鄧曉宇，陳華，徐倩倩，劉苗苗

超聲波輔助提取香菇菌棒纖維素酶工藝優(yōu)選研究

鄧曉宇，*陳華，徐倩倩，劉苗苗

（鞍山師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧鞍山114007）

以遼寧鞍山產(chǎn)的香菇菌棒為原料，采用超聲波輔助提取纖維素酶，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳提取工藝條件為提取溫度50℃，超聲時間20min，超聲波振幅90%，料液比1∶50，超聲波法浸提液羧甲基纖維素酶酶活為7.25 IU/g，具有用時短、提取率高等優(yōu)點(diǎn)。

超聲波；纖維素酶；香菇；菌棒

0 引言

鞍山地區(qū)大量種植食用菌，其中香菇產(chǎn)量較高，每年會產(chǎn)生大量的菌棒。菌棒中含有豐富營養(yǎng)，但大部分菌棒被丟棄在戶外，不僅造成食用菌生物資源的浪費(fèi)，還引發(fā)害蟲和病菌的滋生，危害自然環(huán)境和人類的健康[1-2]。根據(jù)報(bào)道，香菇菌棒富含有纖維素酶，提取其中的纖維素酶并加以利用，不僅為香菇菌棒資源的綜合利用提供定量分析依據(jù)，同時對香菇廢棄物資源再利用有重要意義。試驗(yàn)采用超聲波輔助提取香菇菌棒纖維素酶，優(yōu)化最佳提取工藝條件，為香菇菌棒中纖維素酶規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)及利用，提供一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮香菇（Lentinus edodes）菌棒（采收4茬后），由鞍山市寧遠(yuǎn)屯鎮(zhèn)香菇種植農(nóng)戶提供。香菇品種為沈陽937#，栽培基質(zhì)為木屑、麥麩、石膏、豐菇素。隨機(jī)取30袋香菇菌棒，剝?nèi)ゾ艟砻娴南愎?，由拌料機(jī)處理30 min，使菌棒成分混合均勻。

1.2 試驗(yàn)儀器及試劑

UV-1800型紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；KQ5200B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；羧甲基纖維素鈉（CMCNa），Sigma公司產(chǎn)品。

0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH值5.5）、1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、1%羧甲基纖維素鈉溶液、3,5-二硝基水楊酸（DNS）溶液，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 纖維素酶提取

待測酶液的制備：采收4茬后香菇菌棒，去除菌棒四周腐爛降解部分，剩余部分經(jīng)自然風(fēng)干、攪拌、粉碎后備用。取適量菌糠加10倍蒸餾水，置于勻漿機(jī)中充分打碎，于40℃水浴中保溫45 min，經(jīng)多層紗布過濾，濾液以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心20 min，得上層清液即為粗酶液。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

以羧甲基纖維素酶（CMC酶）酶活為測定指標(biāo)，在提取溫度50℃，料液比1∶50，超聲時間25min，超聲波振幅分別為60%，70%，80%，90%，100%的條件下測定酶活；在提取溫度50℃，料液比1∶50，超聲波振幅90%，超聲時間分別為10，15，20，25，30，35 min的條件下測定酶活；在提取溫度50℃，超聲波振幅90%，超聲時間25 min，料液比分別為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60的條件下測定酶活；在料液比1∶50，超聲時間25 min，超聲波振幅90%，提取溫度分別為40，45，50，55，60，65℃的條件下測定酶活。各條件均做3次平行試驗(yàn)，計(jì)算平均酶活。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)條件下，以羧甲基纖維素酶活為考查指標(biāo)，對單因素中超聲波振幅、提取溫度、超聲時間和料液比進(jìn)行四因素三水平L9（34）的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，測定羧甲基纖維素酶酶活，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析得出最佳提取條件。

1.3.4 羧甲基纖維素酶酶活測定

（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定。分別取1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0mL于8支具塞試管中，用蒸餾水調(diào)至1 mL，然后向各試管中加入1.5mL 3,5-二硝基水楊酸溶液，搖勻后沸水浴5 min，取出冷卻后用蒸餾水定容至10 mL，充分混勻。于波長540 nm處測定OD值并記錄結(jié)果，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、對應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）羧甲基纖維素酶酶活測定。將酶液與底物分別于40℃水浴中預(yù)熱，然后取0.5 mL酶液加入2.0 mL底物溶液中，混勻，置于40℃條件下反應(yīng)30 min，加2.5mL 3,5-二硝基水楊酸溶液，沸水浴中5 min后，立即用自來水冷卻。另做1個空白管，以0.5 mL水代替酶液，其他操作相同，在分光光度計(jì)上測出于波長540 nm處的吸光度，對照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出酶活。

（3）酶活單位的定義。羧甲基纖維素酶酶活（CMC酶酶活）指1 g香菇菌棒（干質(zhì)量）在50℃，pH值5.5，1 min內(nèi)水解纖維素生成1μmol葡萄糖酶的用量設(shè)為1個酶活單位，用IU/g表示。

式中：5.56——1mg葡萄糖的μmol數(shù)（1 000/180= 5.56）。

1.3.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)得出最佳提取工藝條件后進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測定羧甲基纖維素酶酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果

已知葡萄糖質(zhì)量濃度為0~0.1 mg/mL，于波長540 nm處測吸光度時，吸光度Y與葡萄糖質(zhì)量濃度X之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對葡萄糖含量進(jìn)行定量分析。以空白溶液作對照，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸直線方程Y=36.722X+ 0.005 64，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7。

葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 超聲波振幅對羧甲基纖維素酶活的影響

超聲波振幅對羧甲基纖維素酶酶活的影響見圖2。

圖2 超聲波振幅對羧甲基纖維素酶酶活的影響

超聲波振幅在60%~100%時，隨著超聲波振幅增大，超聲波破碎菌棒中菌絲細(xì)胞壁的作用加快，適于纖維素酶快速溶出。當(dāng)超聲波振幅為100%時，CMC酶酶活反而有些下降。在劇烈振蕩過程中，可能部分破壞了纖維素酶結(jié)構(gòu)，使提取量減少。

2.2.2 超聲時間對羧甲基纖維素酶酶活的影響

超聲時間對羧甲基纖維素酶酶活的影響見圖3。

隨著超聲時間增長，菌絲細(xì)胞壁破碎程度加劇，溶出的酶量增多，羧甲基纖維素酶酶活增加。當(dāng)超聲時間超過20 min時，酶活下降，原因可能是超聲時間增長，其他雜質(zhì)也相繼溶出，降低羧甲基纖維素酶酶活；也可能由于超聲波剪切作用增強(qiáng)，導(dǎo)致酶分子結(jié)構(gòu)遭到破壞。

2.2.3 提取溫度對羧甲基纖維素酶酶活的影響

圖3 超聲時間對羧甲基纖維素酶酶活的影響

提取溫度對羧甲基纖維素酶酶活的影響見圖4。

圖4 提取溫度對羧甲基纖維素酶酶活的影響

隨著提取溫度升高，分子運(yùn)動加劇，羧甲基纖維素酶溶出量增多，酶活增加。當(dāng)提取溫度超過50℃時，羧甲基纖維素酶酶活緩慢下降，可能是提取溫度過高，導(dǎo)致其他雜質(zhì)溶出較多，降低了羧甲基纖維素酶酶活。提取溫度過高會影響酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，降低酶的活性，對工業(yè)生產(chǎn)設(shè)備也會有更高的要求。

2.2.4 料液比對羧甲基纖維素酶酶活的影響

料液比對羧甲基纖維素酶酶活的影響見圖5。

圖5 料液比對羧甲基纖維素酶酶活的影響

料液比1∶50的提取效果最好。提取液越多，濃度差越大，擴(kuò)散推動力越大，越有利于纖維素酶溶出，羧甲基纖維素酶酶活出現(xiàn)增加的趨勢。當(dāng)料液比1∶60時，提取液過量，消耗更多的時間和能量，阻礙超聲波破碎細(xì)胞，其他的物質(zhì)相繼溶出，酶的濃度下降，導(dǎo)致酶活降低。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

以羧甲基纖維素酶酶活為考核指標(biāo)，對超聲波振幅、超聲時間、提取溫度及料液比等單因素條件進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差和方差分析。結(jié)果表明，影響羧甲基纖維素酶酶活提取條件的主次因素為提取溫度>超聲波振幅>料液比>超聲時間。從節(jié)約能源和時間等多方面因素綜合考慮，超聲波提取香菇菌棒纖維素酶的最佳條件為超聲波振幅90%，超聲時間20 min，料液比1∶50，提取溫度50℃。

正交試驗(yàn)及結(jié)果分析見表1，方差分析見表2。

表1 正交試驗(yàn)及結(jié)果分析

表2 方差分析

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

在最佳工藝條件下，測定纖維素酶活平均值為7.25 IU/g，優(yōu)于其他試驗(yàn)條件下酶活。

3 結(jié)論與討論

超聲波輔助提取香菇菌棒中纖維素酶最適工藝條件為提取溫度50℃，超聲波振幅90%，料液比1∶50，超聲時間20min。影響浸提的主次順序?yàn)樘崛囟?超聲波振幅>料液比>超聲時間，測定纖維素酶活平均值為7.25 IU/g。超聲波提取法具有提取率高、利于細(xì)胞破壁、用時短等優(yōu)點(diǎn)，適于企業(yè)工廠化、規(guī)?；罅可a(chǎn)使用，試驗(yàn)也為香菇菌棒中的纖維素酶規(guī)模化生產(chǎn)及應(yīng)用提供了一定的參考依據(jù)。

[1]劉瑩瑩，張堅(jiān)，王紅兵，等．菌棒酶提取與制備方法研究[J]．湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（1）：88－89，92．

[2]張國慶，董曉芳，王賀祥，等.8種食用菌菌渣中3種飼用酶活性的測定[J].中國食用菌，2009，28（5）：28-29.◇

Optimization of Ultrasonic-assisted Extracting Conditions of Cellulase from Lentinus Edodes Residue

DENG Xiaoyu，*CHEN Hua，XUQianqian，LIUMiaomiao
（School of Chemistry and Life Science，Anshan NormalUniversity，Anshan，Liaoning 114007，China）

Single factor and orthogonal experiments are employed to optimize the extracting conditions of crude cellulase from residue of Lentinus edodes by ultrasonic wavemethod.Results show that the optimal conditions are as follows：extracting temperatolre is 50℃，extracting time is 20min，ultrasonic wave amplitude is 90%，material-liquid ratio is 1∶50.In comparative experiments on extracting crude cellulase，CMC ase activity of extractapplied ultrasonic wavemethod are 7.25 IU/g.This method is superiorwith short time and high extraction.

ultrasonic wave；cellulase；Lentinus edodes；residue

TS209

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.04.012

1671-9646（2017）04a-0036-03

2017-04-01

鞍山市科學(xué)技術(shù)局項(xiàng)目（2013SY16）；鞍山師范學(xué)院教師科研立項(xiàng)課題（13KYXM32）；鞍山師范學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助項(xiàng)目（201410169037）。

鄧曉宇（1993—），女，本科，研究方向?yàn)槭称飞锘瘜W(xué)分析。

*通訊作者：陳華（1978—），女，碩士，講師，研究方向?yàn)槭称飞锘瘜W(xué)分析。