唐佳運(yùn)， 王曉楠， 李 巖， 單風(fēng)平*

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110122；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110002)

蛋氨酸腦啡肽抑制人胃癌細(xì)胞BGC823增殖作用及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制

唐佳運(yùn)1,2， 王曉楠1， 李 巖1， 單風(fēng)平1*

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110122；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110002)

采用不同濃度梯度的蛋氨酸腦啡肽(methionine enkephalin，MENK)體外作用于人胃癌細(xì)胞BGC823后，探討對(duì)其增殖影響及其作用機(jī)制，為胃癌的免疫治療提供理論依據(jù)。體外培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞株BGC823，PCR檢測(cè)阿片受體OGFr的表達(dá)；用不同濃度(0、1、2、3、4 mg/mL)的MENK體外作用于BGC823細(xì)胞24、48、72、96 h后，MTS檢測(cè)MENK對(duì)其增殖影響；流式細(xì)胞術(shù)和AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)4 mg/mL MENK體外處理48、72 h后BGC823細(xì)胞凋亡變化。 結(jié)果顯示，人胃癌BGC823細(xì)胞有阿片受體OGFr的表達(dá)；MENK可抑制BGC823細(xì)胞增殖，且隨著劑量的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制作用逐漸增強(qiáng)(P<0.05)；4 mg/mL MENK 48 h處理組與空白組相比細(xì)胞凋亡率增加，72 h處理組與48 h處理組結(jié)果一致(P<0.05)。結(jié)果表明，MENK可抑制BGC823細(xì)胞增殖，具有顯著的劑量依賴性和時(shí)間依賴性，且可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制BGC823細(xì)胞的增殖。

蛋氨酸腦啡肽；阿片受體；BGC823細(xì)胞；腫瘤免疫；細(xì)胞凋亡

腫瘤是一種細(xì)胞異常分化、增殖的疾病，腫瘤發(fā)生、發(fā)展與腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖及凋亡減少密切相關(guān)[1]；目前，臨床上常用化療藥物多以增殖及凋亡作為作用靶點(diǎn)。胃癌是惡性腫瘤之一，我國(guó)死于胃癌的患者在各種惡性腫瘤中占首位[2]。化療仍是晚期胃癌的主要治療方法，但是化療的療效很難達(dá)到預(yù)期效果。現(xiàn)有化療水平已面臨瓶頸，生物治療成為有所突破的必要選擇。近年來(lái)，免疫療法成為腫瘤治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)，通過(guò)激發(fā)或調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境抗腫瘤免疫力，從而控制和殺傷腫瘤細(xì)胞，提高抗腫瘤效果[3-4]。隨著對(duì)胃癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中生物學(xué)機(jī)制的研究,也逐步將這種治療手段應(yīng)用于胃癌治療的臨床實(shí)踐。蛋氨酸腦啡肽(methionine-enkephalin，MENK)是一種由5個(gè)氨基酸組成的內(nèi)源性阿片肽，由腎上腺產(chǎn)生的前激素和前腦啡肽衍生而來(lái)[5]，非特異性識(shí)別細(xì)胞、組織與器官，在生理狀態(tài)下發(fā)揮生物學(xué)活性，不會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生依賴性、耐受性和撤藥反應(yīng)[6]。已有研究表明，MENK與阿片受體結(jié)合，從而對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞[7-8]、胸腺細(xì)胞、脾細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等一系列免疫細(xì)胞起到調(diào)節(jié)作用[9-10]。MENK的功能主要通過(guò)存在于細(xì)胞表面的受體,激活其下游的因子和蛋白表達(dá),實(shí)現(xiàn)對(duì)于靶細(xì)胞性狀和功能的調(diào)節(jié)[11]，這說(shuō)明MENK不僅僅是一種鎮(zhèn)痛劑和神經(jīng)遞質(zhì)，更是一種聯(lián)系著神經(jīng)和免疫兩大系統(tǒng)且具有調(diào)節(jié)功能的因子。本課題組前期研究已證實(shí)，MENK通過(guò)逆轉(zhuǎn)和抑制Treg發(fā)揮抗腫瘤作用[12]；通過(guò)抑制Treg激活50例腫瘤患者外周血免疫細(xì)胞，證明MENK可以高效增加癌癥患者外周血T細(xì)胞數(shù)量和活性，增加NK細(xì)胞數(shù)量和活性[13]；MENK通過(guò)激活CD8+T細(xì)胞而充分發(fā)揮其抗腫瘤的作用[14]；MENK可增加CD4+T 細(xì)胞上阿片受體表達(dá)，可直接激活CD4+T細(xì)胞，增加CD4+T細(xì)胞活性和數(shù)量，增加分泌IL-2和IFN-γ，證明MENK不僅可以單獨(dú)使用，還可以聯(lián)合其他細(xì)胞因子(IL-2或IFN-γ)顯著增強(qiáng)CD4+T細(xì)胞的功能[15-18]；MENK可以促進(jìn)DC表型和功能成熟，通過(guò)誘導(dǎo)負(fù)載腫瘤抗原DC成熟，從而發(fā)揮強(qiáng)大的抗腫瘤作用[19-20]；可以誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞M2型向M1型轉(zhuǎn)化[21]；可以誘導(dǎo)骨髓DC前體向髓樣DC分化[22]。經(jīng)典阿片受體可分為μ(mu)、δ(delta)、к(kappa)等幾種亞型[23]。1989年發(fā)現(xiàn)的新受體“zeta”可介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)，被稱為阿片生長(zhǎng)因子受體(Opioid Growth Factor Receptor，OGFr)[24]。Zagon等[25]在腫瘤細(xì)胞的核膜上發(fā)現(xiàn)了OGFr，并采用多種癌細(xì)胞系，結(jié)果表明MENK通過(guò)與其受體結(jié)合可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，進(jìn)一步用拮抗劑抑制受體表達(dá),或者敲除該受體,腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)不受限制,說(shuō)明MENK可通過(guò)OGF實(shí)現(xiàn)抑瘤效能。Cheng等[26]研究發(fā)現(xiàn)OGF受體OGFr相互作用可以抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖。本課題組前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，MENK可抑制黑色毒瘤細(xì)胞的增殖。國(guó)外有報(bào)道，作為一種新型的抗腫瘤藥物,MENK已經(jīng)進(jìn)入Ⅰ期臨床研究階段。但目前蛋氨酸腦啡肽對(duì)胃癌的影響罕見報(bào)道，本研究以人胃癌細(xì)胞株BGC823為例進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來(lái)源 人胃癌細(xì)胞株BGC823由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院惠贈(zèng)。

1.1.2 試劑 MENK(含量98%，美國(guó)Penta Biotech.)，RT-PCR試劑盒(Takara大連寶生物公司)，瓊脂糖(Takara大連寶生物公司)，Trizol(Invitrgen)，RPMI1640培養(yǎng)基(gibico)，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(天津市灝洋生物制品公司)，Annexin V 試劑盒(B.D.公司)， MTS(promega)。

1.1.3 儀器 微量加樣器(美國(guó)Thermo)，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó) Thermo)，倒置相差顯微鏡(德國(guó)Lieca)，酶聯(lián)檢測(cè)儀(美國(guó)BIO-TEK)，PCR擴(kuò)增儀(PTC-200，美國(guó)MJ RESEARCH)，流式細(xì)胞分析儀(美國(guó)BD)，精密電子天平( BS223S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，超低溫冰箱(日本SANYO)，高壓蒸汽滅菌器(日本SANYO)，高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) (TGL.20M，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將BGC823細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)液。

1.2.2 RT-PCR法檢測(cè)SGC-7901細(xì)胞中阿片受體OGFr的表達(dá) 用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)BGC823細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。引物序列：OGFr基因(NM_007346.2)：上游：5′-TCTGCGAGAACCAGGAGTGAAC-3′，下游：5′-ATCCCGTAGAAGCCCAGCA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為132 bp。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 細(xì)胞的活力測(cè)定(MTS法) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BGC823細(xì)胞，用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL，加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)。設(shè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、MENK處理(實(shí)驗(yàn)對(duì)照)組。在96孔培養(yǎng)板中，空白對(duì)照組加入100 μL不含細(xì)胞的RPMI1640培養(yǎng)液；陰性對(duì)照組加入100 μL的RPMI1640培養(yǎng)液；陽(yáng)性對(duì)照組加入100 μL含5 μg/mL 5-Fu的RPMI1640培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組加入100 μL含MENK的RPMI1640培養(yǎng)液，其中MENK處理組設(shè)1、2、3、4 mg/mL四個(gè)濃度。每個(gè)組別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，將96孔培養(yǎng)板置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72、96 h。在培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束前的4 h將培養(yǎng)板取出，每孔加20 μL MTS，避光輕輕平搖混勻，再放回培養(yǎng)箱孵育4 h。孵育時(shí)間結(jié)束后取出，避光處理用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值(A)，檢測(cè)波長(zhǎng)為500 nm，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

抑制率(%)=(((陰性對(duì)照組A-空白對(duì)照組A)-(實(shí)驗(yàn)對(duì)照組A-空白對(duì)照組A))/(陰性對(duì)照組A-空白對(duì)照組A))×100%

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞密度為2×104/mL的BGC823細(xì)胞懸液1 mL接種于24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)基補(bǔ)至2 mL，培養(yǎng)24 h后棄掉舊培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)干預(yù)，分成陰性對(duì)照組和MENK處理組兩組。其中陰性對(duì)照組更換成新鮮培養(yǎng)基，MENK處理組加入等體積的含濃度為4 mg/mL MENK的培養(yǎng)液，濃度選擇依據(jù)MTS結(jié)果決定，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48、72 h后，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，冷PBS漂洗2次(2 000 r/min，5 min)，用1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，吸取100 μL加入流式管中，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL propidiumIodidec(PI)混勻，室溫避光孵育15 min，每管補(bǔ)加400 μL 1×Binding Buffer，1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均數(shù)間采用t檢驗(yàn)，組間采用方差分析。所有的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用商品化軟件完成(IBM SPSS Statistics 18.0; SPSS Inc., Chicago, IL)，以P<0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 BGC823細(xì)胞阿片受體OGFr的表達(dá)

由圖1可見，通過(guò)RT-PCR顯示的結(jié)果表明，在132 bp處有一條明顯的條帶，說(shuō)明人胃癌細(xì)胞BGC823表達(dá)OGFr。

圖1 OGFr在BGC823細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Expression of OGFr on BGC823 cellsM: DNA Marker DL500；1: BGC823

2.2 MENK對(duì)BGC823細(xì)胞增殖作用的影響

MTS檢測(cè)結(jié)果顯示，MENK能夠抑制人胃癌細(xì)胞BGC823增殖，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)和MENK濃度的增加，促進(jìn)了對(duì)細(xì)胞的抑制作用，具有顯著的時(shí)間依賴性和劑量依賴性(P<0.05)，見圖2。

2.3 MENK對(duì)BGC823細(xì)胞凋亡影響

流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，4 mg/mL MENK體外作用于BGC823細(xì)胞48 h后，與空白對(duì)照組(RPMI1640培養(yǎng)液)相比，早期凋亡率和晚期凋亡率總和有所增加(P<0.05)；4 mg/mL MENK體外作用72 h組與其結(jié)果一致(P<0.01)，見圖3(橫坐標(biāo)代表FITC，縱坐標(biāo)代表PI)。

圖2 MENK對(duì)BGC823細(xì)胞增殖作用的影響(n=3,%)Fig.2 Effects of MENK on BGC823 cells proliferation(n=3,%)P:5 μg/mL 5-Fu； N：RPMI1640； 1：1 mg/mL MENK； 2：2 mg/mL MENK； 3：3 mg/mL MENK； 4：4 mg/mL MENK；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001

圖3 MENK對(duì)BGC823細(xì)胞凋亡影響(n=3,%)Fig.3 Effects of MENK on BGC823 cell apoptosis(n=3,%)

3 討 論

作為一種重要的內(nèi)源性阿片肽，MENK已被證實(shí)存在于多種動(dòng)物的組織器官中,為MENK的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。MENK作為抗癌藥物具有以下優(yōu)點(diǎn)：第一，MENK是內(nèi)源性阿片肽，作為一種低毒性安全可靠的藥物，具有極強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效能，作用效果可逆轉(zhuǎn)。第二，大量研究表明MENK對(duì)機(jī)體多種細(xì)胞功能有調(diào)控作用，MENK的抗癌具有廣譜性。由于OGFr存在于多種腫瘤細(xì)胞中，所以含有OGFr的癌癥都會(huì)受到MENK的作用。第三，MENK可以調(diào)控機(jī)體的免疫功能，聯(lián)合其他藥物使用可以修復(fù)其他方法導(dǎo)致的機(jī)體免疫功能紊亂。

本研究通過(guò)PCR檢測(cè)技術(shù)證實(shí)胃癌細(xì)胞系BGC823表面有OGFr的表達(dá)，為證明MENK可能通過(guò)結(jié)合OGFr抑制腫瘤細(xì)胞增殖提供理論基礎(chǔ)；MTS檢測(cè)結(jié)果表明，MENK可抑制胃癌細(xì)胞BGC823的增殖，且隨著MENK劑量的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)抑制增殖效果逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)出顯著的劑量依賴性和時(shí)間依賴性；為了分析其抑制增殖作用機(jī)制，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MENK作用后細(xì)胞凋亡變化，發(fā)現(xiàn)MENK可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制胃癌細(xì)胞BGC823的增殖。但MENK誘導(dǎo)凋亡具體作用機(jī)制及是否因通過(guò)結(jié)合OGFr完成這一效應(yīng)機(jī)制還需進(jìn)一步研究證明。

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MENK to Inhibit the Proliferation of Gastric Cancer Cell Line BGC823 and the Immunomodulatory Mechanism

TANG Jia-yun1, 2, WANG Xiao-nan1, LI Yan1, SHAN Feng-ping1

(1.Teach. &Res.Div.ofImmunol.,Schl.ofBasicMed.Sci.,ChinaMed.Uni.,Shenyang110122; 2.Coll.ofStomatol.Coll.,ChinaMed.Uni.,Shenyang110002)

The effect of different concentration gradients of methionine enkephalin (MENK) on human gastric cancer cell line BGC823invitrowas investigated its effects on proliferation and its affecting mechanism on gastric cancer, and provided theoretical foundation for gastric cancer immunotherapy. Human gastric cancer cell line BGC823 was cultured in vitro, PCR to detect the expression of opioid growth factor receptor (OGFr), 24, 48, 72, 96 h after different concentrations (0, 1, 2, 3, 4 mg/mL) of MENK were reactedinvitroon BGC823 cells, MTS to determine the effect of MENK on their proliferation. The apoptosis changes was detected 48 h and 72 h after treated with 4 mg/mL MENKinvitroby flow cytometry and Annexin V-FITC/PI double staining BGC823 cells. The results showed that human gastric cancer cell line BGC823 had the expression of OGFr. MENK could inhibit the proliferation of BGC823 cells, and with the increase of dose and the extension of time, the inhibition strengthened gradually (P<0.05). As compared with the blank groups, apoptosis rate of the group treated with 48 h with 4 mg/mL MENK increased, and the result was accord with the one treated 72 h with 4 mg/mL MENK (P<0.05). Therefore, the proliferation of BGC823 cells could be inhibited by MENK, and had significant dose-dependency and time-dependency. In addition, the BGC823 cells proliferation could be inhibited through the induction of cell apoptosis.

MENK; opioid receptor; BGC823 cells; tumor immunology; cell apoptosis

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31670921)

唐佳運(yùn) 男，碩士研究生。主要從事腫瘤免疫調(diào)節(jié)研究。E-mail：188119200@qq.com

* 通訊作者。男，博士，教授，博士生導(dǎo)師。主要從事腫瘤免疫調(diào)節(jié)研究。E-mail：fpshan@mail.cmu.edu.cn

2017-01-22；

2017-03-29

Q939.91；R73；R392

A

1005-7021(2017)02-0078-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.02.013