倪海濱　孫元水　王峰勇　徐繼　何徐軍　陳劍　吳頎　吳勁風

[摘要] 目的 研究癌相關(guān)成纖維細胞中Gal-1表達通過integrin β1促進胃癌細胞侵襲的機制。 方法 高表達Gal-1的胃癌CAFs采用原代培養(yǎng)法，通過CAFs與胃癌細胞共培養(yǎng)、siRNA轉(zhuǎn)染、抑制Gal-1/封閉integrin β1表達、細胞侵襲能力實驗、侵襲能力影響實驗和IHC實驗等技術(shù)，研究胃癌細胞侵襲遷移能力受胃癌CAFs中Gal-1表達的影響程度及作用機制。分析高表達Gal-1 的CAFs對癌細胞遷移能力和侵襲能力的影響，比較Gal-1和integrin β1免疫組化實驗結(jié)果。 結(jié)果 CAFs共培養(yǎng)使得胃癌細胞侵襲和遷移能力得到明顯提升，Gal-1的表達遭到siRNA抑制后，CAFs對遷移能力和侵襲能力的促進作用得到有效抑制。Gal-1主要在胃癌細胞的間質(zhì)成纖維細胞中表達，integrin β1主要在胃癌細胞的細胞膜中表達。Gal-1和integrin β1在胃癌中的陽性率分別為56.67%（51/90）、43.33%（39/90），并且其表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 結(jié)論 CAFs表達Gal-1并通過促進胃癌細胞integrin β1表達的形式提高胃癌細胞的侵襲遷移能力，指明今后胃癌的治療和相關(guān)預(yù)后的研究方向，表現(xiàn)出一定的理論研究價值。

[關(guān)鍵詞] 癌相關(guān)成纖維細胞；Gal-1；integrin β1；胃癌；侵襲

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）34-0001-03

Study on the mechanism of expression of Gal-1 in cancer-related fibroblasts promoting the invasion of gastric cancer cells via integrin β1

NI Haibin1 SUN Yuanshui1 WANG Fengyong1 XU Ji2 HE Xujun2 CHEN Jian1 WU Qi1 WU Jinfeng1

1.Department of Gastrointestinal Surgery， Tongde Hospital of Zhejiang Province， Hangzhou 310012， China； 2.Department of Gastrointestinal Surgery， Zhejiang People's Hospital， Hangzhou 310014， China

[Abstract] Objective To study the mechanism of expression of Gal-1 in cancer-related fibroblasts promoting the invasion of gastric cancer cells via integrin β1. Methods Gastric cancer CAFs with highly expressed Gal-1 were primarily cultured， co-cultured with gastric cancer cells， transfected with siRNA， inhibited Gal-1 expression/blocked integrin β1 expression， given cell invasiveness test， given invasiveness test and IHC experiment technology. The effect and mechanism of gastric cancer cell invasion and migration on the expression of Gal-1 in gastric cancer CAFs were studied. The effect of CAFs with highly expressed Gal-1 on the migration and invasiveness of cancer cells was analyzed， and the results of Gal-1 and integrin β1 immunohistochemistry were compared. Results The co-culture of CAFs was able to enhance the invasion and migration of gastric cancer cells significantly. Gal-1 expression was inhibited by siRNA， and the promoting effects of CAFs on migration and invasion ability was effectively inhibited. Gal-1 was mainly expressed in interstitial fibroblasts of gastric cancer cells， and integrin β1 was mainly expressed in the cell membrane of gastric cancer cells. The positive rates of Gal-1 and integrin β1 in gastric carcinoma were 56.67%（51/90） and 43.33%（39/90） respectively， and the differences between its expression and lymph node metastasis， distant metastasis and TNM staging were statistically significant（P<0.05）. Conclusion CAFs express Gal-1 and enhance the invasion and migration of gastric cancer cells by promoting the expression of integrin β1 in gastric cancer cells. The study indicates the future direction of treatment and prognosis of gastric cancer， showing a certain theoretical research value.

[Key words] Cancer-related fibroblasts； Gal-1； Intergrin β1； Gastric cancer； Invasion

據(jù)相關(guān)部門統(tǒng)計顯示[1-3]，胃癌在世界腫瘤中占據(jù)較大比例，特別是在中國，死亡率最高的腫瘤當屬胃癌。近年來出現(xiàn)了各種各樣的胃癌治療手段，其中主要手段還是手術(shù)治療。臨床研究結(jié)果顯示[4-6]，外科手術(shù)切除胃癌的水平取得顯著進展，并且對胃癌的治療療效顯著。但統(tǒng)計調(diào)查結(jié)果證實，通過手術(shù)切除、放療、化療等綜合手段治療的患者，5年生存率極低，甚至不到50%。究其原因主要在于患者就診時大多數(shù)已處于Ⅲ或Ⅳ期及腫瘤復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素。研究專家統(tǒng)一認為，深入了解胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機制迫在眉睫。本研究針對癌相關(guān)成纖維細胞（carcinoma associated fibroblasts，CAFs）中Gal-1表達通過integrin β1促進胃癌細胞侵襲的機制展開研究。

1資料與方法

1.1一般資料

選擇2009年1月～2012年3月我院胃腸外科接診的90例胃癌患者石蠟切片，術(shù)后隨訪2年。所有病例均經(jīng)病理學證實，術(shù)前未經(jīng)過任何放化療。本研究患者知情并同意，且經(jīng)我院倫理委員會審批通過。

1.2 方法

1.2.1 原代培養(yǎng) 切取所選患者胃癌侵襲邊緣組織，儲存于標本消毒液中，于低溫下保存。并在消毒液中對組織標本進行初步處理，去除黏液及周圍非癌組織黏膜。并將標本分為兩份，一份制作成蠟塊標本，另一份繼續(xù)進行原代培養(yǎng)。采用酶消化法進行原代培養(yǎng)，從消毒液中取出的組織塊應(yīng)用PBS（pH=7.4）洗滌，去除殘留消毒液成分。將組織剪成1mm2碎塊置于標本消化液中，后移至容量為50 mL的無菌管中，加入一定的消化液至15 mL，于恒溫搖床中反應(yīng)2 h（37℃，120 r/min）。后用離心機離心，取上清液。

1.2.2 CAFs與胃癌細胞共培養(yǎng) Trans-well模型，上室加入1×105個胃癌細胞（7901、AGS和823），下室加入2×105個CAFs和預(yù)先轉(zhuǎn)染Gal-1 siRNA的CAFs。37℃恒溫下培養(yǎng)48 h后收集共培養(yǎng)的胃癌細胞。

1.2.3 siRNA轉(zhuǎn)染 使用無血清培養(yǎng)基稀釋Gal-1 siRNA-1、Gal-1 siRNA-2、integrin β1 siRNA-1、integrin β1 siRNA-2，后與轉(zhuǎn)染劑混合，室溫孵育20 min。

1.2.4 抑制Gal-1/封閉integrin β1表達 6孔板鋪2×105個CAFs細胞/胃癌細胞，培養(yǎng)條件溫度37℃，時間24 h，待上清液棄去后，加入無血清培養(yǎng)基（2 mL），每孔中滴入混合物（Gal-1 siRNA/integrin β1 siRNA與轉(zhuǎn)染劑），待繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞。

1.2.5 高表達Gal-1的CAFs對腫瘤細胞遷移能力和侵襲能力實驗 （1）細胞遷移能力實驗：所用Trans-well模型。收集處于對數(shù)生長期的CAFs，預(yù)先轉(zhuǎn)染Gal-1 siRNA的CAFs及7901、AGS和823胃癌細胞。調(diào)整細胞濃度至合適值，其中上室鋪含1×105個胃癌細胞的無血清培養(yǎng)基，下室鋪含2×105的CAFs和CAFs FBS培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后將上下室取下，用乙醇預(yù)冷固定后，擦拭上室未穿過微孔膜的細胞，后進行HE染色。置于顯微鏡下觀察，分析胃癌細胞的轉(zhuǎn)移能力改變情況。（2）細胞侵襲能力實驗：其他步驟同上述遷移能力實驗。不同之處為培養(yǎng)時間為48 h。

1.2.6 Gal-1誘導的侵襲和遷移能力受胃癌細胞封閉integrin β1的作用影響實驗 （1）侵襲能力影響實驗：用無血清培養(yǎng)基提前調(diào)整好預(yù)先轉(zhuǎn)染Gal-1 siRNA的胃癌細胞（7901、AGS和823）濃度后，加入到Trans-well模型上室，30% FBS（含有CAFs）培養(yǎng)基加入下室。（2）遷移能力影響實驗：同上。

1.2.7 IHC實驗 90例胃癌患者的石蠟切片65℃烘烤2 h，用二甲苯脫蠟，梯度酒精脫二甲苯。后用0.01 mol/L的枸緣酸鹽修復(fù)液高壓修改3 min。使用質(zhì)量分數(shù)為3%的雙氧水室溫下孵育20 min使內(nèi)源性過氧化物酶失活。用常規(guī)羊血清室溫封閉20 min后，滴加anti-integrin β1和anti-Gal-1，并置于4℃恒溫箱中過夜。用PBS洗滌三次后滴加二抗，并置于室溫下靜置20 min，再用PBS洗滌三次，最后進行顯色、復(fù)染、脫水、封片等操作。后進行掃描儀掃描，留存。

1.3觀察指標

Gal-1和integrin β1免疫組化實驗染色結(jié)果判定標準[7-10]：陽性細胞評分×染色強度評分，其中0分無表達，1～3分可以表達，4～6分弱表達，7～12分強表達。陽性細胞評分：按照所占計數(shù)細胞的百分數(shù)評分，0分≤5%，6%<1分≤25%，26%<2分≤50%，51%<3分≤75%，76%<4分≤100%。染色強度評分：0分無色，1分淡黃色，2分棕黃色，3分棕褐色。

1.4統(tǒng)計學分析

選擇SPSS18.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，等級資料比較采用秩和檢驗（Wilcoxon兩樣本比較法），P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 高表達Gal-1 的CAFs對胃癌細胞遷移能力和侵襲能力的影響

胃癌細胞的遷移和侵襲能力在CAFs共培養(yǎng)后顯著增強，Gal-1的表達受到siRNA抑制后，CAFs對遷移能力和侵襲能力的促進作用得到有效抑制，見封三圖1。

2.2 Gal-1和integrin β1免疫組化實驗結(jié)果

如封三圖2所示Gal-1和integrin β1染色結(jié)果，Gal-1主要在胃癌細胞的間質(zhì)成纖維細胞中表達，integrin β1主要在胃癌細胞的細胞膜中表達。90例患者臨床資料、Gal-1和integrin β1與病理學參數(shù)的關(guān)系見表1。Gal-1和integrin β1在胃癌中的陽性率分別為56.67%（51/90）和43.33%（39/90），并且其表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3討論

臨床研究表明，Gal-1作為一種特殊的分泌性蛋白，在CAFs中存在過表達現(xiàn)象，該現(xiàn)象關(guān)系到多種癌癥的進展和預(yù)后。研究表明，該分泌性蛋白在胃癌中的過表達機制目前仍不明確。腫瘤中integrin β1顯示出強大的生物學功能，對細胞增殖和侵襲具有一定的促進作用等，在其表達水平降低時，細胞侵襲遷移能力受到抑制。另有實體瘤研究報道[11-14]，integrin β1高表達會使腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性。一系列的腫瘤研究結(jié)果表明，腫瘤微環(huán)境在一定程度上影響其進展。成纖維細胞是腫瘤微環(huán)境中最主要的間質(zhì)細胞類型，組織完整性得以構(gòu)建。細胞正常狀態(tài)下，成纖維細胞在特殊情況下能發(fā)揮組織修復(fù)功能，而在腫瘤細胞中，成纖維細胞發(fā)生分化為癌相關(guān)成纖維細胞。腫瘤細胞在微環(huán)境各種成分的相互作用下，轉(zhuǎn)移和進展速度增大，甚至腫瘤細胞的耐藥性和抵抗治療能力均會受到腫瘤細胞微環(huán)境各種組分的影響，嚴重情況下顯著影響患者腫瘤治療預(yù)防工作的順利進行。曾有文獻報道[15-17]，這些細胞分泌多種通過不同機制促進腫瘤進展和轉(zhuǎn)移的蛋白。深入研究該種促進機制，能為腫瘤的治療提供研究方向，改善患者預(yù)后工作，具有重要的臨床研究價值。另外CAFs促進腫瘤進展的機制多種多樣，因此研究分子機制對于提高患者預(yù)后及對腫瘤工作的進展意義重大。

本研究結(jié)果顯示，Gal-1促進胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制與其能促進胃癌表面integrin β1表達有關(guān)。利用integrin β1siRNA提前封閉胃癌細胞中integrin β1的表達，當其表達受到阻斷后，明顯限制Gal-1的促胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移作用。免疫組化結(jié)果也表明，患者Gal-1和integrin β1的表達相關(guān)。經(jīng)CAFs共培養(yǎng)后胃癌細胞遷移能力和侵襲能力顯著增強，利用siRNA抑制Gal-1的表達后，CAFs促進遷移和侵襲能力的效果得到抑制，與相關(guān)報道相一致[18-22]。Gal-1主要在胃癌細胞的間質(zhì)成纖維細胞中表達，integrin β1主要在胃癌細胞的細胞膜中表達。Gal-1和integrin β1在胃癌中的陽性率分別為56.67%（51/90）和43.33%（39/90），并且其表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期有較大關(guān)系。

綜上所述，CAFs表達Gal-1并通過促進胃癌細胞integrin β1表達的形式提高胃癌細胞的侵襲遷移能力，指明今后胃癌的治療和相關(guān)預(yù)后的研究方向，表現(xiàn)出一定的理論研究價值。

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（收稿日期：2016-09-15）