高景云， 呂婷婷， 錢冬萌， 胡 明， 王 斌,*

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部 病原生物學(xué)教研室，山東 青島 266071；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部 公共衛(wèi)生學(xué)院，山東 青島 266071)

感染HCMV的U251干細(xì)胞裸鼠大腦移植瘤模型的建立

高景云1， 呂婷婷1， 錢冬萌2， 胡 明2， 王 斌1,2*

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部 病原生物學(xué)教研室，山東 青島 266071；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部 公共衛(wèi)生學(xué)院，山東 青島 266071)

研究人巨細(xì)胞病毒(HCMV)感染的U251干細(xì)胞(GSCS)裸鼠顱內(nèi)成瘤情況。用單克隆培養(yǎng)法從U251細(xì)胞系中分離出GSCS，采用流式細(xì)胞儀檢測分離出的GSCS中CD133的表達(dá)，感染HCMV病毒，制備細(xì)胞密度為1×107個/mL的GSCS懸液。取20 只SPF級BALB/c裸鼠腹部麻醉，固定在立體定位儀上，在裸鼠顱腦鉆一小孔，將 3 μL干細(xì)胞懸液緩慢接種于裸鼠顱內(nèi)，隨機(jī)分為HCMV感染組和未感染HCMV組。觀察HCMV對腫瘤生長及裸鼠存活情況，處死瀕死裸鼠取腦組織做免疫組化檢測HCMV感染組膠質(zhì)瘤內(nèi)IE蛋白是否持續(xù)表達(dá)及HCMV感染對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化為血管的影響。結(jié)果顯示，經(jīng)單克隆法分選出的GSCS在無血清培養(yǎng)基中成球生長；經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，分離出的GSCS中CD133比例為98.00%；裸鼠腦內(nèi)出現(xiàn)膨脹性生長的腫瘤；HCMV感染組腫瘤組織中檢測到IE高表達(dá)，HCMV感染可促進(jìn)CD133陽性膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化為CD34陽性血管內(nèi)皮細(xì)胞。以上結(jié)果表明，HCMV的IE蛋白能在通過此方法建立的HCMV陽性移植瘤中持續(xù)表達(dá)，且HCMV能促進(jìn)GSCS分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞。

膠質(zhì)瘤；腫瘤干細(xì)胞；裸鼠；HCMV感染

人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV) 是雙鏈DNA病毒，屬于皰疹病毒β亞科，成年人感染率高達(dá)70%～100%[1]，能引起新生兒缺陷及先天性畸形[2]。近十幾年來，許多報道在多種腫瘤組織中檢測到HCMV基因的表達(dá)，其中惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中HCMV感染率約90%[3]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤是臨床最常見的原發(fā)性腦腫瘤，惡性程度高，大多數(shù)呈現(xiàn)浸潤性生長，手術(shù)治療不易切除干凈，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，而且對化療放療不敏感，預(yù)后普遍較差[4-5]。Singh等[6]研究發(fā)現(xiàn)腦腫瘤中幾乎所有的細(xì)胞均由一小部分CD133陽性細(xì)胞產(chǎn)生，即腦腫瘤干細(xì)胞 (brain tumor stem cell，BTSC)，這種細(xì)胞可能是決定腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和對各種治療敏感性的關(guān)鍵細(xì)胞，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞理論的提出，為探索HCMV感染與膠質(zhì)瘤的關(guān)系及研發(fā)診療新技術(shù)帶來新的突破[5,7]。Cobbs等[3]利用原位雙染免疫熒光技術(shù)檢測惡性膠質(zhì)瘤組織病理切片，發(fā)現(xiàn)CD133+膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，HCMV的IE基因的表達(dá)率約為60%，因此探討HCMV感染對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞可能的致病機(jī)制對膠質(zhì)瘤的治療具有重要意義。為此我們建立了BALB/c裸鼠大腦移植瘤模型，為進(jìn)一步研究HCMV感染與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細(xì)胞與裸鼠 PF級BALB/C裸鼠20 只，雄性，4～5 周齡，體質(zhì)量16～l9 g，購于常州卡文斯實(shí)驗動物有限責(zé)任公司；U251細(xì)胞株由本實(shí)驗室提供；HCMV AD169毒株(MOI值=1)由法國巴斯德實(shí)驗室惠贈。

1.1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清FBS、DMEM/F12、B27、人表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、白血病抑制因子(LIF)購自GIBCO公司；兔抗人CD133單克隆一抗、兔抗人CD34一抗、兔抗人IE一抗、羊抗兔二抗、DAB顯色液購自博士德生物公司；Alexa Fluor488標(biāo)記羊抗人IgG和Alexa Fluor610標(biāo)記羊抗兔IgG二抗購自Molecular Probes公司；顱鉆，小鼠腦立體定位儀購自F.S.T公司；流式細(xì)胞儀購自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 U251細(xì)胞中GSCS的分離與培養(yǎng) 取處于對數(shù)生長期的U251細(xì)胞用0.25%胰酶消化2 min，用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化后收集于離心管，以1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含B27(20 μL/mL)、EGF(20 ng/mL)、bFGF(20 ng/mL)、LIF(10 ng/mL)的無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，制成細(xì)胞密度為3×106個/mL的單細(xì)胞懸液10 mL，接種于T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5% CO2、95%濕度條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[8],10 d后收集第一代細(xì)胞球，用Accutase酶消化，以每孔1～2個細(xì)胞接種到96孔板中，每孔加入100 μL無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。10 d后收集由1個細(xì)胞分裂增殖形成的第2代細(xì)胞球，在T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)擴(kuò)增、傳代。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測分離出的GSCS中CD133的表達(dá) 收集通過單克隆培養(yǎng)法分離出的GSCS，制備細(xì)胞密度為1×106個/mL的單細(xì)胞懸液。按說明滴加兔抗人CD133一抗(1∶200)孵育30 min，PBS洗3 次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/mL，按說明滴加Alexa Fluor488標(biāo)記羊抗人IgG(1∶200)和Alexa Fluor610標(biāo)記羊抗兔IgG二抗(1∶200)，孵育30 min，PBS洗3 次，加緩沖液重懸，在BD流式細(xì)胞儀上檢測。

1.2.3 HCMV感染GSCS將從U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中分離出的GSCS用Accutase酶消化10 min,用無血清培養(yǎng)基制備密度為1×105個/mL的單細(xì)胞懸液置于37 ℃、5% CO2、95%濕度條件下培養(yǎng)24 h，加入HCMV(MOI值=1)輕輕混勻置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。感染12 h后,1 000 r/min離心5 min去除培養(yǎng)基，細(xì)胞通過臺盼藍(lán)染色活力大于95%，制備密度為1×107個/mL的單細(xì)胞懸液。

1.2.4 裸鼠大腦接種細(xì)胞 取20 只SPF級BALB/c裸鼠，4～6 周齡，稱重，隨機(jī)分為HCMV感染GSCS組(A組)和GSCS對照組(B組)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛腹腔麻醉裸鼠，麻醉劑量為200 mg/kg體重。將裸鼠固定在小鼠腦立體定位儀上，用碘伏消毒頭部皮膚，在頭部正中剪開0.5 cm長皮膚，暴露顱骨，用眼科鑷剝離骨膜，用小型顱鉆在冠狀縫前1.5 mm、矢狀縫右側(cè)2.0 mm處鉆一小孔，用5 μL微量注射器吸入3 μL事先準(zhǔn)備好的GSCS懸液固定到立體定位儀上，操作儀器使注射器針頭由裸鼠腦鉆孔處下降4 mm，退針1 mm，注射時間5 min，留針2 min，骨蠟封閉鉆孔，縫合皮膚。

1.2.5 荷瘤鼠生長情況及腫瘤干細(xì)胞增殖分化指標(biāo)觀察 觀察荷瘤鼠精神狀態(tài)、活動情況、神經(jīng)癥狀、飲食進(jìn)水及存活時間。記錄裸鼠接種后死亡時間，留取腦組織進(jìn)行HE染色病理檢查。免疫組織化學(xué)檢查顱內(nèi)腫瘤CD133、IE、CD34的表達(dá)。

1.2.6 腫瘤組織HE染色 裸鼠死后，取出腦組織用4%多聚甲醛溶液固定24 h，常規(guī)脫水石蠟包埋，切片厚10 μm，二甲苯脫蠟2次×5 min，無水乙醇3次×5 min，雙蒸水洗2次×5 min(吸干水)，蘇木精染色10 min，雙蒸水洗3 min(吸干水)，0.5%鹽酸乙醇分化30 s，自來水沖洗返藍(lán)(吸干水)，伊紅10 s，常規(guī)脫水，透明封片，顯微鏡下觀察。

1.2.7 免疫組化檢測腫瘤組織中CD133、IE、CD34

表達(dá) 腦組織切片厚10 μm，常規(guī)脫蠟水化，在30%H2O2室溫浸泡10 min封閉內(nèi)源性過氧化物酶，雙蒸水洗2次×3 min，微波修復(fù)抗原，5%山羊血清室溫封閉30 min，加入抗CD133(1∶500)、CD34(1∶200)和IE(1∶500)4 ℃孵育過夜，37 ℃復(fù)溫45 min，PBS洗3次×5 min,滴加二抗37 ℃孵育1 h，PBS洗3次×5 min，擦干水滴加DAB顯色液，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染30 s，自來水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯浸泡20 min，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。CD34切片進(jìn)行微血管密度(MVD)計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單克隆培養(yǎng)法分離的GSCS懸浮成球生長

處于對數(shù)生長期的U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞(圖1A)在無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后可見幾十個大小不一的半懸浮細(xì)胞球，10 d后細(xì)胞球體積增大，形成第1代腫瘤干細(xì)胞球(圖1B)，將第1代腫瘤干細(xì)胞球制成單細(xì)胞懸液，通過單克隆培養(yǎng)法分離培養(yǎng)10 d后形成第二代腫瘤干細(xì)胞球(圖1C) 。

圖1 U251細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下的生長狀態(tài)Fig.1 The U251 cell physiological status in different culture conditions

2.2 流式細(xì)胞儀檢測GSCS中CD133表達(dá)

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，用單克隆培養(yǎng)法在無血清培養(yǎng)基中分離出的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物CD133，CD133陽性細(xì)胞數(shù)比例為98.00%(圖2)。

2.3 裸鼠生長觀察及腫瘤生長情況

HCMV感染組10 只，麻醉致死1 只，致瘤率為100%。接種后12 h恢復(fù)正常覓食飲水活動，在腫瘤移植后的前2 周，荷瘤鼠的活動、進(jìn)食、飲水均正常，無死亡現(xiàn)象。至第3 周開始出現(xiàn)活動減少、進(jìn)食減少、身體消瘦、皮膚皺褶嚴(yán)重，雙眼凸起，但均未見明顯的神經(jīng)癥狀，平均生存期為(29.5±1.2) d。肉眼觀察可見，腫瘤在裸鼠腦內(nèi)生長，未穿透腦膜，但可見右側(cè)大腦膨脹性向?qū)?cè)生長，矢狀縫向?qū)?cè)偏離(圖3A)，HE染色高倍鏡下觀察顯示腫瘤細(xì)胞核變大，核異形，出現(xiàn)多核，異常分裂象(圖3B)；未感染HCMV組10 只，接種GSCS細(xì)胞，致瘤率100%，晚期表現(xiàn)與HCMV感染組相似，平均生存期為(32.2±2.7) d。Kaplan-Meier生存分析顯示HCMV感染組和HCMV未感染組存活率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<

0.05)，見表1。

圖2 用流式細(xì)胞儀檢測單克隆培養(yǎng)法分離出的GSCS中CD133的比例Fig.2 Use flow cytometry to detect the expression of CD133 in the GSCS which was selected by monoclonal culture method

圖3 移植瘤生長情況Fig.3 The growth situation of transplanted tumor

表1 兩組裸鼠存活率比較±s，d)

注：兩組比較P<0.05，具有統(tǒng)計學(xué)意義，下表同

2.4 免疫組化檢測腫瘤組織中IE、CD34表達(dá)

HCMV感染組荷瘤鼠腦腫瘤組織通過免疫組化方法檢測到HCMV的IE蛋白高表達(dá)(圖4A)，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞可分化為表達(dá)CD34的血管內(nèi)皮細(xì)胞(圖4B), HCMV感染組MVD值計數(shù)高于未感染HCMV組(P<0.05),見表2。

圖4 移植瘤中IE、CD34表達(dá)Fig.4 Expressions of IE,CD34 in transplanted tumor

表2 兩組裸鼠顱內(nèi)移植瘤MVD計數(shù)的比較±s)

3 討 論

巨細(xì)胞病毒感染遍布全球，是一種傳播范圍廣泛的皰疹病毒，在我國成年人血清中HCMV抗體陽性率接近100%，HCMV感染率極高，但是關(guān)于HCMV感染與腫瘤發(fā)生的關(guān)系仍然存在爭議，HCMV感染誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的機(jī)制至今尚不清楚。近年來，關(guān)于HCMV感染與腫瘤相關(guān)的研究越來越多，許多研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中檢測到HCMV基因的表達(dá)。因此,在研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及治療時有必要把HCMV感染這一重要因素考慮在內(nèi)，雖然HCMV不是致瘤病毒，但當(dāng)腫瘤發(fā)生后HCMV可以協(xié)同腫瘤發(fā)展、遷移。本研究建立了感染HCMV的腦腫瘤干細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，初步探討了HCMV感染腫瘤干細(xì)胞的方法。進(jìn)一步的研究將從體內(nèi)血清HCMV抗體陽性的腦膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織中取原代細(xì)胞培養(yǎng)，分離出腦腫瘤干細(xì)胞，建立HCMV陽性的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞裸鼠大腦移植瘤模型。

膠質(zhì)瘤是人類最常見的原發(fā)性惡性腦腫瘤，發(fā)病率呈逐年遞增趨勢，其惡性程度高、多呈浸潤生長，治療困難，手術(shù)后復(fù)發(fā)率高。由于膠質(zhì)瘤中含有一小部分表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞(腫瘤干細(xì)胞)，這些腫瘤干細(xì)胞數(shù)量雖然很少，卻在腫瘤治療中起關(guān)鍵作用。研究膠質(zhì)瘤首先應(yīng)研究膠質(zhì)瘤干細(xì)胞特性，將有助于指導(dǎo)臨床對膠質(zhì)瘤的治療及預(yù)后評估。本研究采用單克隆法從U251細(xì)胞系中成功分離出懸浮生長的細(xì)胞球，結(jié)果與Singh等[6]和Clarke等[9]結(jié)果相符。分離出的腫瘤細(xì)胞球高表達(dá)CD133，證明了U251細(xì)胞系中存在腦腫瘤干細(xì)胞。其他分離膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的方法有流式細(xì)胞分選法和免疫磁珠法等，這些方法均能分離出高純度的腫瘤干細(xì)胞。但由于細(xì)胞系中腫瘤干細(xì)胞含量很少，用流式細(xì)胞分選和免疫磁珠分選法分離出盡可能多的腫瘤干細(xì)胞至少從第一代腫瘤細(xì)胞球中分選。CD133陽性膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖分化能力。有學(xué)者認(rèn)為，腫瘤的致瘤性可能由數(shù)量很少的一部分腫瘤干細(xì)胞決定[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)HCMV感染促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，這一現(xiàn)象與Maussang等[12]研究結(jié)果相符。HCMV感染促進(jìn)腫瘤生長，增加了腫瘤惡性程度。本研究建立的HCMV陽性膠質(zhì)瘤干細(xì)胞裸鼠原位移植瘤模型，為研究膠質(zhì)瘤的化療新藥物提供了參考。

[1] Revello MG，Gerna G.Diagnosis and Management of Human Cytomegalovirus Infection in the Mother,Fetus,and Newborn Infant[J].Clin Microbiol Rev,2002,15(4)：680-715.

[2] Revello MG,Zavattoni M，F(xiàn)urione M，et al.Preconceptional primary human cytomegalovirus infection and risk of congenital infection[J]. Infect Dis,2006,193(6):783-787.

[3] Cobbs C S，Harkins L，Samanta M，et al.Human cytomegalovirus infection and expression in human malignant glioma[J]. Cancer research, 2002，62(12):3347-3350.

[4] Germano I，Swiss V，Casaccia P．Primary brain tumors，neural stem cell and brain tumor cancer cells：where is the link?[J].Neuropharm acology，2010，58(6)：903-910．

[5] Ji J，Black KL，Yu JS．Glioma stem cell research for the development of immunotherapy[J]．Neurosurg Clin N Am，2010，21(1)：159-166.

[6] Singh SK，Clarke ID，Terasaki M，et al．Identification of a cancer stem cell in human brain tumors[J]．Cancer Res,2003，63(18)：5821-5828．

[7] Cheng L，Bao S，Rich JN．Potential therapeutic implications of cancer stem cells in glioblastoma[J]．Biochem Pharmacol，2010，80(5)：654-665.

[8] Kondo T，Setoguchi T，Taga T．Persistence of a small subpopulation of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line[J]．Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(3)：781-786.

[9] Clarke MF，Dick JE，Dirks PB，et al．Cancer stem cells perspectives on current status and future directions：AACR Workshop on cancer stem cells[J]．Cancer Res，2006，66(19)：9339-9344.

[10]Cobbs CS,Soroceanu L,Denham S,et al.Modulation of oncogenic phenotype in human glioma cells by cytomegalovius IE1-mediated mitogenieity[J].Cancer Res, 2008, 68(3): 724-730．

[11]Jones G,Machado J Jr,Merlo A.Loss of focal adhesion kinase(FAK) inhibits epidermal growth factor recept or dependent migration and induces aggregation of nh(2)-terminal FAK in the nuclei of apoptotic glioblastoma cells[J].Cancer Res,2001,61(13):4978-4981．

[12]Maussang D,Verzijl D,van Walsum M,et al．Human cytomegalovirus-encoded chemokine receptor US28 promotes tumorigenesis[J]．Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(35)：13068-13073．

Establishment of an Orthotopic Transplant Brain Glioma Model of U251 GSCSwith HCMV Infection in Nude Mice

GAO Jing-yun1, LYU Ting-ting1, QIAN Dong-meng2, HU Ming2, WANG Bin1,2

(1.Teach. &Res.Div.ofPathol.Bio1.,Med.Col1., 2.Coll.ofPub.Health,QingdaoUni.,Qingdao266071)

Intracranial tumor formation in nude mice U251 glioma stem cells (GSCS) after infected with HCMV was studied. GSCSwere isolated from U251 cell line by monoclonal culture method. The expression of CD133 in isolated GSCSwas detected by flow cytometry and infected to HCMV to prepare GSCSsuspension at 1×107cells/mL. Took twenty BALB/c nude mice of SPF class and anesthetized in belly, and fixed them on stereotaxis instrument, and then drilled a small hole on their cranial bone, slowly injected with 3 μL stem cell suspension intracranially, the mice were randomly divided into HCMV infection group and non-infected group. The tumor formation by HCMV and the survival of nude mice were observed, and killed those dying mice and took their brains tissues for immunohistochemical detection whether IE protein expression persists in the tumor of HCMV infection group and how HCMV affects GSCSdifferentiated into CD34 positive vascular endothelial cells. The results showed that using monoclonal culture method can isolate Glioma stem cells; the ratio of CD133 positive cells in GSCSwas 98.00%; Mass tumors appeared in mice brain; In HCMV infection group, tumors highly expressed IE and HCMV can promote CD133+GSCSdifferentiated into CD34 positive expression vascular endothelial cells. It is concluded that the orthotopic implantation tumor model established by this method can continuously express HCMV IE protein and HCMV infection can promote GSCSdifferentiated into vascular endothelial cells.

glioma; GSCS; nude mice; HCMV infection

國家自然科學(xué)基金項目(81471958)；山東省“病原生物學(xué)”泰山學(xué)者工程資助項目

高景云 男，碩士研究生。研究方向為HCMV感染對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化增殖的影響。E-mail:gaozhiyang.ok@163.com

2016-07-05；

2016-08-29

Q939.9；R73

A

1005-7021(2017)02-0073-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.02.012

* 通訊作者。男，博士，教授，博士生導(dǎo)師。主要研究方向為病毒基因工程與分子制藥。

Tel:0532-83780032,E-mail:wangbin31@yahoo.com