王楠 隋海娟 張玲玲 金英 趙彬

阿托伐他汀對淀粉樣β蛋白誘導大鼠原代海馬神經(jīng)元損傷保護作用的研究

王楠 隋海娟 張玲玲 金英 趙彬

目的 探討阿托伐他汀(atorvastatin，Ato)對β淀粉樣蛋白(Aβ)誘導的體外培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元損傷保護作用。方法 選用出生0～24 h Sprague-Dawley大鼠乳鼠，解剖顯微鏡下分離海馬，進行海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)，培養(yǎng)10 d后用于實驗。將培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元分為3組：(1)正常對照組：加入含有1%(質量濃度) DMSO培養(yǎng)基；(2)Aβ1-42組：加入1.25 μmol/L Aβ；(3)Aβ(1.25 μmol/L)+不同濃度阿托伐他汀組(0.1、0.5、1、2.5 μmol/L)。應用CellTiter-GloTM熒光細胞活性試劑盒檢測培養(yǎng)海馬神經(jīng)元ATP含量，用以反映神經(jīng)元活力；通過CytoTox-ONETM試劑盒測定培養(yǎng)細胞上清液中乳酸脫氫酶(LDH)含量，用以測定神經(jīng)元細胞膜的損傷程度；應用免疫熒光染色觀察神經(jīng)元突觸素(SYP)、突觸后致密蛋白95(PSD-95)、bassoon蛋白表達。Western印跡法半定量檢測海馬神經(jīng)元突觸蛋白SYP、PSD-95、bassoon的改變。結果 與正常對照組比較，培養(yǎng)10 d海馬神經(jīng)元經(jīng)1.25 μmol/L Aβ1-42作用48 h后，其ATP和LDH水平均明顯降低(均P<0.01)，而0.5、1.0、2.5 μmol/L Ato組能夠明顯抑制Aβ1-42引起的ATP和LDH水平降低(P<0.01)。免疫熒光及Western blot結果顯示，1.25 μmol/L Aβ1-42可使海馬神經(jīng)元SYP、PSD-95、bassoon蛋白表達明顯降低，而Ato能夠明顯抑制Aβ1-42引起的SYP、PSD-95、bassoon蛋白表達降低。結論 Ato對Aβ誘導的體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元毒性有保護作用，這種保護作用可能與Ato對抗Aβ1-42引起的海馬神經(jīng)元SYP、PSD-95、bassoon表達降低有關。

阿爾茨海默病；阿托伐他??；海馬神經(jīng)元；淀粉樣β蛋白；突觸蛋白

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是老年癡呆的主要原因[1]。雖然AD患者腦內的病理學改變比較明確，但其發(fā)病機制尚不清楚。許多研究表明β淀粉樣蛋白(amyloid-β peptide，Aβ)在AD患者腦內沉積是AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。AD臨床表現(xiàn)為進行性記憶功能障礙和認知行為異常。大量研究表明AD的記憶功能障礙與可溶性Aβ1-42觸發(fā)的突觸功能失調和過度磷酸化tau蛋白聚集有關[2]。離體和再體實驗研究表明Aβ1-42能激活谷氨酸受體，導致異常鈣離子內流，抑制長時程突觸傳遞增強，最終導致突觸功能喪失[3-4]。阿托伐他汀(atorvastatin，Ato)屬于他汀類藥物，因其具有半衰期長、代謝好、強效安全的調脂作用，而廣泛用于臨床。目前認為長期服用他汀類藥物能降低AD的發(fā)病率[5-6]，他汀類藥物有降低Aβ產生、抑制炎性反應、抗凋亡、抗氧化作用[7-8]。該研究應用體外培養(yǎng)大鼠乳鼠海馬神經(jīng)元為模型，進一步探討Ato對Aβ1-42引起的海馬神經(jīng)元損傷保護作用機制。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑 Ato購于LKT Laboratories, Inc.公司(批號23922105，純度>98%)，用二甲亞砜(DMSO)溶解。Aβ1-42(批號：SCP0038)為Sigma公司產品，用無菌生理鹽水溶解，溶解后37 ℃孵育24 h，使其成為聚集狀態(tài)。DMEM、F12培養(yǎng)基購于Invitrogen公司；DMSO、胰蛋白、L-多聚賴氨酸均購于Sigma公司；新生胎牛血清、馬血清購于廣州蕊特生物科技有限公司；HEPES購于Calbiochem公司；阿糖胞苷購于意大利S.P.A公司；CellTiter-GloTM熒光細胞活性試劑盒(G7570)、CytoTox-ONETMHomogeneous Membrane Inte-grity試劑盒(G7890)購自Promega公司；鼠突觸相關蛋白突觸素(synaptophysin，SYP)多克隆抗體、兔突觸后致密蛋白95(PSD95)多克隆抗體購自Santa Cruz公司；兔bassoon多克隆抗體(ab76065)、山羊抗鼠二抗購自Abcam公司；β-肌動蛋白(β-actin)抗體購于Beyotime試劑公司；SuperSignal West Pico化學發(fā)光底物購于美國Thermo scientific公司。其他相關試劑均由遼寧醫(yī)學院藥理實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)：取出生24 h以內的SD 大鼠乳鼠(遼寧醫(yī)學院動物實驗中心提供)，75%(體積分數(shù))酒精消毒，取出海馬，剪成1 mm3左右的小塊。加入 0.125%(質量濃度)胰蛋白酶進行消化。待細胞分散后，終止消化。200目篩網(wǎng)過濾，1000g離心10 min，用含10%(體積分數(shù))胎牛血清和10%(體積分數(shù))馬血清的DMEM/F12培養(yǎng)基制成細胞懸液，調整細胞密度為1×105/L～1×107/L，接種在鋪有L-多聚賴氨酸培養(yǎng)皿或6孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5%(體積分數(shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后加入含阿糖胞苷(終濃度為5 mg/L)的培養(yǎng)基，抑制非神經(jīng)細胞增殖。以后每3 d半量換液1次。

1.2.2 細胞處理及分組：海馬神經(jīng)元培養(yǎng)10 d用于實驗，并分為3組：(1)正常對照組：加入含有1%(質量濃度)DMSO培養(yǎng)基；(2)Aβ1-42組：加入濃度1.25 μmol/L的Aβ；(3)Aβ(1.25 μmol/L)+不同濃度Ato組(0.1、0.5、1.0、2.5 μmol/L，以下分別簡稱Ato 0.1、0.5、1.0、2.5 μmol/L組)：將不同濃度Ato加入到培養(yǎng)神經(jīng)元作用1 h，然后加入Aβ作用48 h。

1.2.3 細胞活力檢測：將接種在96孔培養(yǎng)板的海馬神經(jīng)元經(jīng)各藥物處理后，按CellTiter-GloTM熒光細胞活性試劑盒和CytoTox-ONETMHomo- geneous Membrane Integrity試劑盒操作步驟進行ATP含量及乳酸脫氫酶(LDH)釋放測定。

1.2.4 免疫熒光染色檢測SYP、PSD-95和bassoon表達：培養(yǎng)10 d的海馬神經(jīng)元進行處理后移去培養(yǎng)基，用PBS漂洗3次；用新鮮配制的4%(質量濃度)多聚甲醛室溫固定30 min，PBS漂洗3次；0.3%(質量濃度)TritonX-100作用30 min，PBS漂洗3次；室溫下3%(體積分數(shù))山羊血清封閉30 min；加入SYP、PSD-95、bassoon抗體(1∶100)4℃過夜，PBS漂洗后，加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的二抗和Cy3標記的二抗作用2 h。熒光倒置顯微鏡下檢測SYP、PSD-95、bassoon表達。

1.2.5 Western印跡法檢測SYP、PSD-95、bassoon蛋白表達：原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，經(jīng)各組處理后，用冷的PBS沖洗，立即放入預冷的裂解緩沖液中，4℃超聲粉碎后，12 000g離心，取上清，用BCA法測定蛋白質含量，以牛血清白蛋白為標準品，將各組蛋白濃度調成一致。用10%～12%(質量濃度)的SDS-PAGE分離蛋白質，每個泳道蛋白上樣量為20 μg。為準確判斷目的蛋白帶的位置，一個泳道加See Blue Plus 2預染蛋白標記物，電泳后將PAGE凝膠中的蛋白質電轉移至硝酸纖維素膜上，取出后將膜放入3%(體積分數(shù))牛血清白蛋白中，封閉60 min。將膜放入一抗中(1∶1000)，4℃過夜。TTBS沖洗后，將膜放入二抗(1∶1000)中，室溫孵育1～2 h，然后用TTBS洗膜3次，每次10 min，將膜在SuperSignal West Pico底物工作液中孵育5 min，吸干多余試劑，放置化學發(fā)光凝膠系統(tǒng)分析儀中進行Ecl化學發(fā)光。每個抗體測定時都進行β-肌動蛋白測定，以保證蛋白上樣量的一致性。利用Visionworks 6.3.3圖像采集及分析軟件對蛋白帶進行分析。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)由Spss11.0統(tǒng)計軟件完成，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差表示，采用One-way ANOVA分析，兩兩比較采用LSD檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 Ato對Aβ1-42誘導海馬神經(jīng)元細胞活力影響 與正常對照組比較，Aβ1-42組ATP和LDH水平均降低(P<0.01)；與Aβ1-42組比較，Ato 0.5、1.0、2.5 μmol/L組ATP和LDH水平均升高(P<0.01)，而Ato 0.1 μmol/L組ATP和LDH水平無統(tǒng)計學變化(P>0.05)。結果見表1。

表1 各組海馬神經(jīng)元ATP和LDH水平比較(±s，n=3，%)

注：LDH：乳酸脫氫酶；Ato：阿托伐他??；Aβ：β淀粉樣蛋白，圖1、2同；與正常對照組比較，aP<0.01；與Aβ1-42組比較，bP<0.01；與Ato 0.5 μmol/L組比較，cP<0.01；與 Ato 1.0 μmol/L組比較，dP<0.01

2.2 免疫熒光檢測 結果見圖1。(1)SYP免疫陽性反應呈點狀沿神經(jīng)突起和神經(jīng)元胞體周圍排列。正常對照組海馬神經(jīng)元SYP點狀排列密集，熒光強度高，Aβ1-42組海馬神經(jīng)元SYP較正常對照組明顯減少，加入Ato 1.0 μmol/L可對抗Aβ引起的SYP減少。(2)bassoon蛋白在神經(jīng)元成點狀分布，應用Aβ1-421.25 μmol/L作用48 h，bassoon蛋白表達量明顯降低，熒光結果表現(xiàn)為點狀密度和強度明顯降低。在加入Aβ1-42前1 h加入Ato 1.0 μmol/L可明顯對抗Aβ1-42引起的海馬神經(jīng)元bassoon蛋白表達降低。(3)PSD-95蛋白在神經(jīng)元胞體和突起成點狀分布。Aβ1-42組PSD-95蛋白表達量明顯降低，表現(xiàn)為點狀密度和強度明顯降低，在加入Aβ1-42前1 h加入Ato 1.0 μmol/L可明顯對抗Aβ1-42引起的海馬神經(jīng)元PSD-95表達量降低。

注：SYP：突觸素，PSD-95：突觸后致密蛋白95，圖2同 圖1 熒光倒置顯微鏡下觀察各組大鼠海馬神經(jīng)元突觸蛋白SYP、bassoon、PSD-95表達(免疫熒光，×40)

注：1：正常對照組；2：Aβ1-42組；3：Ato 0.5 mmol/L組；4：Ato 1.0 mmol/L組；5：Ato 2.5 mmol/L組；與正常對較照組比，aP<0.01；與Aβ1-42組比較，bP<0.01；與Ato 0.5 μmol/L組比較，cP<0.01；與 Ato 1.0 μmol/L組比較，dP<0.01 圖2 Western blot檢測各組大鼠海馬神經(jīng)元 SYP、bassoon和PSD-95 蛋白表達比較

2.3 Western blot檢測 與正常對照組比較，Aβ1-42組SYP、PSD-95、bassoon蛋白表達減少，而Ato(0.5、1.0、2.5 μmol/L)可明顯對抗Aβ1-42引起的海馬神經(jīng)元SYP、bassoon、PSD-95蛋白表達減少，并呈明顯濃度依賴性(圖2)。

3 討論

AD患者大腦中老年斑的主要成分Aβ可導致突觸功能損害，可能是發(fā)病機制中的起始因素和關鍵環(huán)節(jié)[9]，Aβ有40～43個氨基酸殘基，主要有Aβ40和Aβ42兩種形式，其中Aβ42聚集性最強，有較強神經(jīng)細胞毒性[10-11]。研究結果顯示沉積狀態(tài)Aβ可引起神經(jīng)突退縮和神經(jīng)元變性[12]。ATP是活細胞新陳代謝的一個指標，通過測定培養(yǎng)細胞ATP的含量可反映細胞活力[13]。測定LDH釋放可反映細胞膜受損程度。本研究結果顯示，Aβ1-42組ATP和LDH水平較對照組降低，表明Aβ1-42對海馬神經(jīng)元有明顯的神經(jīng)毒性作用，而Ato組ATP和LDH水平高于Aβ1-42組，提示Ato可對抗Aβ1-42對海馬神經(jīng)元的損傷作用；另外，通過采用不同濃度Ato進行干預顯示，在一定范圍內，隨著Ato濃度從0.5、1.0、2.5 μmol/L逐漸增加，ATP和LDH水平逐漸增加，提示Ato對抗Aβ1-42對海馬神經(jīng)元的損傷作用逐漸增強，具有劑量依賴關系。

大腦是由相互連接的神經(jīng)元網(wǎng)絡形成，突觸-突觸連接是神經(jīng)元之間信息傳遞的重要部位，與學習、記憶密切相關，突觸容易發(fā)生動態(tài)變化，突觸可塑性是學習和記憶的基礎。研究表明突觸的功能異常和丟失被廣泛認為是AD患者認知功能下降的細胞機制[14]。突觸蛋白是一組與突觸相關的具有神經(jīng)元特異性的磷酸蛋白，能夠調節(jié)神經(jīng)遞質的釋放并參與神經(jīng)元早期發(fā)育。SYP是最豐富的突觸囊泡蛋白，高度集中在腦組織突觸前部的軸突末梢，SYP調控神經(jīng)遞質的釋放。bassoon是一種突觸鷹架蛋白，主要集中在突觸前活性部位，與突觸遞質釋放和突觸可塑性方面有關。PSD-95是另一種鷹架蛋白，該蛋白在突觸可塑性中產生重要的作用。雷公藤可減少AD轉基因小鼠海馬區(qū)Aβ沉積，增加AD轉基因小鼠海馬區(qū)PSD-95和SYP表達，從而明顯改善突觸變性和認知損害[15]，提高快速老化的SAMP8鼠海馬CA1區(qū)PSD-95和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)表達，從而改善快速老化的SAMP8鼠認知功能[16]。本研究免疫熒光結果及Western blot半定量結果顯示，Aβ1-42組海馬神經(jīng)元SYP、bassoon、PSD-95蛋白較正常對照組明顯減少，表明Aβ可引起海馬神經(jīng)元相關突觸蛋白表達減少。這與Zeng等[15]研究結果一致。另外，本研究采用不同濃度Ato對Aβ引起的海馬神經(jīng)元損傷的影響進行觀察發(fā)現(xiàn)，Ato能明顯對抗Ab1-42引起的SD大鼠海馬神經(jīng)元SYP、PSD-95、bassoon蛋白的降低，提示Ato對Aβ1-42引起的突觸損傷具有明顯的對抗作用，且隨Ato濃度增加，其SYP、PSD-95、bassoon蛋白表達逐漸增加，表明Ato對抗Aβ1-42引起的突觸蛋白SYP、PSD-95、bassoon表達降低存在劑量依賴關系。

Ato屬于他汀類調血脂類藥物，是羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，已被廣泛應用于臨床治療高膽固醇血癥、預防心腦血管事件。最近研究結果提示他汀類藥物有獨立于降脂作用之外的神經(jīng)細胞保護作用。長期服用他汀類藥物能降低AD的發(fā)病率,改善AD患者認知障礙[17]。另有研究對AD模型犬應用阿托伐他汀鈣大劑量(80 mg/d)干預14.5個月，結果顯示阿托伐他汀鈣可明顯改善AD模型犬的認知功能，其作用機制與Ato的抗氧化損傷及抗炎性反應作用有關[18]。

綜上所述，本研究通過觀察Ato對Aβ誘導的大鼠原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)細胞及大鼠海馬突觸相關蛋白表達變化的影響，結果證實Ato有助于突觸損傷修復，為他汀類藥物阻止Aβ引起的神經(jīng)毒性，改善AD臨床癥狀提供了一定的實驗證據(jù)。他汀類藥物詳細作用機制值得進一步深入研究，為AD預防和治療提供更多的依據(jù)。

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(本文編輯：時秋寬)

Neuroprotective effect of atorvastatin on amyloid-β protein-induced neurotoxicity in cultured hippocampal neurons

WANGNan,SUIHaijuan,ZHANGLingling,JINYing*,ZHAOBin.

*DepartmentofPharmacology,LiaoningMedicalUniversity,JinzhouLiaoning121001,China

Corresponding author：JIN Ying, Email：jyjinying1130@163.com

Objective To investigate the neuroprotective effect of atorvastatin(Ato) on amyloid-β protein-induced neurotoxicity in cultured hippocampal neurons. Methods Primary cultures were obtained from hippocampi of 0 h to 24 h-old Sprague-Dawley rats. After 10 days in culture, the hippocampi cells were divided into a control group, an Aβ1-42(1.25 μmol/L) group, and a treatment group with different Ato concentrations (0.1, 0.5, 1.0, 2.5 μmol/L). The ATP content of the culture was quantified using CellTiter-GloTMassay. The lactate dehydrogenase released into the culture media was measured using CytoTox-ONETMassay. The changes of SYP, bassoon and PSD-95 proteins were observed by immunofluorescence staining. SYP, bassoon and PSD-95 protein were evaluated using Western blotting. Results Compared with the normal control group, in hippocampal neurons cultured for 10 d by Aβ1-42(1.25 μmol/L) for 48 h, ATP% and LDH% decreased significantly(P<0.01). Adding Ato (0.5, 1.0, 2.5 μmol/L) significantly inhibited Aβ1-42induced ATP% and LDH% decreases (P<0.01). Immunofluorescence and Western results showed that Aβ1-42(1.25 μmol/L) decreased SYP, bassoon and PSD-95 protein expression. Compared with the Aβ1-42group, Ato could significantly inhibit the Aβ1-42induced above effects. Conclusions Ato has a protective effect against the neurotoxicity of amyloid beta protein to cultured hippocampal neuronsinvitro, which may be related to the inhibition of synaptic proteins.

Alzheimer’s disease; atorvastatin; hippocampal neurons; amyloid-β peptide; synapse protein

10.3969/j.issn.1006-2963.2017.03.007

121001遼寧醫(yī)學院藥理學教研室〔王楠(現(xiàn)工作于沈陽市第五人民醫(yī)院)、隋海娟、張玲玲、金英〕；110023沈陽市第五人民醫(yī)院(趙彬)

金英，Email：jyjinying1130@163.com

R742.8+9

A

1006-2963(2017)03-0178-05

2016-06-02)