危重型組，說明EV71病原體毒力更強，對患兒身體具有更大的破壞性，推測重型組和危重型組的嚴重臨床癥狀可能是因感染EV71引起的。Logistic回歸分析顯示，在所有調(diào)查的影響因素中，體質(zhì)弱、早產(chǎn)、病例接觸史、居住環(huán)境差、個人衛(wèi)生差5個為手足口病危險因素，其中，早產(chǎn)、病例接觸史、居住環(huán)境差為兒童手足口病最主要的致病危險因素。因此，為了有效地預防兒童手足口病的發(fā)生，兒童監(jiān)護人應給兒童提供一個干凈衛(wèi)生的居住環(huán)境，注意兒童膳食營養(yǎng)，合理引導兒童對自身個人衛(wèi)生的整理，包括飯前便后要洗手、勤洗澡等，最重要的是，發(fā)現(xiàn)兒童身體不適，應及時去醫(yī)院檢查，如果感染手足口病病毒，應根據(jù)醫(yī)生建議，采用最恰當?shù)姆绞街委?，并做好隔離措施。

[參考文獻]

[1] Wu YD，Shang SQ，Chen ZM，et al. Analysis of the epidemic characteristics of the etiological agents in children with hand，foot and mouth disease and its clinical significance [J]. Zhonghua Er Ke Za Zhi，2010，48（7）：535.

[2] 陳曉玲，潘曉琤，王華萍，等.手足口病病原體流行特征分析及護理[J].中華現(xiàn)代護理雜志，2015，21（5）：579-580.

[3] 吳亦棟，尚世強，陳志敏，等.手足口病病原體流行特征分析及臨床意義[J].中華兒科雜志，2010，48（7）：535-539.

[4] 章光棟.手足口病病原體流行特征的分析及臨床意義[J].當代醫(yī)藥論叢，2013，11（10）：60-61.

[5] Li L，He Y，Yang H，et al. Genetic characteristics of human enterovirus 71 and coxsackievirus A16 circulating from 1999 to 2004 in Shenzhen，People's Republic of China [J]. J Clin Microbiol，2005，43（8）：3835-3839.

[6] Cifuente JO，Lee H，Yoder JD，et al. The EV71 strain 1095 structures of procapsid and mature virion [J]. J Virol，2013，87（13）：7637-7645.

[7] Yang Q，Ding J，Cao J，et al. Epidemiological and etiological characteristics of hand，foot，and mouth disease in Wuhan，China from 2012 to 2013：outbreaks of coxsackieviruses A10 [J]. J Med Virol，2015，87（6）：954-960.

[8] Ishimaru Y，Nakano S，Yamaoka K，et al. Outbreaks of hand，foot，and mouth disease by enterovirus 71：high incidence of complication disorders of central nervous system [J]. Arch Dis Childhood，1980，55（8）：583.

[9] Komatsu H，Shimizu Y，Takeuchi Y，et al. Outbreak of severe neurologic involvement associated with Enterovirus 71 infection [J]. Pediatr Neurol，1999，20（1）：17-23.

[10] Yamashita T. Prevalence of coxsackievirus A5，A6，and A10 in patients with herpangina in Aichi Prefecture，2005 [J]. Japan J Infect Dis，2005，58（6）：390.

[11] Blomqvist S，Klemola P，Kaijalainen S，et al. Co-circulation of coxsackieviruses A6 and A10 in hand，foot and mouth disease outbreak in Finland [J]. J Clin Virol，2010，48（1）：49-54.

[12] 陳鳳花，王琳，胡麗華.實時熒光定量RT-PCR內(nèi)參基因的選擇[J].臨床檢驗雜志，2005，23（5）：393-395.

[13] 周來勇，劉芳，童健，等.實時熒光定量RT-PCR分析非小細胞肺癌SATB1的表達和臨床病理意義[J].南方醫(yī)科大學學報，2009，29（3）：534-537.

[14] Chong CY，Chan KP，Shah VA，et al. Hand，foot and mouth disease in Singapore：a comparison of fatal and non-fatal cases [J]. Acta Paediatr，2003，92（10）：1163.

[15] Mizuta K，Abiko C，Murata T，et al. Frequent importation of enterovirus 71 from surrounding countries into the local community of Yamagata，Japan，between 1998 and 2003 [J]. J Clin Microbiol，2005，43（12）：6171-6175.

[16] 劉玉霞，李紅葉，郭景霞.2011-2012年兵團部分地區(qū)手足口病監(jiān)測分析[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2013，10（27）：96-98.

[17] Schmidt NJ，Lennette EH，Ho HH. An apparently new enterovirus isolated from patients with disease of the central nervous system [J]. J Infect Dis，1974，129（3）：304-309.

[18] 朵建英，王衛(wèi)，叢喆，等.SYBR GreenⅠ實時熒光定量RT-PCR測定腸道病毒71型（EV71）RNA拷貝數(shù)方法的建立[J].中國比較醫(yī)學雜志，2010，20（7）：27-31.

[19] 張永樂，潘克女，徐岱，等.手足口病病原體實時熒光RT-PCR反應體系的建立與臨床應用[J].中華微生物學和免疫學雜志，2009，29（3）：276-278.

[20] 方巧云，琚雄飛，劉雪梅，等.176例兒童手足口病病原體檢測結(jié)果分析[J].華南預防醫(yī)學，2010，51（4）：47-49.

（收稿日期：2017-01-03 本文編輯：李亞聰）