安媛+++張錚++杜彬++楊云霜++付曉菲+++馮博++任召祺+++楊超

[摘要] 目的 探討低溫保存對圍生期間充質(zhì)干細胞（P-MSCs）體外培養(yǎng)的生物學特性的影響。 方法 從臍帶組織分離、培養(yǎng)P-MSCs，取第3代細胞梯度降溫凍存后于液氮深低溫保存6個月后復蘇。比較低溫保存前后PMSCs的增殖活性、細胞衰老情況、細胞表面標志物及向脂肪和成骨方向分化的潛能。未經(jīng)低溫保存的第3代P-MSCs作為對照。 結果 低溫保存的P-MSCs增殖活性、衰老率與未凍存細胞相比差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。低溫保存的P-MSCs表達間充質(zhì)干細胞的表面標志CD44、CD90和CD105，且能夠向成骨和脂肪細胞分化。 結論 低溫保存復蘇后間充質(zhì)干細胞仍保持良好的體外生長特性和多向分化的潛能。

[關鍵詞] 圍生期間充質(zhì)干細胞；低溫保存；生物學特性

[中圖分類號] R394.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）04（c）-0004-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of cryopreservation on biological features of perinatal mesenchymal stem cells （P-MSCs）. Methods P-MSCs were isolated from human umbilical cord and subcultured in vitro. The third-generation P-MSCs were frozen with a controlled rate freezer and thawed 6 months after liquid nitrogen storage. The effect of cryopreservation on P-MSCs viability， senescence-associated β-gal activity， cell surface markers and adipogenic and osteogenic differentiation property were evaluated. The third-generation P-MSCs without storage were taken as control. Results After cryopreservation， P-MSCs remained maintained a growth rate similar to the P-MSCs without storage， also had the similar senescence-associated β-gal activity （P > 0.05）. The P-MSCs after cryopreservation also highly expressed CD44， CD90 and CD105， and had the adipogenic and osteogeic differentiation potential. Conclusion P-MSCs maintain their biological characteristics and have the differentiation potential after cryopreservation and thawing.

[Key words] Mesenchymal stem cells； Cryopreservation； Biological features

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一群具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的成體干細胞[1]。MSCs在特定的誘導條件下能夠分化形成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等，也可橫向分化成多種胚層來源的細胞，如胃腸道上皮細胞、肝細胞、表皮細胞、肺泡、胰腺和神經(jīng)細胞等[2-6]。此外，MSCs對造血恢復、免疫炎癥反應和血管發(fā)生等發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[7-9]。MSCs除具有以上的生物學特性外，還易于外源基因的感染和表達，且攜帶的外源基因表達具有明顯的組織特異[10]。圍生期間充質(zhì)干細胞（perinatal mesenchymal stem cells，P-MSCs）是從人臍帶、胎盤和臍帶血等圍生期組織獲得的間充質(zhì)干細胞，取材方便，在組織工程學、細胞治療等領域顯示出非常巨大的研究和應用前景[11-12]。研究顯示，P-MSCs已經(jīng)應用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、糖尿病及自身免疫性疾病的臨床試驗，具有十分廣闊的應用前景[13-15]。

細胞的制備技術具有多樣性和復雜性，國家藥監(jiān)局相繼出臺了一系列干細胞應用的指導原則[16]，規(guī)范了干細胞臨床研究和應用行為，以確保干細胞治療的安全性和有效性。目前，長期保存干細胞的方法通常是建立干細胞庫，低溫保存，以滿足在需要時進行擇期細胞移植。低溫保存效果的優(yōu)劣直接影響著P-MSCs的數(shù)量和質(zhì)量。因此，低溫保存后的P-MSCs是否能夠存活并保持其生物學特性是其臨床應用的重要因素。

1 材料與方法

1.1 材料

圍生期組織由火箭軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，征得產(chǎn)婦本人的知情同意，經(jīng)過火箭軍總醫(yī)院倫理委員會批準同意。產(chǎn)婦28歲，孕39周+2，乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等病毒學檢測均陰性。ɑ-MEM、特級胎牛血清均購自Gbico公司；細胞培養(yǎng)板/皿購自Corning公司；膠原酶、胰蛋白酶、堿性磷酸酶試劑盒和化學試劑均購自Sigma公司；細胞衰老β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所；CD44、CD90和CD105抗體購自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 P-MSCs的分離、培養(yǎng) 無菌條件下，將新鮮的臍帶組織置于含有雙抗的無菌生理鹽水中浸泡30 min，用組織鑷剝離華通氏膠和臍帶動靜脈，漂洗后用手術剪刀將臍帶剪成1 cm3的小塊，置于離心管中加入適量的Ⅰ、Ⅳ混合型膠原酶，置于37℃的孵箱中消化30～40 min后，終止消化，3000 r/min離心20 min，棄上清，用完全培養(yǎng)基（90% ɑ-MEM+10%特級胎牛血清）重懸細胞，接種于75 cm2培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。72 h后細胞換液，此后每1～2天換液1次。