沈建良+++潘良明++孔祥東++吳鳴+++袁紹峰
[摘要] 目的 探討大黃芒硝散對闌尾周圍膿腫的干預(yù)效果,評估其臨床應(yīng)用價值。方法 選擇SD大鼠(n=36)隨機(jī)分為假手術(shù)組、給藥組、對照組,每組12只,其中給藥組和對照組通過盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)制備闌尾周圍膿腫模型,假手術(shù)組僅開腹翻動盲腸。給藥組在右下腹涂抹大黃芒硝散5 g治療,隔天給藥;對照組涂抹凡士林,假手術(shù)組術(shù)后不予處理。對動物的體溫、體重和白細(xì)胞數(shù)量等進(jìn)行觀察,檢測血漿中炎癥因子白介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。對病區(qū)組織標(biāo)本HE染色大體評估各組局部組織炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度和變化趨勢,通過免疫組化和TUNEL實驗進(jìn)一步檢測組織中炎癥因子的分泌量及組織發(fā)生凋亡的程度。結(jié)果 各組動物的體溫及體重之間差別無統(tǒng)計學(xué)差異(P > 0.05);白細(xì)胞數(shù)量和TNF-α水平均是以對照組升高最明顯,其次為給藥組(P < 0.05);而IL-1β在各組動物的變化不顯著(P > 0.05);HE染色、免疫組化及TUNEL實驗結(jié)果顯示對照組出現(xiàn)小腸壁增厚,炎癥細(xì)胞浸潤和TNF-α分泌量增加以及組織凋亡水平增強(qiáng)的表現(xiàn),而應(yīng)用大黃芒硝散干預(yù)后,上述表現(xiàn)均得到一定緩解。結(jié)論 大黃芒硝散用于闌尾周圍膿腫的治療可在一定程度上緩解炎癥、消除腫脹,具有較好的臨床應(yīng)用價值。
[關(guān)鍵詞] 大黃芒硝散;闌尾周圍膿腫;炎癥反應(yīng);組織凋亡
[中圖分類號]R965 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210(2017)04(c)-0151-04
[Abstract] Objective To explore the intervention effect of rhubarb-mirabilite ointment on periappendiceal abscess and evaluate its clinical application value. Methods SD (Sprague Dawley) rats (n=36)were randomly divided into 3 groups: sham operation group, drug group and control group. The drug group and the control group were employed to periappendiceal abscess animal model by cecal ligation and puncture (CLP),while animals in sham operation group were only turned the cecum without CLP. The drug group were treated with rhubarb-mirabilite ointment (5 g) on the right ventral surface of the skin. The control group were treated with vaseline using the same method of delivery. While the sham operation group would not be treated after surgery. Firstly, the general indicators, such as body temperature, wight and white blood cells, were observed. And then the inflammation cytokine IL-1β and TNF-α was detected by ELISA. Further, local samples were collected in which the degree and variation trend of inflammation reaction was observed through the HE staining. And then immunohistochemical staining and TUNEL assay were also carried out to examine the secretion level of TNF-α and the degree of apoptosis in the local tissues of different groups. Results Body temperature and the weight of animals showed no significant change among different groups(P > 0.05). It was showed that the levels of white blood cells and TNF-α were the highest in the control group, while rhubarb-mirabilite could appropriately block the rise of these two indicators (P < 0.05). Besides, IL-1β didn't have obvious changes in each group (P > 0.05). Further, the results of HE staining, immunohistochemical staining and TUNEL assay indicated that significantly thickened small intestinal wall, increased inflammatory cells infiltration and TNF-α secretion and enhanced apoptosis level were observed in control group, however, these indicators could be effectively relieved in rhubarb-mirabilite ointment treated group. Conclusion rhubarb-mirabilite ointment possessed a certain effect of easing inflammation and relieving swelling in periappendiceal abscess. It has good clinical application value.
[Key words] Rhubarb-mirabilite ointment; Periappendiceal abscess; Inflammation reaction; Apoptosis
急性闌尾炎是最常見的急腹癥,其在人的一生中的發(fā)病風(fēng)險為7%~8%[1]。所有急性闌尾炎的患者中有7%的人會形成闌尾周圍膿腫[2]。闌尾周圍膿腫的形成對手術(shù)切除闌尾造成一定的困難,可能增加手術(shù)并發(fā)癥[3],因此,闌尾周圍膿腫的保守治療已被外科專家所認(rèn)可[4]。
西醫(yī)保守治療主要選用抗生素治療,但當(dāng)膿腫壁形成后,即使有較高的血藥濃度,對膿腫內(nèi)的細(xì)菌作用也較為有限[5],因此輔以中藥散劑局部外敷能進(jìn)一步改善闌尾膿腫的預(yù)后[6]?,F(xiàn)代臨床經(jīng)驗證實大黃芒硝散外敷具有消炎止痛, 預(yù)防感染, 促進(jìn)膿腫吸收等功效,在緩解腹痛腹脹、防治腹腔炎性包塊及假性囊腫形成等方面具有一定療效[7]。因此,本研究以中醫(yī)學(xué)理論為指導(dǎo),采用經(jīng)典的盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)制備闌尾周圍膿腫模型[8],并以大黃芒硝散行局部外敷治療,檢測其對闌尾周圍膿腫的治療效果,為中西醫(yī)結(jié)合治療闌尾周圍膿腫提供有力的實驗證據(jù)。
1 材料與方法
1.1動物
選用4月齡SPF級SD大鼠36只,購自西普爾-必凱公司,合格證號:SCXK(滬)2013-0016,體重(220±30)g,實驗鼠術(shù)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,喂養(yǎng)條件:溫度在18~26℃,相對濕度40%~70%,噪音85 dB以下,氨濃度20×10-6以下.通風(fēng)換氣8~12次/h。術(shù)前12 h禁食不禁水,實驗時稱重。本動物實驗經(jīng)動物倫理委員會的批準(zhǔn)備案。
1.2儀器和試劑
DY20K電子天平(上海丙林電子科技有限公司);DT-8806H 紅外電子體溫計(深圳華盛昌機(jī)械實業(yè)有限公司);全自動血液分析儀(日本SYSMEX公司);Universal32R Hettich低溫高速離心機(jī)(德國Hettich科學(xué)儀器公司); Leica DM 4000B光鏡顯微鏡(德國萊卡公司); OLYMPUS BX53倒置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司); TNF-α和IL-1βELISA試劑盒(上海鑫樂生物科技有限公司); TNF-α一抗(美國abcam公司);TNF-α二抗,DAB(福建邁新公司);TUNEL試劑盒(瑞士羅氏公司)。
1.3 動物造模
盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)制成闌尾周圍膿腫大鼠模型參考相關(guān)文獻(xiàn)[8]。具體方法為將大鼠盲腸根部結(jié)扎,用18號針穿通3次,擠出少量腸內(nèi)容物,固定于周圍小腸造成包裹,術(shù)后3 d內(nèi)腹部觸及包塊或超聲提示膿腫形成即為造模成功。假手術(shù)組只開腹、翻動腸道,但無盲腸結(jié)扎和穿孔,其余操作與模型組相同。
1.4 藥物
取生大黃和芒硝各50 g,研磨后加入少量凡士林及適量開水制備成藥膏,即用即配。
1.5 方法
動物編號后采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為三組(n=12):A組為假手術(shù)組,術(shù)后正常飼養(yǎng),不予干預(yù)措施;B組為給藥組,術(shù)后在大鼠右下腹涂抹大黃芒硝散,每只用量約5 g,隔天1次;C組為對照組,術(shù)后在大鼠右下腹凡士林,隔天1次。
1.6 觀察指標(biāo)
術(shù)后3、6、9 d對各組大鼠的體重和體溫進(jìn)行監(jiān)測。處死動物后,對血液中的白細(xì)胞數(shù)量等進(jìn)行觀察,并檢測血漿中炎癥因子白介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。通過對病區(qū)組織標(biāo)本HE染色大體評估各組局部組織炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度和變化趨勢,而后通過免疫組化和TUNEL實驗進(jìn)一步檢測組織中炎癥因子的分泌量及組織發(fā)生凋亡的程度。
1.7 統(tǒng)計學(xué)方法
采用SPSS 22.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,三組間各時間點比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較,最小顯著性差異法檢測,以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 體溫和體重
各組動物體溫未出現(xiàn)明顯的波動變化,平均體溫維持37.5℃左右(圖1A)。對照組和給藥組相較假手術(shù)組體重增長速度慢,但整體差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P > 0.05)(圖1B)。
2.2 血液白細(xì)胞數(shù)量
術(shù)后3 d,對照組白細(xì)胞數(shù)量略升高,給藥組白細(xì)胞數(shù)量未發(fā)生變化;至術(shù)后6 d,可見對照組和給藥組白細(xì)胞數(shù)量明顯增高,且對照組程度更高,但對比無顯著性差異(P > 0.05);至術(shù)后9 d時,給藥組白細(xì)胞數(shù)量基本維持在術(shù)后6 d的水平,而對照組白細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增高,并與給藥組和假手術(shù)組之間差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.01)(圖2)。
2.3 血漿炎癥因子IL-1β和TNF-α水平
造模后IL-1β在各組動物各時間點的變化不顯著(圖3A,P > 0.05);而TNF-α在不同組則出現(xiàn)不同的變化趨勢,表現(xiàn)為:①假手術(shù)組在術(shù)后3 d時呈現(xiàn)TNF-α的輕度升高,而至術(shù)后6 d和9 d時則回落至一個較低且穩(wěn)定的水平;②對照組中TNF-α則一直維持在較高的水平,且均高于假手術(shù)組;③雖然給藥組TNF-α的水平也有升高,但程度在各時間點均低于對照組,含量較為恒定且有回落的趨勢(圖3B,P < 0.05或0.01)。
2.4 病區(qū)小腸的組織學(xué)觀察
由HE染色結(jié)果(圖4)可見,假手術(shù)組腸壁及小腸絨毛均未見明顯的炎癥反應(yīng);對照組腸壁及小腸絨毛在術(shù)后3 d時明顯增厚,充滿浸潤的炎性細(xì)胞,炎性反應(yīng)的表現(xiàn)隨著時間延長逐漸加重;給藥組在術(shù)后3 d時表現(xiàn)與對照組類似,但其浸潤的炎性細(xì)胞少于對照組,且隨著時間的延長,到手術(shù)6 d和9 d時可見增厚的腸壁及小腸絨毛逐漸變薄,炎癥細(xì)胞逐漸消退,炎癥反應(yīng)出現(xiàn)了一定程度的緩解。
2.5 小腸組織TNF-α的免疫組化檢測
通過免疫組化對術(shù)后6 d和9 d病區(qū)小腸組織內(nèi)TNF-α的表達(dá)量進(jìn)行了檢測,結(jié)果顯示假手術(shù)組組織內(nèi)幾乎無TNF-α的分泌,而對照組和給藥組內(nèi)均可見到TNF-α的陽性表達(dá),且對照組明顯高于給藥組。見圖5。
2.6 小腸組織的凋亡水平檢測(TUNEL法)
小腸組織的凋亡水平檢測(TUNEL法)結(jié)果可見假手術(shù)組6 d和9 d時組織內(nèi)熒光強(qiáng)度較弱,發(fā)生凋亡的細(xì)胞較少;而對照組和給藥組的腸壁和小腸絨毛內(nèi)則可見大量陽性表現(xiàn)的細(xì)胞(綠色點狀熒光,注:黑白印刷中為白色點狀),且對照組明顯多于給藥組。見圖6。
3討論
關(guān)于闌尾周圍膿腫的治療是先行抗生素保守治療再行手術(shù)干預(yù)[9-10]還是發(fā)病后立行手術(shù)干預(yù)[11-12]一直存在爭議。為此,有學(xué)者在由穿孔導(dǎo)致的闌尾周圍膿腫中對兩種方案進(jìn)行對比,認(rèn)為這類患者先予保守治療,而后再行闌尾切除,預(yù)后更好,其分析原因為:降低并發(fā)癥的發(fā)生,縮短手術(shù)時間,降低患者住院時間[9-10]。因此認(rèn)為,術(shù)前的抗生素干預(yù)是治療闌尾周圍膿腫的關(guān)鍵,但是如果膿腫壁形成,抗生素?zé)o法充分發(fā)揮作用,而導(dǎo)致相關(guān)癥狀無法有效緩解[13]。
中醫(yī)認(rèn)為:腸癰(闌尾周圍膿腫)是因飲食不節(jié),損傷脾胃,濕熱內(nèi)蘊(yùn);或飽食后急劇奔走,腸道運(yùn)化失司等原因“醞而成膿”[14]。在演變過程中,正邪相爭決定著熱毒的局限與擴(kuò)展、吸收與蔓延。大黃芒硝散中大黃有活血祛瘀、消熱解毒、消腫止痛等功效,現(xiàn)代研究證實其具有促進(jìn)腸道蠕動、加速腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素的排出、廣譜抗菌及抑制過氧化損傷的作用[15];而芒硝主要含含水硫酸鈉(Na2SO4·10H2O)具有消除腸癰腫痛、腹?jié)M脹痛等作用。
為了探尋有效的闌尾周圍膿腫干預(yù)措施,在本研究中將大黃芒硝散局部外敷于造模區(qū)域,通過體內(nèi)試驗對其效果進(jìn)行評估。體溫和體重監(jiān)測中,各組動物的體溫均保持穩(wěn)定,這可能與大鼠良好的體溫調(diào)節(jié)能力有關(guān),造模組部分動物體重在術(shù)后6、9 d出現(xiàn)較明顯的下降,則可能是由腸道粘連,蠕動功能障礙而引起食欲下降導(dǎo)致。通過對白細(xì)胞、IL-1β和TNF-α水平的分析發(fā)現(xiàn),大黃芒硝散外敷雖然不能消除全身炎癥反應(yīng),但對其具有一定緩解作用。通過組織標(biāo)本的局部檢測分析,觀察到類似的表現(xiàn),具體為:相較對照組而言,大黃芒硝散干預(yù)后可有助于緩解小腸壁和小腸絨毛的炎性反應(yīng),如可使腫脹的腸壁變薄、浸潤的炎癥細(xì)胞減少以及TNF-α分泌水平的下降等。由于造模方式的原因,發(fā)生組織凋亡不可避免,而在TUNEL實驗的結(jié)果進(jìn)行分析時發(fā)現(xiàn)給藥組發(fā)生組織凋亡的程度低于對照組,這說明大黃芒硝具有一定延緩缺血缺氧腸壁組織凋亡的作用。
綜上所述,大黃芒硝散雖然不能完全消除闌尾周圍膿腫的腫脹和炎癥,但可在一定程度上緩解上述癥狀,若將其與抗生素聯(lián)用,可彌補(bǔ)抗生素治療的不足,進(jìn)一步改善闌尾周圍膿腫的預(yù)后,具有很好的臨床應(yīng)用價值。
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(收稿日期:2017-01-12 本文編輯:王 麗)