李文東，鄭振佳，高乾善，楊 鵬，王 曉*

(1.山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室 山東省分析測試中心，山東 濟南 250014；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；3.濟南康森三峰生物工程有限責(zé)任公司，山東 濟南 250014)

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銀杏內(nèi)酯的亞臨界水提取工藝研究

李文東1,2，鄭振佳1,2，高乾善1，楊 鵬3，王 曉1*

(1.山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室 山東省分析測試中心，山東 濟南 250014；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；3.濟南康森三峰生物工程有限責(zé)任公司，山東 濟南 250014)

為了提高銀杏內(nèi)酯的提取率及提取效率，采用亞臨界水提取銀杏葉中銀杏內(nèi)酯，通過單因素實驗探討了提取溫度、提取時間、提取次數(shù)和料液比對銀杏葉中銀杏內(nèi)酯提取率的影響。運用正交實驗優(yōu)化提取工藝條件如下：提取溫度180 ℃，提取時間30 min，提取3次，料液比1∶25(g∶mL)，在此條件下，銀杏內(nèi)酯提取率為0.4623%。亞臨界水提取銀杏內(nèi)酯具有綠色環(huán)保、無有機溶劑殘留、提取率高等特點。

亞臨界水提?。汇y杏內(nèi)酯；銀杏葉；正交實驗

銀杏葉為銀杏科植物銀杏(GinkgobilobaL.)的干燥葉，其提取物(extract ofGingkobilobaleaves，EGB)活性化學(xué)成分主要包括兩大類：黃酮類及萜類[1]。萜類物質(zhì)主要有二萜類化合物銀杏內(nèi)酯A、B、C和半萜類化合物白果內(nèi)酯，它們的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。銀杏內(nèi)酯A、B、C具有獨特的C20結(jié)構(gòu)，它們的區(qū)別只是在R1和R2基團上的取代基不同，分子量較大，揮發(fā)性較差。銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯均是血小板活化因子(PAF) 天然的拮抗劑，減少血小板的凝血作用[2]，對老年血栓患者具有很好的治療效果，并且對中樞神經(jīng)具有保護作用[3-5]。PAF是一種內(nèi)源性磷脂，與許多疾病的產(chǎn)生和發(fā)展密切相關(guān)[6-8]。銀杏內(nèi)酯合成工藝復(fù)雜，難度較大，目前工業(yè)生產(chǎn)方法仍以提取法為主。

圖1 銀杏內(nèi)酯A、B、C及白果內(nèi)酯結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of ginkgolides(ginkgolide A，ginkgolide B，ginkgolide C) and bilobalide

亞臨界水在沸點以上可保持液體狀態(tài)及介電常數(shù)減小、極性變小的狀態(tài)，可以用亞臨界水來提取極性較小的銀杏內(nèi)酯，是一種綠色萃取技術(shù)[9-13]。此方法可以節(jié)約時間，減少有機試劑的污染。作者在此用亞臨界水提取銀杏葉中銀杏內(nèi)酯，采用單因素實驗探討了提取溫度、提取時間、提取次數(shù)和料液比對提取效率的影響，運用正交實驗優(yōu)化了提取工藝條件。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

銀杏葉，山東雙花制藥有限公司。

銀杏內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品：白果內(nèi)酯(純度≥98%)、銀杏內(nèi)酯A(純度≥98%)、銀杏內(nèi)酯B(純度≥98%)、銀杏內(nèi)酯C(純度≥98%)，上海生化試劑廠；水為去離子水；異丙醇為色譜純。

KT-300Y型超聲波藥品處理機；Agilent 1260型液相色譜儀、385-ELSD型蒸發(fā)光散射檢測器，安捷倫科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；KDM型可控調(diào)溫電熱套，山東鄄城華魯電熱儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 銀杏內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱定銀杏內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇配制成白果內(nèi)酯2 mg·mL-1、銀杏內(nèi)酯A 1 mg·ml-1、銀杏內(nèi)酯B 1 mg·mL-1、銀杏內(nèi)酯C 1 mg·mL-1的混合溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL、0.6 mL、1.1 mL、1.6 mL、2.1 mL、3.6 mL分別稀釋定容到50 mL容量瓶中，分別取30μL標(biāo)準(zhǔn)溶液注入液相色譜，用蒸發(fā)光散射檢測器檢測。液相色譜條件：流動相為異丙醇-水(10∶90，體積比)，YMC-Pack ODS-A 柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，流速為1 mL·min-1，氣體流速為1.6 L·min-1，漂移管溫度為90 ℃，測定完成后，用外標(biāo)兩點對數(shù)法計算，得銀杏內(nèi)酯的提取率。表1為4種銀杏內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的線性方程及R2。

表1 4種銀杏內(nèi)酯線性方程及R2

Tab.1 Linear equations of four kinds of ginkgolides andR2

銀杏內(nèi)酯種類線性方程R2白果內(nèi)酯y=1.360x+7.3790.997銀杏內(nèi)酯Ay=1.307x+7.0730.999銀杏內(nèi)酯By=1.263x+6.9540.998銀杏內(nèi)酯Cy=1.327x+7.2340.999

注：x為進樣量(mg)的對數(shù)值；y為檢測器響應(yīng)值峰面積的對數(shù)值。

1.2.2 銀杏內(nèi)酯的提取及提取率的測定

取樣品3.5 g放入不銹鋼加熱釜內(nèi)，加水70 mL，密封，升溫，當(dāng)樣品升溫到設(shè)定溫度時開始計時。提取完成后冷卻到室溫，用定性濾紙(型號為102)過濾，回收提取液，濃縮，用甲醇定容到100 mL容量瓶中，室溫超聲30 min，混勻，靜置。取適量樣品用針頭式微孔過濾器濾過、0.22μm有機濾膜后進高效液相色譜檢測。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別計算銀杏內(nèi)酯的質(zhì)量，銀杏內(nèi)酯提取率(Y)按下式計算：

1.2.3 銀杏內(nèi)酯提取條件的單因素實驗

分析亞臨界水提取銀杏內(nèi)酯的主要影響因素，選擇提取溫度、提取時間、提取次數(shù)、料液比(g∶mL，下同)進行單因素實驗，探討其對銀杏內(nèi)酯提取率的影響。在預(yù)實驗中，亞臨界水體系壓力對提取率影響較小，所以在本次實驗中不予考慮。

1.2.4 正交實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取提取溫度(A)、提取時間(B)、提取次數(shù)(C)及料液比(D)作為考察因素，采用L9(34)正交表優(yōu)化亞臨界水提取銀杏內(nèi)酯的工藝條件[14-15]，正交實驗的因素及水平見表2。

表2 正交實驗的因素及水平

Tab.2Factors and levels of orthogonal experiment

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 提取溫度對提取率的影響

在前期預(yù)實驗的基礎(chǔ)上設(shè)定提取時間為30 min，料液比為1∶20，提取2次，研究提取溫度對銀杏內(nèi)酯提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取溫度對提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate

由圖2可知，提取率隨提取溫度的升高而增大，但實驗發(fā)現(xiàn)190 ℃以上時銀杏內(nèi)酯有分解，特別是白果內(nèi)酯的含量會減少，因此，提取溫度過高不利于銀杏內(nèi)酯的提取。

2.1.2 提取時間對提取率的影響

設(shè)定料液比為1∶20、提取2次、提取溫度為160 ℃，研究提取時間對銀杏內(nèi)酯提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，提取時間超過30 min后，提取率增加緩慢，由此可知亞臨界水能快速高效地使銀杏內(nèi)酯擴散至溶液中。

圖3 提取時間對提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate

2.1.3 提取次數(shù)對提取率的影響

設(shè)定料液比為1∶20、提取溫度為160 ℃、提取時間為30 min，研究提取次數(shù)對銀杏內(nèi)酯提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 提取次數(shù)對提取率的影響Fig.4 Effect of extraction times on extraction rate

由圖4可知，提取次數(shù)增加到3次時，提取率增幅趨于平緩，再增加提取次數(shù)對提取率影響不大。

2.1.4 料液比對提取率的影響

設(shè)定提取溫度為160 ℃、提取時間為30 min、提取次數(shù)為2次，研究料液比對銀杏內(nèi)酯提取率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 料液比對提取率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate

由圖5可知，提取率隨溶劑的增加而增大，當(dāng)料液比到1∶20后，提取率增幅趨于平緩。

2.2 正交實驗結(jié)果與分析(表3)

表 3 正交實驗的結(jié)果與分析

Tab.3 Results and analysis of orthogonal experiment

從表 3可看出，各因素對銀杏內(nèi)酯提取率的影響大小順序為：D>A>C>B，料液比對亞臨界水提取工藝的影響最大，然后是提取溫度、提取次數(shù)、提取時間，由此可以看出亞臨界水提取工藝可以快速高效地提取銀杏內(nèi)酯。最佳組合為A3B3C3D3，即提取溫度180 ℃、提取時間30 min、提取3次、料液比 1∶25。

2.3 亞臨界水提取法與傳統(tǒng)的乙醇加熱回流法的比較

采用亞臨界水提取銀杏內(nèi)酯的最佳條件與傳統(tǒng)的乙醇加熱回流法(料液比1∶25，提取時間120 min，提取3次，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%)進行比較，結(jié)果見表4。

表4 兩種提取方法對銀杏內(nèi)酯提取率的影響

Tab.4 Effect of two extraction methods on extraction rate of ginkgolides

從表4可以看出：亞臨界水提取銀杏內(nèi)酯的提取率為 0.4623%，與乙醇加熱回流法提取銀杏內(nèi)酯的提取率(0.4502%)相差不大。但傳統(tǒng)的乙醇加熱回流法提取銀杏內(nèi)酯，時間長、溶劑用量大、成本高、有機溶劑殘留；而亞臨界水提取法的時間大大縮短，不需要有機溶劑，可以降低有機溶劑對提取物的污染。由此可見，亞臨界水提取銀杏內(nèi)酯比傳統(tǒng)乙醇加熱回流法省時節(jié)能，且效率更高。

3 結(jié)論

采用亞臨界水提取銀杏葉中銀杏內(nèi)酯，通過單因素實驗和正交實驗得到最佳提取工藝條件為：提取溫度180 ℃，料液比 1∶25，提取時間30 min，提取3次。亞臨界水提取銀杏內(nèi)酯省時節(jié)能、提取效率和提取率高，是一種實用高效的提取方法，可應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。

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Subcritical Water Extraction of Ginkgolides fromGinkgobilobaLeaves

LI Wen-dong1，2，ZHENG Zhen-jia1,2,GAO Qian-shan1，YANG Peng3,WANG Xiao1*

(1.KeyLaboratoryofTCMQualityControlTechnology，ShandongAnalysisandTestCenter，Jinan250014，China；2.CollegeofFoodScienceandEngineering，ShandongAgriculturalUniversity，Taian271018，China；3.JinanKangsenSanfengBiologicalEngineeringTechnologyCo.，Ltd.,Jinan250014，China)

In order to improve the extraction rate and extraction efficiency of ginkgolide，ginkgolides fromGinkgobilobaleaves were extracted with subcritical water.The effects of extraction temperature，extraction time，extraction times and solid-liquid ratio on the extraction rate of ginkgolides fromGinkgobilobaleaves were investigated by a single factor experiment.The optimal extraction conditions by orthogonal experiment were as follows：extraction temperature of 180 ℃，extraction time of 30 min，extraction times of 3，and solid-liquid ratio of 1∶25 (g∶mL) .Under above conditions，the extraction rate of ginkgolide was 0.4623%.The study shows that subcritical water extraction is green and environmentally-friendly，without organic solvent residue and with high extraction rate.

subcritical water extraction；ginkgolide；Ginkgobilobaleaf；orthogonal experiment

山東省科技發(fā)展計劃項目(2014GZX219003)

2016-12-19

李文東(1990-)，男，山東臨沂人，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏,E-mail:1169858758@qq.com；通訊作者：王曉，研究員，E-mail：wangx@sdas.org。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.05.007

R284.2

A

1672-5425(2017)05-0033-04

李文東，鄭振佳，高乾善，等.銀杏內(nèi)酯的亞臨界水提取工藝研究[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(5)：33-36.